Методическая статья

Разработка процесса производства и очистки переносчика аденоассоциированного вируса (AAV)2 с использованием системы культивирования клеток бакуловирус-насекомое

DOI:

10.3791/62829

⸱

13 января 2022 г.

 ,  ,  , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine, 3Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе вектор AAV2 продуцируется путем совместного культивирования клеток насекомых Spodoptera frugiperda (Sf9) с бакуловирусом (BV)-AAV2-зеленым флуоресцентным белком (GFP) или терапевтическим геном и инфицированными BV-AAV2-rep-cap клетками Sf9 в культуре суспензии. Частицы AAV высвобождаются из клеток с помощью моющего средства, осветляются, очищаются с помощью аффинной колоночной хроматографии и концентрируются методом тангенциальной фильтрации потока.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аденоассоциированные вирусы (AAV) являются перспективными векторами для применения генной терапии. Здесь вектор AAV2 продуцируется совместной культурой клеток Spodoptera frugiperda (Sf9) с клетками Sf9, инфицированными бакуловирусом (BV)-AAV2-GFP (или терапевтическим геном) и BV-AAV2-rep-cap в культуре суспензии без сыворотки. Клетки культивируются в колбе в орбитальном шейкере или волновом биореакторе. Для высвобождения частиц AAV клетки-продуценты лизируют в буфере, содержащем моющее средство, которое впоследствии осветляется низкоскоростным центрифугированием и фильтрацией. Частицы AAV очищают из лизата клеток с помощью колоночной хроматографии AVB Sepharose, которая связывает частицы AAV. Связанные частицы промывают PBS для удаления загрязняющих веществ и элюируют из смолы с использованием буфера цитрата натрия при рН 3,0. Кислый элюат нейтрализуют щелочным буфером Tris-HCl (pH 8,0), разбавляют фосфат-буферным физиологическим раствором (PBS) и дополнительно концентрируют тангенциальной фильтрацией потока (TFF). Протокол описывает мелкомасштабное доклиническое производство векторов, совместимое с масштабированием до крупномасштабного клинического производства AAV для применения генной терапии человека.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аденоассоциированные вирусы (AAV) представляют собой парвовирусы человека без оболочки, содержащие одноцепочечную ДНК размером 4,6 кб. Векторы AAV имеют ряд преимуществ перед другими вирусными векторами для применения генной терапии1,2,3,4. AAV, естественно, некомпетентны к репликации, поэтому требуются вирус-помощник и хост-механизм для репликации. ААВС не вызывают никаких заболеваний и обладают низкой иммуногенностью у инфицированного хозяина3,5. AAV может инфицировать как покоящиеся, так и активно делящиеся клетки и может сохраняться в виде эписомы без интеграции в геном клеток-хозяев (AAV редко интегрируются в геном хозяина)1,3. Эти особенности сделали AAV желательным инструментом для применения в генной терапии.

Для генерации вектора переноса генов AAV трансгенная кассета, включая терапевтический ген, клонируется между двумя внутренними концевыми повторами (ITR), которые обычно получены из серотипа AAV 2. Максимальный размер от 5' ITR до 3' ITR, включая трансгенную последовательность, составляет 4,6 кб6. Разные капсиды могут иметь разный клеточный или тканевый тропизм. Поэтому капсиды следует выбирать на основе типа ткани или клетки, предназначенной для нацеливания с помощью вектора AAV7.

Рекомбинантные векторы AAV обычно продуцируются в клеточных линиях млекопитающих, таких как эмбриональные клетки почек человека, HEK293 путем транзиторной трансфекции вектора переноса генов AAV, AAV rep-cap и плазмид вируса-хелпера2,3. Тем не менее, существует несколько ограничений для крупномасштабного производства AAV путем переходной трансфекции адгезивных клеток HEK293. Во-первых, необходимо большое количество ячеек или роликовых бутылок. Во-вторых, необходимы высококачественные плазмидные ДНК и трансфекционные реагенты, что увеличивает стоимость изготовления. Наконец, при использовании адгезивных клеток HEK293 сыворотка часто необходима для оптимального производства, что усложняет последующую обработку1,2,3. Альтернативный метод производства AAV включает в себя использование клеточной линии насекомых, клеток Spodoptera frugiperda (Sf9) и вируса насекомых, называемого рекомбинантным Autographa californica multicapsid ядерным полигедрозом (AcMNPV или бакуловирус)8,9,10. Клетки Sf9 выращиваются в культуре суспензии без сыворотки, которая легко масштабируется и совместима с текущей надлежащей производственной практикой (cGMP) производства в больших масштабах, которая не требует плазмидных или трансфекционных реагентов. Более того, стоимость производства AAV с использованием системы Sf9-бакуловируса ниже, чем стоимость использования транзиторной трансфекции плазмид в клетки HEK29311.

Оригинальная система производства rAAV с использованием клеток бакуловируса-Sf9 использовала три бакуловируса: один бакуловирус, содержащий кассету переноса генов, второй бакуловирус, содержащий ген реп, и третий бакуловирус, содержащий серотип-специфический капсидный ген12,13. Тем не менее, структура бакуловируса, содержащая реп, была генетически нестабильной при множественных раундах проходов, что предотвращало усиление бакуловируса для крупномасштабного производства AAV. Чтобы решить эту проблему, была разработана новая векторная система rAAV, которая содержала два бакуловируса (TwoBac): один бакуловирус, содержащий кассету переноса генов AAV, и другой бакуловирус, содержащий гены AAV rep-cap вместе, которые генетически более стабильны, чем исходная система, и более удобны для производства rAAV из-за использования TwoBac вместо трех14, 15г. Система OneBac использует кассету переноса генов AAV и гены rep-cap в одном бакуловирусе, который более удобен для производства rAAV из-за использования одного бакуловируса вместо использования TwoBac или ThreeBac2,16,17. В нашем исследовании для оптимизации использовалась система TwoBac.

Система бакуловируса для производства AAV также имеет ограничения: частицы бакуловируса нестабильны для длительного хранения в безсыворочной среде11,а если титр бакуловируса низкий, необходим большой объем супернатанта бакуловируса, который может стать токсичным для роста клеток Sf9 во время производства AAV (личное наблюдение). Использование клеток сохранения и масштабирования инфицированных клеток без титров (TIPS) или инфицированных бакуловирусом насекомых (BIIC) обеспечивает хороший вариант для производства AAV, в котором клетки Sf9, инфицированные бакуловирусом, подготавливаются, криоконсервируются и впоследствии используются для заражения свежих клеток Sf9. Еще одним преимуществом является повышенная стабильность бакуловируса (БВ) в клетках Sf9 после криоконсервации10,11.

Для обеспечения производства AAV генерируются два типа клеток TIPS: первый путем заражения клеток Sf9 BV-AAV2-GFP или терапевтическим геном, а второй - путем заражения клетки Sf9 BV-AAV2-rep-cap. Клетки TIPS криоконсервируются в небольших и готовых к использованию аликвотах. Векторы AAV получают в культуре суспензии без сыворотки в колбе, помещенной в орбитальный шейкер или волновой биореактор путем совместного культивирования клеток TIPS, которые продуцируют бакуловирусы и свежие клетки Sf9. Клетки Sf9 инфицированы бакуловирусами, которые несут вектор AAV2-GFP и последовательности rep-cap для генерации AAV. Четыре-пять дней спустя, когда выход AAV самый высокий, клетки-продуценты лизируются моющим средством для высвобождения частиц AAV. Клеточный лизат впоследствии осветляют низкоскоростным центрифугированием и фильтрацией. Частицы AAV очищаются из лизата с помощью колоночной хроматографии AVB Sepharose. Наконец, векторы AAV концентрируются с использованием TFF. Протокол описывает производство AAV в небольших масштабах, полезных для исследований и доклинических исследований. Тем не менее, методы являются масштабируемыми и совместимыми с производством клинических векторов AAV для применения генной терапии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

См. рисунок 1 для иллюстрации, обобщающей протокол.

1. Генерация инфицированных бакуловирусом клеток TIPS

  1. Разморозьте один флакон клеток Sf9 и немедленно засейте их в 50 мл культуральной среды клеток насекомых. Выращивают клетки Sf9 в орбитальном шейкерном инкубаторе при 125 об/мин и 28 °C в колбах с круглым дном со слабо прикрепленным колпачком для обмена воздухом8,9. Размножайте клетки в колбе объемом 1 л, содержащей 200 мл среды, чтобы получить достаточное количество клеток для производства клеток TIPS.
  2. Добавьте 50 мл клеток Sf9 при 2 x 106 клетках/мл в двух колбах: заразите одну колбу клеток Sf9 0,5 мл бакуловируса (BV)-AAV2-GFP (или терапевтического гена), а другую колбу клеток 0,5 мл BV-AAV2-rep-cap.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Векторные плазмиды AAV были щедро предоставлены доктором Робертом М. Котином (NIH). Производство бакуловируса из ДНК бакмида (система Bac-to-Bac) было описаноранее 8,9. Стабильность бакуловируса во время прохождения является критической проблемой для масштабирования производства rAAV. Лучше использовать меньшее количество проходов бакуловируса (вплоть до прохода No 4). Определить оптимальный объем супернатанта бакуловируса эмпирически путем проверки эффективности бакуловирусной инфекции с помощью проточной цитометрии(рисунок 2)во время производства клеток TIPS.
  3. Контролировать бакуловирусную инфекцию через 3-4 дня после заражения путем окрашивания бакуловируса gp64 в инфицированные клетки Sf9 следующим образом.
    1. Окрашивать 2 х 105 клеток Sf9 (как неинфицированных, так и бакуловирус-инфицированных клеток) 0,5 мкг мышиного антитела против бакуловируса gp64 (1:200), содержащего флуоресцентный краситель в 100 мкл блокирующего буфера в течение 30 мин при температуре окружающей среды.
    2. Промыть клетки 1 мл PBS для удаления антитела и повторно суспендировать окрашенные клетки в 300 мкл PBS, содержащего 0,5% бычьего сывороточного альбумина.
    3. Анализ экспрессии бакуловируса gp64 на клетках с помощью проточной цитометрии(рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите стратегию сбора и анализа проточной цитометрии эмпирически. В общей сложности приобретается 10 000 одиночных живых клеток. Экспрессия бакуловируса gp64 на клеточных поверхностях Sf9 указывает на бакуловирусную инфекцию. Через 3-4 дня большинство клеток Sf9 заражаются бакуловирусом, о чем свидетельствует экспрессия бакуловируса gp64(рисунок 2).
  4. Когда клетки становятся жизнеспособными на 80%-90% с увеличениемдиаметра (фиг.3),собирают клетки и криоконсервируют 1 х 107 клеток в 1 мл питательной среды насекомых, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и 10% диметилсульфоксидом в медленно замерзающем контейнере при -80 °C. На следующий день переложите трубку, содержащую ячейки TIPS, в морозильную камеру с жидким азотом для длительного хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите культивирование клеток в шкафу биобезопасности в соответствии со стандартным асептическим лабораторным методом на уровне биобезопасности 2 (BSL-2).

2. Производство вектора AAV

  1. День 1: Совместная культивирование клеток Sf9 с инфицированными бакуловирусом клетками TIPS
    1. Культивируйте и выращивайте наивные клетки Sf9 при 1х 10 6 клетках/мл при 28 °C в нескольких колбах по 2 л, содержащих 400 мл питательной среды для клеток насекомых, в шейкерном инкубаторе, который необходим для производства AAV. Через 3-4 дня плотность клеток увеличивают до 5 х 106-6 х 106 клеток/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: CO2 и влажность не являются важными факторами для роста клеток Sf9.
    2. Засевайте клетки Sf9 либо в колбы для коктейлей, либо в биореактор следующим образом.
      1. Производство AAV в колбах в орбитальном шейкерном инкубаторе: Используйте пипетку или перистальтический насос для асептического семенного материала 400 мл культуры Sf9 при 2x 10 6 клетках/мл в колбу объемом 2 л. Установите орбитальный шейкер при 125 об/мин и 28 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ Используйте перистальтический насос или стандартную пипетку в зависимости от масштаба производства AAV.
      2. Производство AAV в биореакторе: Используйте перистальтический насос для посева 1 л культуры Sf9 при 2 х 106 клетках / мл в мешок биореактора объемом 10 л. Загрузите мешок на установку биореактора для культивирования при температуре 28 °C. Добавьте 40% кислорода в мешок биореактора при 0,1 фунта на кв. дюйм. Установите блок биореактора под углом 20° и встряхните мешок при 25 оборотах в минуту.
    3. Разморозьте один флакон каждой клетки BV-AAV2-GFP (или терапевтического гена) и BV-AAV2-rep-cap TIPS. Разбавьте клетки 20 мл питательной среды насекомых и проведите подсчет жизнеспособности клеток с помощью трипан-синего цвета. Инокулируют обе клетки TIPS в соотношении 1:10 000 относительно наивных клеток Sf9, культивируемых в шейкерной колбе или биореакторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выживаемость клеток TIPS снижается из-за криоконсервации, а скорость восстановления составляет примерно 50%, когда жизнеспособность клеток определяется с помощью окрашивания трипана синим цветом. Проведите пилотный эксперимент, чтобы эмпирически определить соотношение клеток TIPS и наивных клеток Sf9 перед крупномасштабным производством rAAV.
  2. День 2: Мониторинг культуры
    1. Собирают 1 мл культуры Sf9 асептически. Окрашивание синим красителем Трипан для анализа количества клеток, жизнеспособности и морфологии.
  3. День 3: Мониторинг культуры и кормление
    1. Соберите 1 мл культуры Sf9 и проанализируйте количество клеток, жизнеспособность и морфологию. Проверьте состояние бакуловирусной инфекции после окрашивания клеток Sf9, как указано в шаге 1.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение диаметра клеток и цитопатический эффект являются признаками бакуловирусной инфекции. Увеличение диаметра предшествует снижению жизнеспособности клеток, и эти параметры используются для определения времени сбора клеток во время производства AAV. Определите оптимальную точку времени эмпирически.
    2. Подкармливайте культуру Sf9 свежей питательной средой насекомых в соотношении 1:5 в асептически.
  4. День 4: Мониторинг культуры
    1. Соберите 1 мл культуры Sf9 и проанализируйте количество клеток, жизнеспособность и морфологию. Отключите подачу кислорода из мешка биореактора.
  5. День 5: Мониторинг культуры и сбор урожая
    1. Соберите 1 мл культуры Sf9 и проанализируйте количество клеток, жизнеспособность и морфологию. Соберите культуральную среду и клетки, когда жизнеспособность клеток Sf9 снизилась примерно до 50%(рисунок 4).
    2. Открутите клеточную суспензию при 2100 х г в течение 15 мин при 4 °C. Соберите супернатант и ячейку гранулы и храните их при -80 °C.

3. Лизис клеток и высвобождение AAV

  1. Разморозьте гранулы ячейки-производителя AAV. Добавьте 100 мл буфера лизиса клеток (20 мМ Tris-HCl pH 8,0, 150 мМ хлорида натрия, 0,5 % Triton-X-100) в гранулу клетки, энергично перемешайте и инкубируйте в течение 30 мин при температуре окружающей среды для высвобождения частиц AAV.
  2. Центрифуга при 2100 × г в течение 30 мин при 4 °С и переносят лизат ячейки в новый контейнер. Смешайте лизат клеток и супернатант клеточной культуры после размораживания.
  3. Добавьте 20 Ед/мл нуклеазы и 10мМ MgCl2 в клеточный лизат для переваривания ДНК и РНК. Инкубировать в течение 2-4 ч при 37 °С.
  4. Фильтруйте лизат через систему двойной фильтрации 0,8 мкм и 0,2 мкмполиэтерсульфона с помощью насоса.
  5. Храните осветленный клеточный лизат при 4 °C в течение ночи или немедленно очистите AAV.

4. Очистка вектора AAV с помощью системы аффинной колоночной хроматографии

  1. Подготовьте хроматографический прибор путем последовательного промывания образца и буферных линий стерильной водой, 1 Н гидроксида натрия, водой и фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS, pH 7,4) со скоростью потока 50 мл/мин.
  2. Установите колонну AVB Sepharose (10,0 мл) в систему хроматографии и запустите 100 мл PBS со скоростью потока 5 мл / мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте меньший или больший объем колонны AVB Sepharose в зависимости от масштаба производства AAV и установите скорость потока, предложенную производителем колонны или смолы (см. Таблицу материалов).
  3. Для сбора фракций столбчатого сквозного раствора, промывочного буфера и элюционного буфера, содержащего частицы AAV, вставьте трубки в щели фракционного коллектора прибора хроматографии.
  4. Уравновешивайте колонну с PBS со скоростью потока 5,0 мл/мин.
  5. Загрузите фильтрованный клеточный лизат, содержащий частицы AAV, на колонну с помощью хроматографической машины, оснащенной насосом для образцов. Запустите образец со скоростью потока 3,0 мл в минуту.
  6. Запускайте PBS через столбец AVB Sepharose со скоростью потока 3,0 мл/мин до тех пор, пока кривая поглощения ультрафиолета (УФ) (280 нм) не вернется к исходному уровню и не станет стабильной.
  7. Элюируют частицы AAV из колонны буфером 50 мМ цитрата натрия (рН 3,0) со скоростью потока 3,0 мл/мин(рисунок 5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как частицы AAV диссоциируют от смолы и проходят через УФ-детектор, пик элюирования белка можно увидеть на хроматограмме.
  8. Немедленно разбавить супернатант AAV с одной пятой объема 500 мМ Tris-HCl (pH 8,0), чтобы увеличить pH AAV-содержащего супернатанта примерно до pH 5,5 для предотвращения pH-опосредованной деградации с помощью кислотного буфера элюирования. Кроме того, разбавьте супернатант AAV в 10 раз PBS, чтобы полностью нейтрализовать pH.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значение pH составляет приблизительно 5,5 после нейтрализации раствора rAAV. После нейтрализации AAV разбавляют раствор rAAV в 10 раз PBS (pH 7,4) так, чтобы AAV находился в физиологическом буфере.
  9. Храните 1 мл каждой колонны проходимых образцов, промывочный буфер и 100 мкл элюированного супернатанта AAV для оценки присутствия AAV путем инфицирования клеток-мишеней.
  10. Очистите колонну AVB Sepharose со 100 мл лимонной кислоты 100 мМ (рН 2,1) и 100 мл PBS (рН7,4) со скоростью потока 5,0 мл/мин. Промыть колонну 20% этанолом со скоростью потока 5,0 мл/мин и хранить при 4 °C.
  11. Очистите трубопроводы хроматографического прибора с помощью автономного положения колонки, как описано в разделе 4.1. Наконец, промыть систему хроматографии 200 мл 20% этанола со скоростью потока 50,0 мл /мин и хранить в 20% этаноле.

5. Концентрация и диафильтрация вектора AAV с помощью тангенциальной фильтрации потока (TFF)

  1. Настройте систему TFF, оснащенную полисульфоновой мембранным картриджем (100 кДа Molecular Weight Cut Off) для концентрирования AAV.
  2. Уравновешивайте модуль TFF с 200 мл PBS в течение 10 мин.
  3. Загрузите образец AAV, контролируя поток насоса до тех пор, пока образец не уменьшится до желаемого объема, сохраняя при этом трансмембранное давление на уровне 2-3 фунтов на квадратный дюйм.
  4. Диафильтрат ретентата со 100 мл PBS, как используется в этом исследовании, или эмпирически определить альтернативный буфер, который поддерживает долгосрочную стабильность AAV.
  5. После концентрации образца AAV до нужного объема, соберите образец AAV, отфильтруйте его через полиэфирсульфонфильтр 0,2 мкм, аликвоту, а затем храните его при -80 °C.

6. Инфицирование образцов AAV в клетки-мишени для оценки присутствия AAV на этапах очистки

  1. Инокулируйте 7 x 104 HT1080 клеток / лунку в 24-луночную пластину в 500 мкл модифицированной среды орла Dulbecco (DMEM), дополненной 1% L-глутамином, 1% пируватом натрия и 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) за день до заражения. Культивируйте клетки в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
  2. Подсчитайте клетки до заражения. Добавьте разбавленный неочищенный объемный образец AAV перед прогоном колонны, пробами через колонну, буфером промывки и элюированным очищенным образцом AAV.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитайте клетки, окрашенные в синий цвет Трипана, с помощью гемоцитометра. Определите коэффициент разрежения и объем (мкл) образцов AAV эмпирически. Чем выше титры AAV, тем большее разбавление необходимо. Убедитесь, что частицы бакуловируса неочищенного объемного образца перед прогоном колонны, прогоном колонны образцами, промывочным буфером инактивируются теплом при 50 °C в течение 50 мин перед заражением клеток-мишеней для определения инфекционных титров AAV.
  3. Через два дня после заражения проанализируйте экспрессию белка (например, GFP или терапевтического гена) в клетках с помощью проточного цитометра.
  4. Рассчитайте инфекционные титры AAV, используя количество клеток на момент заражения, коэффициент разбавления и процент клеток GFP+ по формуле: (Общее количество клеток x Процентное содержание GFP+ клеток x Коэффициент разбавления) / Объем AAV в миллилитрах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, количество ячеек составляет 1 х 105,процент клеток GFP+ составляет 3,4%, коэффициент разбавления составляет 100, а объем добавленного AAV составляет 2 мкл. Титр ААВ составляет 1,7 х 108 инфекционных единиц (МЕ)/мл. Общее количество очищенных частиц AAV в 25 мл элюированной фракции составляет 4,3 х 109 инфекционных единиц (МЕ)/мл(рис. 6). Общее количество исходных неочищенных частиц AAV составляет 1,09 x 1010 МЕ/мл, а очищенных частиц AAV - 4,3 x 109 МЕ/мл. Таким образом, процент восстановления составляет 39,4%. Процент клеток GFP+ должен составлять от 1% до 30%, что соответствует линейному диапазону при использовании для расчета инфекционного титра AAV. Если в клетки-мишени заражаются более концентрированные векторные частицы AAV; существует вероятность того, что несколько копий частиц AAV могут заразить одну клетку, которая будет отображаться как одна копия вектора. Поэтому разбавляют супернатант вектора AAV для получения 1%-30% векторной инфекции в клетках-мишенях. Если вектор AAV не имеет репортерного гена, окрасьте трансген или терапевтический ген, экспрессируемый вектором AAV, антителом, содержащим флуоресцентный краситель, который можно обнаружить и количественно определить с помощью проточного цитометра. Не все серотипы AAV могут эффективно инфицировать клетки HT1080. Поэтому для выполнения анализа инфекционности для других серотипов AAV используют разные клеточные линии. Титруйте частицы AAV2-GFP до очистки и после очистки на клетках HT1080 и измеряйте экспрессию GFP с помощью проточной цитометрии. Рассчитайте восстановление (%) по соотношению количества очищенных частиц AAV и количества частиц AAV до очистки, умноженного на 100.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь показаны репрезентативные результаты разработки процесса производства и очистки переносчиков AAV с использованием клеточной системы насекомых Sf9. Способ включает кокультуру клеток Sf9 с бакуловирус-инфицированными клетками TIPS, кормление клеток питательной средой, сбор и лизис клеток-продуцентов для высвобождения частиц AAV, осветление лизата клеток с помощью нуклеазной обработки, центрифугирование и фильтрацию, очистку AAV с использованием AVB Sepharose аффинной хроматографии и концентрацию с TFF

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Параметры, используемые в этом протоколе для разработки процесса производства, очистки и концентрации векторов AAV, могут быть применены как к мелкому, так и к крупномасштабному производству векторов AAV для применения в генной терапии. Весь процесс добычи и переработки может быть выполнен в закрытой системе, совместимой с текущей надлежащей производственной практикой (cGMP). Основными преимуществами системы Sf9-бакуловируса являются масштабируемость для крупномасштабного производства AAV GMP-класса по доступной цене. Си...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить доктора Роберта М. Котина (Национальный институт сердца, крови и легких, NIH) за щедрое предоставление нам плазмид AAV и Даниэль Стил и Ребекки Эрнст (Детская больница Цинциннати) за их техническую помощь. Эта работа поддерживается фондом Start-Up от Cincinnati Children's Research Foundation до M.N.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 Н натрия гидроксидSigma-Aldrich1.09137Для очистки Akta Avant
л колбыThermoFisher Scientific431281Колба для суспензионной культуры
50 мл Коническая пробиркаThermoFisher Scientific14-959-49AДля сбора надосадочной
жидкости 24-луночный планшетThermoFisher Scientific07-200-80Адгезивная клеточная культура планшет
Колбы 250 млThermoFisher Scientific238071Колба для суспензионной культуры
Akta Avant 150 с программным обеспечениемUnicorn Cytiva28976337Система хроматографии
AVB Sepharose High PerformanceCytiva28411210Хроматографическая среда
Baculovirus-AAV-2 GFPIn-housenon-catalogAAV transfer vector
Baculovirus-AAV-2 rep-capСобственныйнекаталогУпаковочный вектор AAV
НуклеазаSigma-AldrichE1014Фермент для разрушения ДНК и РНК
Блокирующий буферSanta Cruz Biotechnologies516214Блокирование для предотвращения связывания неспецифических антител с клетками
Буфер для лизиса клетокСобственныйнекаталожный товар20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 0,5 % титрон X-100
Cellbag, 2 л и 10 лCytiva28937662Биореактор Мешок
для очистки Буфер для очисткиНекаталог100 мМ Лимонная кислота (pH 2.1)
КриовиальныйThomas Scientific1222C24Для криоконсервации
DMEMSigma-AldrichD6429Питательная среда для клеточных линий
Буфер для элюированияIn-houseNon-Catalog Item50 mM Буфер цитрата натрия (pH 3.0)
ЭтанолSigma-AldrichE7073Для дезинфекции и хранения хроматографии
Фильтрационная установка Pall Corporation12941Мембранный фильтр
HT1080 клеточной линииATCCCCL-121Фибробласт клеточной линии
HyClone™ SFX-Среда для культивирования насекомыхCytivaSH30278.02Бессывороточная среда для роста клеток насекомых
Перистальтический насосPall CorporationНе каталогНасос TFF
MaxQ 8000 орбитальный шейкер инкубатор ThermoFisher ScientificНе каталог Шейкердля суспензионной культуры
МикроскопNikonНе каталог Мониторинги подсчет клеток 
Мышиный антибакуловирус gp64 PE антителоSanta Cruz Biotechnologies65498 PEМониторинг бакуловирусной инфекции в клетках Sf9
Кислородный баллонPraxairНекаталожный товар40 % Поступление кислорода необходимо для роста клеток Sf9
PBSThermoFisher Scientific20012027Wash Buffer
Набор для окрашивания серебраThermoFisher ScientificLC6100Staining AAV капсидные белки
Sf9 клеткиThermoFisher Scientific11496-015Клетки насекомых
Steile waterIn-houseNot-catalog itemДля очистки Akta Avant
Настольная центрифугаThermoFisher Scientific75253839/433607Для уточнения надосадочной жидкости Baculovirus
Tangential Flow Filtration (TFF) картриджPall CorporationOA100C12Картридж TFF для концентрирования AAV
Tris-HCl, pH 8.0ThermoFisher15568025щелочного буфера для нейтрализации элюированного биореактора AAV
WAVE Биореактор 20/50Cytiva28-9378-00
2

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
  2. Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
  3. Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
  4. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  5. Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 122 (1), 23-36 (2013).
  6. Grieger, J. C., Samulski, R. J. Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps. Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).
  7. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).
  8. Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 16071(2016).
  9. Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019(2018).
  10. Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System. Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).
  11. Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures. Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).
  12. Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors. Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).
  13. Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).
  14. Chen, H. Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells. Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).
  15. Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. Chromatography-based purification of adeno-associated virus. Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).
  16. Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).
  17. Wu, Y., et al. Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes. Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).
  18. Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).
  19. Joshi, P. R. H., et al. Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 341-356 (2021).
  20. Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography. Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015(2021).
  21. Wright, J. F. Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies. Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).
  22. Tomono, T., et al. highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 180-190 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

AAV ProductionBaculovirus Insect SystemSf9 CellsAAV PurificationAVB Sepharose ChromatographyTangential Flow FiltrationCell Lysis BufferFlow CytometryGene Therapy VectorSuspension Cell Culture

Похожие статьи