Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ нуклеозидтрифосфатгидролаз в Toxoplasm gondii и Neospora caninum для высокопроизводительного скрининга с использованием робота-манипулятора

816 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62874

⸱

22 июля 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Education and Research Center for Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, Osaka Medical and Pharmaceutical University, 2Independent Scholar, Tokyo, Japan, 3Division of Functional Genomics and Therapeutic Innovation, Research Center for Advanced Genomics, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University, 4School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Sciences, School of Materials and Engineering, Wuhan University of Technology, 5Data Science Center, Jichi Medical University, 6Department of Cardiovascular Medicine, The Cardiovascular Institute, 7Department of Immunology and Parasitology, University of Occupational and Environmental Health, 8Division of Cardiology and Metabolism, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 9Department of Cardiovascular Medicine, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Инфекции, вызванные Toxoplasma gondii и Neospora caninum , обнаруживаются у людей и животных и приводят к серьезным проблемам со здоровьем. Эти два паразита имеют сходные нуклеозидтрифосфатгидролазы и играют важную роль в размножении и выживании. Мы разработали высококачественный анализ ферментов, требующих использования роботизированной руки.

Аннотация

Простейшие паразиты заражают людей и многих теплокровных животных. Toxoplasma gondii, основной простейший паразит, обычно обнаруживается у ВИЧ-положительных пациентов, реципиентов трансплантированных органов и беременных женщин, что приводит к тяжелому состоянию здоровья – токсоплазмозу. Другой основной простейший, Neospora caninum, который имеет много общего с Toxoplasma gondii, вызывает серьезные заболевания у животных, как и энцефаломиелит и миозит-полирадикулит у собак и коров, что приводит к мертворождению телят. Все они демонстрировали сходные нуклеозидтрифосфатгидролазы (NTPase). Neospora caninum имеет NcNTPase, в то время как Toxoplasma gondii имеет TgNTPase-I. Считается, что ферменты играют решающую роль в размножении и выживании. Чтобы создать соединения и/или экстракты, предотвращающие инфекцию простейших, мы нацелились на эти ферменты для разработки лекарств. Следующим шагом было создание нового, высокочувствительного и высокоточного анализа путем объединения обычного биохимического ферментного анализа с флуоресцентным анализом для определения содержания АДФ. Мы также подтвердили, что новый анализ удовлетворяет критериям для проведения высокопроизводительного скрининга (HTS) в двух протозойных ферментах. Мы провели HTS, идентифицировали 19 соединений и шесть экстрактов из двух библиотек синтетических соединений и библиотеку экстрактов, полученных из морских бактерий соответственно. В данном исследовании было введено подробное разъяснение о том, как проводить ВТСП, включая информацию о приготовлении реагентов, устройствах, роботизированной руке и т.д.

Введение

Робототехника была создана как сложный и мощный инструмент для достижения значительных прорывов в различных областях, выходящих за рамки промышленности и машиностроения, таких как биохимия, молекулярная биология и клинические исследования, в частности, HTS 1,2,3. Toxoplasma gondii является основным паразитом и одноклеточным паразитическим эукариотом4, который вызывает серьезные проблемы со здоровьем у людей5 и многих гомеотермических животных4, что приводит к инфекциям, приводящим к токсоплазмозу, особенно тяжелому состоянию у пациентов со СПИДом6, реципиентов трансплантатов органов7 и беременных женщин8. Neospora caninum, относящаяся к типу Apicomplexa9, в основном поражает собак и коров6, что приводит к энцефаломиелиту и миозиту-полирадикулиту у собак10,11 и абортам у коров12,13. Кроме того, Neospora caninum демонстрирует морфологическое и филогенетическое близкое сходство с Toxoplasma gondii 9,14. Кроме того, они имеют нуклеозидтрифосфатгидролазу (NTPase; EC3.6.1.15)14. Ферменты сильно отличаются от обычной экто-АТФазы14. Эти паразиты генерируют значительное количество белков NTPase, 2-8% от общего белка, и играют важную роль в качестве спящих ферментов настадии 15 тахизоита. Следует отметить, что в плотных секреторных гранулах они конденсируются16 и выделяются в паразитофорную вакуоль16. Являясь биохимическим ферментативным компонентом, NTPase активируется дитиотреитолом17. Предполагается, что индукторы, такие как соединение дитиола, неидентифицированный фермент, такой как дитиол-дисульфидоксидоредуктаза, и другие, проявляют ту же природу. У паразитов они до сих пор не выявлены. Тем не менее, фермент играет важную роль в высвобождении тахизоита из инфицированных клеток хозяина17.

Toxoplasma gondii имеет две изоформы NTPase18: фермент I типа TgNTPase-I и фермент II типа TgNTPase-II18. В первом предпочтительно используются трифосфатные нуклеозиды в качестве субстрата18. Последний гидролизует как трифосфатные, так и дифосфатные нуклеозиды18. Гомология составляет 97% по уровню аминокислот18. Neospora caninum также имеет ортолог TgNTPase-I под названием NcNTPase19. Гомология составляет 73% по уровню аминокислот19. Профессор Асаи и профессор Харада получили рекомбинанты обеих NTPазы с использованием E. coli. и изменили конститутивно активные мутанты этих видов, как сообщалось ранее20. Они любезно одарили двух активных мутантов. Оба фермента могут превращать АТФ в АДФ in vitro20. Совсем недавно мы измерили активность NTPазы с использованием содержания АДФ, гидролизованного ферментами. Наконец, нам удалось создать высокостандартный анализ с помощью процесса определения содержания АДФ с комбинацией флуоресценции и ферментативной реакции, как сообщалось ранее 21,22. Мы также проводили высокопроизводительный скрининг (HTS)22.

В этом исследовании представлены подробные процедуры нового высокоточного анализа21 с динамическим диапазоном, а также подробное объяснение того, как готовить реагенты для измерения активности фермента и развития интенсивности флуоресценции с использованием роботизированной руки для HTS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Экспрессия и очистка рекомбинантной TgNTPase-I и NcNTPase

  1. Приготовьте экспрессию плазмиды и введите ее в кишечную палочку. штамм BL21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о конструкциях и процедурах приведена в предыдущем отчете14. В этом исследовании конститутивно активные мутанты TgNTPase-I и NcNTPase были любезно подарены профессором Асаи и профессором Харада.

2. Приготовление и нанесение биофлуоресцентного реакционного раствора на планшет

  1. Приготовьте 2x биофлуоресцентный реакционный раствор, как описано в таблице 1 , для 2 мл исходной смеси для анализа на 400 лунок в формате 384 лунки.
  2. Готовить исходные растворы с использованием дистиллированной воды (ДВ) для каждой указанной концентрации, за исключением резазурина и N-этилмалеимида. Растворите оставшиеся два реагента с ДМСО в соответствующей концентрации. Затем храните реагенты при температуре -30 °C до момента проведения экспериментов.
  3. Добавьте 15 μL 2x биофлуоресцентного реакционного раствора в каждую из 368 лунок (формат 384 лунок).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первая пластина служит резервуаром, чтобы иметь достаточное количество реагента для проведения экспериментов дважды.

3. Нанесите исследуемые соединения или экстракты на дно каждой лунки в пробирной пластине.

  1. Нанесите 0,5 мкл каждого соединения на нижнюю часть пластины с помощью роботизированного манипулятора с материнской пластины библиотеки, включая тестовые соединения.
  2. Добавьте 0,5 мкл ДМСО как в отрицательный, так и в положительный контроль.

4. Приготовление ферментной реакционной смеси и начало реакции

  1. Приготовьте раствор ферментной реакции, как указано в таблице 2.
  2. Добавьте NTPase (конечная концентрация 0,0002 мкг/мл) в 50 мл ферментной реакционной смеси, быстро перемешайте и переложите в пластиковый резервуар.
  3. Продолжайте одновременную закачку 4,5 мкл в каждую скважину, за исключением отрицательной контрольной линии, с помощью робота-манипулятора.
  4. Добавьте такое же количество ферментной реакционной смеси с PBS вместо фермента, которому предшествует одновременное введение.
  5. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C на 10 минут.

5. Проведение измерений ферментативной активности в режиме реального времени с помощью считывателя микропланшетов

  1. После 10 минут инкубации одновременно добавьте 5 μL 2x биофлуоресцентного реакционного раствора в каждую лунку сразу с помощью манипулятора робота.
  2. Временно остановите руку робота, чтобы удерживать раствор в каждом наконечнике над местом, где должна быть размещена пластина.
  3. Как только пластина для анализа будет на месте, перезапустите манипулятор робота.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать насыщения генерируемого АДФ, немедленно измерьте интенсивность флуоресценции.
  4. Быстро поверните пластину вниз (200 x g в течение 1 минуты) и поместите пластину в считыватель пластин.
  5. Начинайте измерение флуоресценции в реальном времени с длиной волны 540 нм/590 нм (возбуждение/излучение) каждую минуту в течение 1 часа.

6. Анализ результатов

  1. Рассчитать значения как среднее ± стандартную ошибку среднего значения (SEM) по указанным и тиражируемым выборкам в каждой экспериментальной группе; Повторите эксперименты для обеспечения согласованности.
  2. Выполните статистическую значимость с помощью t-критерия Стьюдента.
  3. Вычисляйте значения как статистически значимые, если значения P равны P < 0,05.
  4. Рассчитайте отношение сигнал/фон (S/B), отношение сигнал/шум (S/N) и Z'-фактор по следующим формулам:
    S/B = Средний лиганд/Средний носитель
    S/N = (Средний лиганд - Среднее транспортное средство)/Транспортное средство со стандартным отклонением
    Z'-фактор = 1 - (3 x Лиганд стандартного отклонения + Носитель стандартного отклонения)/(Средний лиганд - Средний носитель)
  5. Убедитесь, что S/B, S/N и Z'-фактор больше 3, 10 и 0,5 соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите, соответствует ли каждый эксперимент общему критерию, достаточному для проведения HTS, как указано в предыдущих отчетах23,24.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Принцип проведения анализа кратко изложен на дополнительном рисунке 1 и основан на предыдущем отчете12,18. Анализ был разработан в формате 384 лунки, как показано на рисунке 1. Крайние правые и левые линии на табличке были исключены. Две линии, расположенные рядом с крайней левой и правой линиями, затем использовались в качестве отрицательного контроля и положительного контроля с ферментом или без него, соответственн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Нам удалось создать новый анализ с высоким динамическим диапазоном и точностью с комбинацией классического ферментного анализа и флуоресцентного анализа на АДФ, который является конечным продуктом АТФазы, включая Tg и Nc АТФазу22. Для проведения ВТСП важно, чтобы анализ имел лучшие значения S/B, S/N и Z'-фактора, чем классический ферментный анализ15,22. Кроме того, исключение этапа остановки ферментативной...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют финансовой заинтересованности в данном исследовании.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Платформой для разработки лекарств, информатики и структурных наук о жизни, грантом на научные исследования (C) от Японского общества содействия науке (JSPS-21K06566). Авторы искренне благодарят Асаи (Школа медицины Университета Кэйо) и Хараду (Киотский технологический институт) и Стивена Стрэттона за подарку рекомбинантных двух активных мутантов NTPазы и его вклад в подготовку данной рукописи соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12 сценическое рабочее место EDR-384 SXBiotec Co., Ltd.EDR-384SXРоботизированный манипулятор Система пипетирования
384 наконечника скважиныBiotech Co., Ltd.Изготовленная
на заказ АДФ-гексокиназаAsahi Kasei Pharma Co., Ltd.Т-92
СПС Восточные Дрожжи, Ко, Лтд45140000
BSAWako Pure Chemical Industries, Ltd.011-15144
Диафораза-IУнитика ОООDi-1
DMSONacalai Tesch, Inc.13406-55
G6P дегидрогеназаВосточные дрожжи, Co, Ltd.306-50143
ГлюкозаВако Пьюпер Кемикал Индастриз, Лтд.049-31165
Greiner 384 луночный микропланшет необязывающий неглубокий колодец Черный#784900
HEPESWako Pure Chemical Industries, Ltd.342-01375
мг(CH3COO)2Wako Pure Chemical Industries, Ltd.130-00095
НАДПВосточные дрожжи, Ко, Лтд.44332000
N-этилмалеимидWako Pure Chemical Industries, Ltd.056-02062
PHERAstar FSBMG LABTECH JAPAN L.t.d.PHERAstar FSМногорежимный считыватель микропланшетов
ResazurinWako Pure Chemical Industries, Ltd.191-07581
Seahorse Labware 384 Скважинные низкопрофильные резервуарыS30022 25/CS
TrisHClWako Pure Chemical Industries, Ltd.W01COBQE-4120
Triton X-100Nacalai Tesch, Inc.35501-02

Ссылки

  1. Bianca, C. B., et al. A robotic platform to screen aqueous two-phase systems for overcoming inhibition in enzymatic reactions. Bioresource Technology. 280, 37-50 (2019).
  2. Aliaksei, V., Jan, D. B. Robot-scientists will lead tomorrow's biomaterials discovery. Current Opinion in Biomedical Engineering. 6, 74-80 (2018).
  3. Mandeep, D., Kusum, P., Dharini, P., Nikolaos, E. L., Pratyoosh, S. Robotics for enzyme technology: innovations and technological perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105, 4089-4097 (2021).
  4. Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , CRC Press. Boca Raton, FL, USA. (1988).
  5. Michael, C., Sneller, H., Clifford, L. Infections in the Immunocompromised Host in Clinical Immunology., 3rd ed. , Elsevirer. Amsterdam, The Netherlands. (2008).
  6. Schäfer, G., et al. Immediate versus deferred antiretroviral therapy in HIV-infected patients presenting with acute AIDS-defining events (toxoplasmosis, Pneumocystis jirovecii-pneumonia): A prospective, randomized, open-label multicenter study (IDEAL-study). AIDS Research and Therapy. 16, 34(2019).
  7. Ramanan, P., et al. Toxoplasmosis in non-cardiac solid organ transplant recipients: A case series and review of literature. Transplant Infectious Disease. 26, 13218(2019).
  8. Rivera, E. M., et al. Toxoplasma gondii seropositivity associated to peri-urban living places in pregnant women in a rural area of Buenos Aires province, Argentina. Parasite Epidemiology and Control. 7, 00121(2019).
  9. Donahoe, S. L., Lindsay, S. A., Krockenberger, M., Phalen, D., Šlapeta, J. A review of neosporosis and pathologic findings of Neospora caninum infection in wildlife. International Journal of Parasitology: Parasites and Wildlife. 4, 216-238 (2015).
  10. Crookshanks, J. L., Taylor, S. M., Haines, D. M., Shelton, G. D. Treatment of canine pediatric Neospora caninum myositis following immunohistochemicalidentification of tachyzoites in muscle biopsies. TheCanadian Veterinary Journal. 48, 506-508 (2007).
  11. Bartner, L. R., et al. Testing for Bartonella ssp. DNA in cerebrospinal fluid of dogs with inflammatory central nervous system disease. Journal of Veterinary Internal Medicine. 32, 1983-1988 (2018).
  12. Changoluisa, D., Rivera-Olivero, I. A., Echeverria, G., Garcia-Bereguiain, M. A., de Waard, J. H. Working group "Applied Microbiology" of the School of Biological Sciences and Engineering at Yachay Tech University. Serology for Neosporosis, Q fever and Brucellosis to assess the cause of abortion in two dairy cattleherds in Ecuador. BMC Veterinary Research. 15, 194(2019).
  13. Serrano-Martínez, M. E., et al. Evaluation of abortions spontaneously induced by Neospora caninum and risk factors in dairy cattle from Lima, Peru. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaria. 28, 215-220 (2019).
  14. Matoba, K., et al. Crystallization and preliminary X-ray structural analysis of nucleoside triphosphate hydrolases from Neospora caninum and Toxoplasma gondii. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 66, 1445-1448 (2010).
  15. Nakaar, V., Beckers, C. J., Polotsky, V., Joiner, K. A. Basis for substrate specificity of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase. Molecular and Biochemical Parasitology. 97, 209-220 (1998).
  16. Pastor-Fernández, I., et al. The tandemly repeated NTPase (NTPDase) from Neospora caninum is a canonical dense granuleprotein whose RNA expression, protein secretion and phosphorylation coincides with the tachyzoite egress. Parasites and Vectors. 9, 352(2016).
  17. Silverman, J. A., et al. Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells. Journal of Biological Chemistry. 273, 12352-12359 (1998).
  18. Olias, P., Sibley, L. D. Functional analysis of the role of Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolases I and II in acute mouse virulence and immune suppression. Infection and Immunity. 84, 1994-2001 (2016).
  19. Leineweber, M., et al. First Characterization of the Neospora caninum Dense Granule Protein GRA9. BioMed Research International. 2017, 6746437(2017).
  20. Krug, U., Zebisch, M., Krauss, M., Sträter, N. Structural insight into activation mechanism of Toxoplasma gondii nucleoside triphosphatediphosphohydrolases by disulfide reduction. Journal of Biological Chemistry. 287, 3051-3066 (2012).
  21. Kumagai, K., Kojima, H., Okabe, T., Nagano, T. Development of a highly sensitive, high-throughput assay for glycosyltransferases using enzyme-coupled fluorescence detection. Analytical Biochemistry. , 146-155 (2014).
  22. Harada, M., et al. Establishment of novel high-standard chemiluminescent assay for NTPase in two protozoans and its high-throughput screening. Marine Drugs. 18, 161(2020).
  23. Kurata, R., et al. Establishment of novel reporter cells stably maintaining transcription factor-driven human secreted alkaline phosphatase expression. Current Pharmaceutical Biotechnology. 19, 224-231 (2018).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
  25. Nakajima-Nakano, K., Makioka, A., Yamashita, N., Matsuo, N., Asai, T. Evaluation of serodiagnosis of toxoplasmosis by using the recombinant nucleoside triphosphate hydrolase isoforms expressed in Escherichia coli. Parasitology International. 48, 215-222 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Toxoplasma gondiiферментативный анализфлуоресцентный анализопределение АДФпоиск новых лекарственных средствавтоматизация с помощью робоманипуляторапростейшие паразиты

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.