Построение модельных липидных мембран, включающих рецепторы, связанные с G-белком (GPCR)

Синтетические модельные мембраны являются мощным инструментом в исследовании фундаментальных свойств и функций биомембран. Гигантские одногламеллярные везикулы (ГУВ) являются одной из наиболее заметных платформ для изучения различных свойств плазматической мембраны и могут быть спроектированы для имитации различных физиологических условий1,2,3,4,5,6,7,8. Хорошо известно, что плазматическая мембрана и ее организация играют ключевую роль во множестве клеточных процессов, таких как сигнальная трансдукция, адгезия, эндоцитоз и транспорт9,10,11,12,13,14,15.

ГУВ были изготовлены с использованием различных методов, включая щадящую ^{гидратацию16}, набухание гидрогеля17, электроформацию18, микрофлюидные методы19,20,21,22, струйную ^{обработку23} и обмен растворителями24,25,26. Из-за проблем в обращении с интегральными мембранными белками (IMP) платформы in vitro для их изучения были ограничены. GUV представляют собой упрощенную платформу для изучения IMP в среде, имитирующей их родную среду. Хотя существует несколько подходов к восстановлению белка в ГУВ, проблемы возникают из-за включения белков с правильной ориентацией и поддержания функциональности ^белка27.

Наиболее успешное восстановление белка в ГУВ требует метода обмена моющих средств; которая включает в себя солюбилизацию белков из их родной среды моющими средствами с последующей очисткой белка, а затем замену молекул моющего средства липидами с помощью различных ^{методов28}. В то время как моющие средства служат для стабилизации третичной структуры ИМП во время очистки, моющие мицеллы являются относительно неестественной средой для этих белков, которые лучше стабилизируются, особенно для функциональных исследований, в липидных бислоях28,29,30. Кроме того, включение функциональных трансмембранных белков в липидный бислой с использованием традиционных методов изготовления GUV было затруднено из-за размера, деликатности этих белков и дополнительных этапов обмена моющих средств, которые потребовались бы27,31,32,33. Использование органического растворителя для удаления моющих средств вызывает агрегацию и денатурацию ^белка34. Улучшенный метод, опосредованный моющим средством, был многообещающим, однако для этапа удаления моющего средства необходима осторожность, и оптимизация может потребоваться для конкретных ^{белков31,35}. Кроме того, способы, использующие электроформацию, могут ограничивать выбор белка и могут не подходить для всех липидных композиций, особенно заряженных липидов31,36,37. Другим методом, который был использован, является пептид-индуцированное слияние больших одноцветных везикул (LUV), содержащих желаемый белок, с ГУВ, хотя было обнаружено, что оно трудоемко и может привести к вставке чужеродных молекул - фузогенных пептидов33,38,39. Гигантские везикулы плазматической мембраны (GPMV), которые получены из живых клеток, могут быть использованы для преодоления некоторых из этих проблем, однако они позволяют минимально контролировать полученный липидный и белковый состав14,40,41. Таким образом, интеграция ИМП в билипидный слой ГУВ с использованием нашего модифицированного метода набухания агарозы представляет собой надежный метод дальнейшего изучения этих белков в мембранной среде42,43,44,45.

Клеточная сигнализация и связь включает в себя семейство белков, известных как рецепторы, связанные с G-белком (GPCR); GPCR являются одним из крупнейших семейств белков и связаны с модуляцией настроения, аппетита, артериального давления, сердечно-сосудистой функции, дыхания и сна среди многих других физиологических ^{функций46}. В этом исследовании мы использовали рецептор серотонина 1А человека (_5-HT1AR), который является прототипом семейства GPCR. _5-HT1AR может быть обнаружен в центральной нервной системе (ЦНС) и кровеносных сосудах; он влияет на многочисленные функции, такие как сердечно-сосудистая, желудочно-кишечная, эндокринная функции, а также участвует в регуляции ^{настроения47}. Большой барьер для исследований GPCR возникает из-за их сложной амфифильной структуры, и ГУВ представляют собой многообещающую платформу для исследования различных интересующих свойств, начиная от функциональности белка, липидно-белковых взаимодействий и белково-белковых взаимодействий. Для изучения липидно-белковых взаимодействий были использованы различные подходы, такие как поверхностный плазмонный резонанс (SPR)^48,49, спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР)^50,51, анализ наложения липидов на белок (PLO) ^51,52,53,54, нативная масс-спектрометрия55, изотермическая титрационная калориметрия (ITC)^56,57 и липосома осадочный ^{анализ58,59}. Наша лаборатория использовала упрощенный подход GUV для исследования влияния липидно-белковых взаимодействий на функциональность белка путем инкапсуляции BODIPY-GTPγS, которая связывается с субъединицей _Giα в активном состоянии рецептора. Их связывание разглаживает флуорофор, производя флуоресцентный сигнал, который может быть обнаружен с течением ^{времени45}. Кроме того, в различных исследованиях изучались липидно-белковые взаимодействия и роль белков в обнаружении или стабилизации кривизны ^{мембраны60,61}, и использование осуществимого подхода GUV может быть ключевым преимуществом.

Этот протокол демонстрирует простой метод включения GPCR в мембрану ГУВ с использованием модифицированной системы гидрогеля ^{агарозы17,42}. Кроме того, основываясь на нашей предыдущей работе, наш метод может быть подходящим для IMP, которые могут выдерживать кратковременное воздействие 30-40 ° C. Вкратце, мы распространили тонкую пленку агарозы в сочетании с фрагментами мембраны, содержащими интересующий GPCR. После гелеобразования этого слоя мы наносим раствор липидов поверх агарозы и позволяем растворителю испариться. Затем регидратацию системы выполняли с помощью водного буфера, в результате чего образовывались ГУВ с белком, включенным в липидный бислой.

1. Маркировка белка

1. Позволяет NHS-родамину, фрагментам мембраны _5-HT1A и одной спиновой обессоливающей колонне MWCO 7 К уравновешиваться при комнатной температуре.
2. Растворить 1 мг NHS-родамина в 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО).
3. Добавьте 5 мкл 1 М раствора бикарбоната натрия для повышения рН раствора _5-HT1AR до рН 8.
4. Добавьте 3,66 мкл раствора NHS-родамина к 50 мкл _{раствора 5-HT1AR} и пипетку осторожно вверх и вниз в микроцентрифужной пробирке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что у вас по крайней мере 10-кратный молярный избыток NHS-родамина.
5. Держите смесь защищенной от света и поставьте на ротатор при комнатной температуре в течение 1 ч.
6. Промывайте отжимную колонну MWCO 7 к с 200 мкл 1x фосфатного буферного физиологического раствора (1x PBS) три раза в течение 1,5 мин при 1,5 RCF для каждой промывки.
7. Добавьте меченый белок в один столбец и сбалансируйте его количество в другой микроцентрифужной трубке.
8. Раскрутите меченый белок один раз в течение 5 мин при 1,5 RCF.
9. Возьмите спектр UV-vis с помощью нанокапрульного спектрофотометра при 280 нм и 554 нм и рассчитайте эффективность маркировки в соответствии с руководством производителя.
10. Хранить меченый белок при температуре 5 °C до дальнейшего использования. Раствор стабилен в течение примерно недели после маркировки.

2. ГУВ с мембранным включением 5-HT _1A

1. Подготовка материалов и реагентов
   1. Позвольте белку, липидам и BSA (сывороточному альбумину крупного рогатого скота) уравновеситься до комнатной температуры.
   2. В течение этого времени очистите крышки, поместив их в метанол и обрабатывая ультразвуком в течение 30 мин при 40 °C. Убедитесь, что метанол полностью покрывает крышки, а уровень воды на водяной бане выше уровня метанола в контейнере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Метанол токсичен и должен обрабатываться в соответствующей химической вытяжке.
   3. Высушите избыток метанола на крышках легким потоком воздуха. Поместите крышку в духовку с температурой 40 °C на 15 минут, чтобы убедиться, что лишние крышки высохнут.
   4. Начните процесс плазменной очистки. Во-первых, поместите крышки в плазмоочиститель и закройте воздухозаборный клапан, чтобы откачать весь воздух внутри камеры.
   5. Как только камера окажется под вакуумом, очистите крышки в течение 5 минут, используя высокую радиочастотную настройку мощности и почти полный вакуум, с небольшим забором воздуха в вакуумную камеру. Чтобы обеспечить надлежащий уровень плазмы, отрегулируйте открытие вакуумной камеры таким образом, чтобы результирующий цвет плазмы был устойчивым, ярко-розовым.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании воздуха крайне важно, чтобы плазма оставалась ярко-розового цвета в течение всего этапа плазменной обработки, так как более темный фиолетовый цвет указывает на то, что в камере есть неправильное количество воздуха и приведет к неоптимальной обработке плазмой.
   6. По прошествии 5 минут отключите радиочастотное питание и отпустите вакуум.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После извлечения из плазменной камеры, пожалуйста, убедитесь, что крышки остаются закрытыми.
2. Гидрогельный препарат
   1. Смешайте 6 мг агарозы со сверхнизкой температурой плавления с 300 мкл сверхчистой воды (т.е. 2% (мас./об.) агарозы).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 2% агарозы будет использоваться для создания безбелковых ГУВ. Раствор агарозы можно хранить при 45 °C в течение двух дней.
   2. Соединить 9 мг агарозы сверхнизкой температуры с 300 мкл сверхчистой воды для 3 мас./об.% агарозы, приготовленной на стадии 3.1. 3% агарозы будет использоваться для создания белковых инкорпорированных ГУВ.
   3. Вихрьте раствор ненадолго, прежде чем поместить их на тепловой блок 90 °C в течение 10 мин. Затем снова вихрьте трубку, прежде чем перенести ее в тепловой блок с температурой 45 °C, чтобы сохранить ее в расплавленном виде до дальнейшего использования.
3. Смешивание агарозы и белка
   1. Смешайте 21 мкл 3% агарозы с 7 мкл фрагментов мембраны _5-HT1AR. Пипетка вверх и вниз медленно много раз, чтобы обеспечить адекватное смешивание. Затем инкубируют при 45 °C в течение 1 мин.
4. Осаждение гидрогелей и липидов
   1. Для безбелковых ГУВ: Сделайте тонкую пленку на свежеочищенных плазменной крышке, используя 20 мкл 2% агарозы. Быстро опустите еще одну крышку поверх капли агарозы и осторожно раздвиньте крышки, чтобы сделать тонкую пленку на обоих крышках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг сложен тем, что скольжение капли должно происходить, пока агароза все еще находится в расплавленной форме.
   2. Для белковых инкорпорированных ГУВ: Пипетка смесь белка/агарозы вверх и вниз еще раз, а затем кладет 20 мкл 2% агарозы на очищенный плазмой покров. Следуйте инструкциям по проскальзыванию, как описано выше.
   3. Дайте агарозе защитить гель от света в течение 30 мин при комнатной температуре.
   4. Нанесите липиды по каплям поверх слоя агарозы. Используйте в общей сложности 10 мкл 2 мг/мл 1-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфохолина (POPC) с 0,4 мол% 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DPPE), меченый ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (или интересующей липидной смесью) в хлороформе поверх агароновой пленки. Нанесите капли с помощью газовой хроматографической иглы и распределите по одной капле за раз через мягкий воздушный поток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе необходимо соблюдать осторожность, чтобы сделать относительно однородный слой липидов поверх гидрогеля. Кроме того, хлороформ токсичен и должен обрабатываться в соответствующей химической вытяжке.
   5. Соберите камеры Сайкса-Мура (S-M), поместив уплотнительное кольцо поверх крышки, а затем поместив верхний компонент камеры поверх уплотнительного кольца. Используйте ключ, предоставленный производителем, для сборки камеры путем привинчивания компонентов камеры вместе, чтобы герметизировать камеру и предотвратить любую утечку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Верхняя часть камеры должна быть затянута на уплотнительном кольце, но необходимо соблюдать осторожность, чтобы убедиться, что крышка остается неповрежденной, так как крышка может треснуть, если уплотнительное кольцо не находится должным образом в камере. Кроме того, убедитесь, что камера достаточно плотно закрыта, чтобы камера не протекала при добавлении набухающего раствора. Неспособность достаточно затянуть камеру приведет к утечкам и потере образца.
5. Набухание и сбор пузырьков
   1. Увлажняйте всю систему, осторожно пипетируя 450 мкл сахарозы 200 мМ в 1x PBS и осторожно постукивая по камерам, чтобы обеспечить адекватное буферное покрытие гидрогелево-липидных слоев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор сахарозы может быть заменен регидратационным буфером, содержащим интересующие биологические зонды.
   2. Поместите камеры при температуре 45 °C и накройте верхнюю часть камеры крышкой, чтобы предотвратить испарение. Дайте образцу набухнуть, защищенным от мусора и света в течение 1 ч.
   3. Добавьте 100 мкл 1 мг/мл BSA в сверхчистой воде в каждую лунку пластины из 96 скважин, предназначенной для использования. Инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч.
   4. Промыть три раза сверхчистой водой и один раз 200 мМ сахарозы в 1x PBS.
   5. Наконец, добавьте 200 мМ глюкозы в 1x PBS до добавления раствора образца GUV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: BSA использовался для блокирования адсорбции GUV.
   6. После того, как гидрогель набухнет, осторожно встряхните и постучите по камере, чтобы выбить любые ГУВ, которые могут оставаться прикрепленными к поверхности гидрогеля. Затем аккуратно добавьте раствор ГУВ-сахарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве дополнительного шага для обеспечения того, чтобы все везикулы были отделены от поверхности, осторожно выложите часть суспензии сахарозы обратно на поверхность гидрогеля.
   7. Переместите суспензию в заранее подготовленную микроцентрифужную трубку, содержащую 700 мкл глюкозы 200 мМ в 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Градиент плотности приведет к оседанию везикул на дне трубки центрифуги.
   8. Дайте везикулам осесть еще на час, чтобы убедиться, что везикулы могут опуститься на дно трубки микроцентрифуги, что позволит оптимально собрать.
   9. После оседания ГУВ в глюкозе переносят 300 мкл со дна трубки центрифуги (осевшие везикулы) в предварительно подготовленную и обработанную BSA 96-луночную пластину для исследования везикул под конфокальным микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно избегайте самого дна микроцентрифужной трубки, чтобы свести к минимуму количество мусора, собранного в конечном образце.
6. Проверьте образцы под микроскопом.
   1. Покажите на образец лазером 488 нм (что позволяет нам визуализировать мембрану, так как бислой был помечен ATTO-488-DPPE).
   2. Покажите на образец лазером 561 нм (что позволяет нам визуализировать белок, поскольку он был помечен NHS-Rhodamine).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо соблюдать осторожность при визуализации образца, поскольку фотоокисление может дестабилизировать везикулы. Везикулы наблюдались в тот же день.

Рисунок 1: Иллюстрация подробных шагов протокола. Создано с помощью BioRender.com Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Измеряли концентрацию белка, а степень маркировки рассчитывали как молярное соотношение между красителем и белком 1:1. Изучив ГУВ с помощью конфокальной микроскопии, мы смогли подтвердить успешное образование и белковую интеграцию везикул. Липиды были помечены 0,4 моль% ATTO 488-DPPE, а белок был ковалентно помечен через модификацию эфира родамина NHS первичных аминов. На фиг.2а и фиг.2b показаны белково-инкорпорированные везикулы в каналах ATTO 488 и родамина соответственно. Все микроснимки были скорректированы темным током и плоским полем. На рисунке 2c и рисунке 2d показан отрицательный контроль GUV без включения белка. На рисунках 3a и 3b показан белок, интегрированный в ГУВ с профилями интенсивности линий, заданными пунктирной белой линией одного и того же пузырька в обоих каналах. Профиль интенсивности линии показывает двумерный график интенсивности пикселей вдоль белой нарисованной линии внутри изображения. Ось X — это расстояние вдоль линии, а ось Y — это интенсивность пикселей. Программное обеспечение ImageJ использовалось для построения профиля интенсивности указанной линии.

Рисунок 2: Микрофотографии, сравнивающие белковые инкорпорированные ГУВ и ГУВ без белка (контроль). Микроснимки (a) и (b) показывают флуоресценцию белка GUV с соответствующими каналами ATTO 488 и родамина соответственно. Микроснимки (c) и (d) показывают белок, опущенный GUV при возбуждении каналами ATTO 488 и родамина соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: В верхней строке показаны микроснимки белковых инкорпорированных ГУВ в каналах ATTO 488 (a) и родамин (b). Профили интенсивности линий для указанных линий с белым пунктиром приведены ниже. Анализ проводился с помощью программного обеспечения ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.