Глобальная идентификация сетей котрансляционного взаимодействия путем селективного профилирования рибосом

Selective Ribosome Profiling (SeRP) является единственным методом на сегодняшний день, который захватывает и характеризует котрансляционные взаимодействия in vivo прямым образом ^1,2,3,4,5,6. SeRP позволяет глобально профилировать взаимодействия любого фактора с трансляцией рибосом в близкое к кодону разрешение ^2,7.

Метод основан на мгновенном замораживании растущих клеток и сохранении активной трансляции. Клеточные лизаты затем обрабатывают РНКазой I для переваривания всех мРНК в клетке, за исключением защищенных рибосомами фрагментов мРНК, называемых «следами рибосом». Затем образец разбивается на две части; одна часть непосредственно используется для выделения всех клеточных рибосомных следов, представляющих всю текущую трансляцию в клетке. Вторая часть используется для аффинно-очистки специфического подмножества рибосом, связанных с интересующим фактором, например: модифицирующими ферментами, транслокационными факторами, складчатыми шаперонами и комплексосборочными взаимодействиями. Аффинно-очищенные рибосомные следы в совокупности называются интерактомом. Затем мРНК, защищенные рибосомами, извлекаются и используются для генерации библиотеки кДНК с последующим глубоким секвенированием.

Сравнительный анализ общих образцов транслейтома и интерактома позволяет идентифицировать все орфы, которые связаны с интересующим фактором, а также охарактеризовать каждый профиль взаимодействия орф. В этом профиле сообщается о точных последовательностях начала и окончания зацепления, из которых можно вывести декодированные кодоны и соответствующие остатки возникающей полипептидной цепи, а также об изменениях скорости рибосом во время взаимодействия ^7,8. На рисунке 1 протокол показан в виде схемы.

Рисунок 1: Обзор протокола SeRP. Этот протокол может быть выполнен в полном объеме в течение 7-10 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Генерация штаммов для селективного профилирования рибосом

ПРИМЕЧАНИЕ: Selective Ribosome Profiling (SeRP) - метод, который опирается на аффинную очистку интересующих факторов для оценки их способа взаимодействия с рибосомами-зарождающимися цепными комплексами. Гомологичная рекомбинация⁹, а также методы на основе CRISPR/Cas9¹⁰ используются для слияния различных интересующих факторов с метками для аффинной очистки. Такими метками являются GFP, для очистки аффинности GFP-ловушки, TAP-tag для очистки бусин IgG-Sepharose, а также AVI-Tag, очищенный авидином или стрептавидином, чтобы перечислить несколько успешных примеров последних лет.

1. Выполняйте анализы роста или функциональные анализы, чтобы подтвердить, что маркировка не влияет на функцию белков. Следует оценить терминальную маркировку N' и C'.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рибосомы (рРНК), а также многие рибосомно-связывающие домены в различных факторах сильно заряжены, что делает высокозаряженные метки (такие как полигистидин) непригодными для использования, поскольку это может привести к ложному обнаружению или изменению режима связывания.

2. Рост культуры

1. Культивируют построенные дрожжевые культуры (на основе штамма BY4741), содержащие желаемые меченые белки, либо в жидкой среде, богатой экстрактом дрожжей-пептон-декстрозой (YPD), либо в минимальной среде синтетической декстрозы (SD) (1,7 г/л дрожжевого азотного основания с сульфатом аммония или 1,7 г/л дрожжевой азотной основы без сульфата аммония с 1 г/л глутаминовой кислоты натрия, 2% глюкозы и дополненной полной или соответствующей смесью аминокислот).
2. Вырастите 250-500 мл клеточной культуры до 0,5 ОД₆₀₀ (середина бревна) при 30 °C в соответствующей среде.

3. Клеточный сбор и лизис

1. Быстрый сбор клеток вакуумной фильтрацией на нитроцеллюлозной блоттинговой мембране 0,45 мкм со стеклянной системой фильтрации (стеклянный фильтродержатель со стеклянной воронкой 1 л, вакуумным основанием и колпачком, экран из нержавеющей стали, прокладка и пружинный зажим, 90 мм; колба для заземления 1 л).
2. Вспышка замораживает собранные клетки, соскребая гранулированные ячейки шпателем и сразу же погружая их в заполненную жидким азотом трубку объемом 50 мл.
   ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Клетки могут храниться при -80 °C в течение 3-4 недель.
3. Выполняют клеточный лизис криогенным измельчением в смесительной мельнице: дважды по 2 мин при 30 Гц, с 1 мл лизисного буфера (см. табл. 1). Охладить в жидком азоте между измельчениями.

Таблица 1: Рецепт лизисной буферной мастер-смеси.

ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер лизиса может быть изменен, чтобы содержать больше ингибиторов протеазы (таких как бестатин, лейпептин, апротинин и т. Д.), Если интересующий белок очень нестабилен, но важно избегать ЭДТА, чтобы поддерживать малые и большие субъединицы рибосомы, собранные во время следующих этапов. По аналогичным причинам всегда поддерживать не менее 6 мМ_MgCl2 в буферном растворе.

ВНИМАНИЕ: HCl обладает высокой коррозионной активностью, а PMSF токсичен. Носите перчатки и обращайтесь с осторожностью.

4. Центрифуга в течение 2 мин при 30 000 х г, 4 °C для очистки лизата и сбора супернатанта.

4. Очистка рибосомно-зарождающихся цепных комплексов для SeRP

1. Для каждого эксперимента разделите супернатант на две части; каждый в отдельной микроцентрифужной пробирке: общий образец РНК (~200 мкл) и образец иммуноочистки (IP) (~700 мкл) образцы транслейтома.
2. Обработка общего образца РНК
   1. Переварить общий образец РНК с использованием 10 ЕД РНКазы I в течение 25 мин при 4 °C; вращение со скоростью вращения со скоростью вращения 30 об/мин с помощью вращающейся стойки для смешивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Условия пищеварения могут быть откалиброваны с использованием полисомного профилирования, чтобы обеспечить отсутствие пика переваривания или недоваривания моносом.
   2. Приготовьте мастер-микс сахарозной подушки, как описано в таблице 2.

Таблица 2: Рецепт мастер-микса для сахарозной подушки.

3. Загрузите образец на 400 мкл сахарозной подушки и центрифуги в роторе TLA120 в течение 90 мин при 245 000 х г и при 4 °C.
4. Быстро удалите супернатант с помощью вакуумного насоса и наложите гранулы с буфером лизиса 150 мкл. Повторно суспендировать гранулы путем встряхивания в течение 1 ч при 4 °C и при 300 об/мин.
5. Повторное суспендирование остаточной гранулы путем пипетки и переноса в новую трубу объемом 1,5 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 100-200 мкг общей РНК обычно достаточно для рибосомного профилирования общего транслейлома. Можно добавить стадию истощения рРНК, чтобы уменьшить загрязнение рРНК, которая является наиболее распространенным загрязнителем рибосомно-зарождающихся цепных комплексов аффинности очистки¹¹ (см. обсуждение для получения дополнительной информации).

3. Обработка образца иммуноочистки
   1. Промыть 100-400 мкл аффинно-связывающей матрицы (1:1 бусины, конъюгированные антителами в 70% EtOH) на образец с буфером лизиса 3 х 1 мл (без ДНКазы I и ингибиторов протеазы); повторно суспендируют матрицу сродства в буфере лизиса, а затем вращают со скоростью 30 об/мин с вращающейся стойкой смеси при 4 °C в течение 5 мин. Осаждение центрифугированием в течение 30 с при 3 000 х г, 4 °C. Отбросьте верхнюю жидкость. Повторите три раза.
   2. Переваривайте образцы иммуноочищения, используя 10 ЕД на единицу А260 нм РНКазы I вместе с аффинно-связывающей матрицей (например, 100-400 мкл GFP-TRAP на образец).
   3. Вращайте в течение 25 мин при 30 об/мин с помощью вращающейся стойки для смешивания, чтобы связать белок с матрицей сродства при 4 °C.
   4. Подготовьте мастер-смесь буфера для стирки, как описано в таблице 3.

Таблица 3: Рецепт мастер-микса для промывки буфера.

5. Трижды промывайте матрицу с аффинным связыванием 1 мл буфера для промывки, каждый раз в течение ~1 мин, вращаясь в стойке для смешивания при 30 об/мин, при 4 °C.
6. Осаждение центрифугированием при 3 000 х г в течение 30 с при 4 °C. Отбросьте верхнюю жидкость.
7. Промыть еще два раза в буфере для промывки 1 мл, каждый раз в течение 5 мин, вращая в стойке для смешивания при 30 об/мин, при 4 °C.
8. Осаждение центрифугированием в течение 30 с при 3 000 х г и 4 °C.
9. Используйте 50 мкл шариков для элюирования белка с таким же количеством 2-кратного буфера образца. Используйте остальные шарики для экстракции РНК.
10. Центрифуга в течение 30 с при 3000 х г, 4 °C для гранулирования шариков и выброса верхней жидкости.
11. Заморозить в жидком азоте и хранить при -80 °C. Используйте эти образцы для последующей экстракции РНК.
    ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Образцы могут храниться при температуре -80 °C в течение ночи или дольше. Это может быть остановочный пункт.
12. Оцените успешность этапа аффинной очистки западным пятном или окрашиванием Кумасси аликвотами (~10% по объему, после смешивания) каждого этапа. Всегда используйте макет IP-адреса на штамме WT без тегов в качестве элемента управления для неспецифической привязки к матрице сходства.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высокий неспецифический фон может быть преодолен дополнительными этапами промывки с увеличением концентрации соли/моющего средства. Транзиторное взаимодействие может быть стабилизировано лечением различными сшивающими агентами, например, обработкой параформальдегидом (PFA) живых клеток - добавление 0,4%-1% PFA в питательную среду в течение 2-5 мин с последующим гашением глицина (0,3 M) в течение 3 мин, настоятельно рекомендуется.
    ВНИМАНИЕ: Параформальдегид является подозреваемым канцерогеном. Поскольку параформальдегид быстро испаряется и является коррозионным, работайте в защитном кожухе и надевайте два слоя перчаток.

5. Подготовка библиотеки кДНК к глубокому секвенированию

1. Экстракция РНК
   ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте с антипригарными трубками 1,5 мл без РНКазы, чтобы предотвратить возможное истощение РНК или ДНК.
   1. Разморозьте образцы с этапов 4.2.5 и 4.3.12 на льду и повторно суспендируйте образцы с 10 мМ Tris-HCl pH 7,0 до конечного объема 700 мкл.
      ВНИМАНИЕ: Кислота-фенол и хлороформ летучи и вредны. Работа в вытяжке с химической безопасностью.
   2. Добавьте 40 мкл 20% SDS к 0,7 мл total RNA или IP elutions. Закройте и переверните несколько раз. Осаждение белка должно сделать образцы белыми.
   3. Добавьте в образцы 0,75 мл предварительно нагретого кислотно-фенольного:хлороформа. Плотно запечатайте трубки и встряхните в термомешалке при 1 400 об/мин в течение 5 мин и при 65 °C. Охладите образцы на льду в течение 5 минут.
   4. Центрифугирование трубки с этапа 5.1.3. при 20 000 х г в течение 2 мин. Переложить верхний водный слой на свежий тюбик и добавить в него 0,7 мл кислоты-фенола:хлороформа.
   5. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре, изредка вихрево. Центрифуга в течение 2 мин при 20 000 х г. Переложить верхний водный слой на свежий тюбик и добавить в него 0,6 мл хлороформа и вихря.
   6. Центрифуга в течение 1 мин при 20 000 х г. Переложить верхний водный слой на свежий тюбик.
   7. Осаждение нуклеиновых кислот путем добавления 78 мкл 3 M NaOAc, рН 5,5, 2 мкл GlycoBlue и 0,75 мл изопропанола. Тщательно вихрь в течение 5 мин. Инкубировать в течение не менее 1 ч при -80°С или 16 ч при -20°С.
   8. Центрифугу в течение 30 мин при 20 000 х г и при 4 °C и выбросьте супернатант. Гранулы промыть ледяным 0,75 мл 80% этанола. Переверните трубки для тщательной промывки. Центрифугу при 20 000 х г в течение 5 мин при 4 °С, а затем выбросьте надосадочную массу.
   9. Открутите при 450 х г, 4 °C в течение 20 с, удалите оставшийся этанол и выбросьте жидкости. Высушите гранулу открытой крышкой в течение 5 мин при 65 °C. Повторно суспендировать образцы следующим образом: для IP повторно суспендировать образец в 10 мкл 10 мМ Tris-HCl, рН 7,0. Для анализа общего транслейтома повторно суспендируют образец в 20 мкл 10 мМ Tris-HCl, рН 7,0.
      ТОЧКА ОСТАНОВКИ: РНК может храниться при -80 °C в течение нескольких месяцев.
2. Количественная оценка общей концентрации РНК с помощью флюорометрии
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие материалы и поверхности должны быть свободны от РНКА при подготовке библиотеки кДНК к секвенированию следующего поколения. При работе с образцами РНК надевайте перчатки.
   1. Развести 1 мкл кислотной фенол-экстрагированной общей РНК в 9 мкл 10 мМ Tris-HCl, рН 7,0. Количественная оценка с помощью флуорометра, как указано на веб-сайте производителя.
   2. Разбавляют образцы, содержащие 50 мкг РНК, 10 мкл 10 мМ Tris-HCl, рН 7,0.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не измеряйте образцы IP, используйте все для следующего шага.
3. Гель-очистка рибосом защищенных фрагментов следов
   1. Установите 15% TBE-мочевинный полиакриламидный гель и погрузите в 1x TBE рабочий буфер. Работайте в течение 30 минут при напряжении 200 В перед загрузкой образца. К каждому образцу добавьте 20 мкл 2x буфера образцов TBE-мочевины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый размер полосы составляет около 25-35 нт.
   2. Разморозьте лестницу ДНК 10 бп и образцы денатуры (не лестницы) при 80 °C в течение 2 мин, а затем охладите на льду. Загрузите каждый образец на каждую другую полосу. Запускают гель в течение 50-70 мин при 200 В.
   3. Разбавить 6 мкл золота SYBR (концентрат 10 000 х) в 60 мл 1x TBE буфера и окрашивания при встряхивании в светонепроницаемых коробках в течение 15-20 мин. При окрашивании геля приготовьте стерильный скальпель и 0,5 мл гелеобразующих тюбиков в маркированных тюбиках по 1,5 мл.
   4. Иссейте нужные полосы стерильным скальпелем (используйте свежий или очистите хорошо между образцами) и поместите каждый кусочек геля в гелевое пробирку.
   5. Сделайте снимок геля, чтобы убедиться, что в геле не осталось остатков образца.
   6. Центрифугируют пробирки, содержащие нарезанные ломтики при 20 000 х г в течение 5 мин при 4 °С, и переложите оставшиеся кусочки геля из гелевой трубки в трубку 1,5 мл.
   7. Добавьте 0,5 мл 10 мМ Tris, рН 7,0. Встряхивайте в термомешалке при 1 400 об/мин в течение 10 мин при 70 °C.
   8. Переложить в колонну ацетата целлюлозы с широким отверстием пипетки и центрифугу при 20 000 х г в течение 3 мин при 4 °C.
   9. Перенесите поток в новую трубку объемом 1,5 мл и охладите на льду.
   10. Чтобы вывести в осадок нуклеиновые кислоты, добавьте: 550 мкл IPA, 55 мкл 3 M NaOAc и 2 мкл GlycoBlue и вихрь для тщательного смешивания. Поместите образцы при температуре -80 °C в течение не менее 1 ч.
   11. Центрифуга в течение не менее 1 ч при 20 000 х г и 4 °C и выбросьте супернатант. Промыть гранулы 0,75 мл ледяного 80% этанола. Переверните трубки для тщательной промывки, пока гранулы не отделятся от дна. Центрифугу снова при 20 000 х г в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте супернатант.
   12. Открутите при 450 х г, 4 °C в течение 20 с и удалите оставшийся этанол. Высушите гранулы открытой крышкой в течение 5 мин при 65 °C.
   13. Добавьте 15 мкл 10 мМ Tris, рН 7,0 и тщательно суспендируйте гранулы. Открутите при 450 х г, 4 °C в течение 20 с и перенесите образец в новую трубку объемом 1,5 мл.
       ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Очищенная РНК может храниться при -80 °C в течение нескольких месяцев.
4. Дефосфорилирование
   1. Используйте 3 мкл следующей смеси для каждого образца: Добавьте 1 мкл ингибитора РНКАЗЫ в 2 мкл реакционного буфера 10x T4 полинуклеотидкиназы без АТФ. Добавьте 2 мкл полинуклеотидкиназы Т4 к каждому образцу. Пипетку аккуратно хорошо перемешать и инкубировать при 37 °С в течение 2 ч, не встряхивая.
   2. Чтобы инактивировать фермент, инкубируют образец при 75 °C в течение 10 мин и вращают вниз при 450 х г, 4 °C, в течение 20 с. Добавьте 0,5 мл 10 мМ Tris, рН 7,0.
   3. Для осаждения нуклеиновой кислоты добавляют 2 мкл GlycoBlue, 550 мкл IPA и 55 мкл 3 M NaOAc.
   4. Вихрь тщательно перемешать и охладить образцы при -80 °C в течение не менее 1 ч.
      ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Образцы могут храниться при температуре -80 °C в течение ночи или дольше.
   5. Повторите шаги 5.3.11-5.3.13.
      ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Дефосфорилированная РНК может храниться при -80 °C в течение нескольких месяцев.
5. Количественная оценка с помощью биоанализатора
   1. Сделайте разбавление 1:4 каждого образца РНК, смешивая 1 мкл образца и 4 мкл воды, обработанной DEPC.
      ВНИМАНИЕ: DEPC является канцерогеном. Надевайте перчатки и работайте осторожно.
   2. Запустите биоанализатор Малый чип РНК / TapeStation. Следуйте протоколу производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый размер фрагмента РНК, защищенной рибосомами, составляет около 28-30 нт.
6. Ligate 3' конец с Linker-1
   1. Разводят 5 пмоль мелких фрагментов РНК до 10 мкл с 10 мМ Трис, рН 7,0. Денатурировать образцы при 80 °C в течение 2 мин и охлаждать на льду.
   2. Подготовьте мастер-микс, как описано в таблице 4 , и используйте 29 мкл на образец.

Таблица 4: Рецепт 3' конца лигирования мастер-микса.

3. Добавьте 1 мкл Т4 РНК-лигазы 2 и пипетку осторожно, чтобы хорошо перемешать. Инкубировать при 23 °C в течение 2 ч.
4. Чтобы вывести в осадок нуклеиновые кислоты, добавьте: 550 мкл IPA, 500 мкл 10 мМ Tris, рН 7,0, 55 мкл 3 M NaOAc и 2 мкл GlycoBlue. Вихрь тщательно перемешать и поместить образцы при -80 °C в течение 1 ч не менее.
   ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Храните образцы при температуре -80 °C в течение ночи или дольше.
5. Повторите шаги 5.3.2-5.3.12.
6. Повторно суспендировать гранулу в 6 мкл 10 мМ Трис, рН 7,0. Открутите при 450 x g, 4 °C в течение 20 с и перенесите образец в новую пробирку объемом 1,5 мл.
   ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Образцы могут храниться при температуре -80 °C в течение нескольких месяцев.

7. Гелевая очистка 3' связанных контуров
   1. Установите 10% TBE-мочевинный полиакриламидный гель и погрузите в 1x TBE рабочий буфер. Работайте в течение 30 минут при напряжении 200 В перед загрузкой образца. К каждому образцу добавьте 6 мкл 2x буфера образцов TBE-мочевины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый размер полосы составляет около 71-73 нт.
   2. Повторите шаги 5.3.2-5.3.13.
      ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Образцы могут храниться при температуре -80 °C в течение нескольких месяцев.
8. Обратная транскрибация 3ʹ связанных фрагментов следа для генерации ssDNA
   1. Приготовьте мастер-микс, как описано в таблице 5 , и используйте 3 мкл на образец.

Таблица 5: Рецепт мастер-микса буфера обратной транскрипции перед денатурацией нуклеиновых кислот.

2. Вихрь и вращение вниз образца.
3. Инкубировать образцы при 65 °C в течение 5 мин.
4. Охладите образцы на льду.
5. Приготовьте мастер-микс, как описано в таблице 6 , и используйте 6 мкл на образец. Вихрь и вращение вниз образца. Добавьте 1 мкл надстрочного индекса III к каждому образцу и аккуратно перемешайте и инкубируйте в течение 30 мин при 50 °C.

Таблица 6: Рецепт мастер-микса буфера обратной транскрипции после денатурации нуклеиновых кислот.

6. Добавьте 2,3 мкл 1 N NaOH, который гидролизует РНК и гасит обратную транскрипцию.
   ВНИМАНИЕ: NaOH обладает высокой коррозионной активностью. Носите перчатки и защиту глаз.
7. Инкубировать в течение 15 мин при 95 °C, пока образец не станет розовым.
8. Установите 10% TBE-мочевинный полиакриламидный гель и погрузите в 1x TBE рабочий буфер. Работайте в течение 30 минут при напряжении 200 В перед загрузкой образца. К каждому образцу добавьте 23 мкл 2x буфера образцов TBE-мочевины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый размер полосы ДНК составляет 115-117 нт.
9. Повторите шаги 5.3.2-5.3.12.
10. Повторно суспендировать гранулу в 15 мкл 10 мМ Tris, рН 8,0. Открутите при 450 х г, 4 °C в течение 20 с и перенесите образец в новую трубку объемом 1,5 мл.
    ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Образцы могут храниться при температуре -80 °C в течение нескольких месяцев.

9. циркуляризация ssDNA
   1. Подготовьте следующую основную смесь и загрузите 4 мкл на образец, как показано в таблице 7.

Таблица 7: Рецепт мастер-микса циркуляризации ssDNA .

2. Добавляют 1 мкл цирклигазы II ssDNA лигазы к каждому образцу и инкубируют в течение 1 ч при 60 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность этой стадии может быть увеличена путем добавления 1 мкл цирклигазы II ssDNA лигазы к каждому образцу после инкубации через 1 ч.
3. Инактивируют фермент путем инкубации при 80 °C в течение 10 мин.
4. Охладить на льду и продолжить ПЦР-амплификацию или хранить при -80 °C.
   ОСТАНОВКА: Образцы могут храниться при -80 °C в течение многих лет.

10. Амплификация ПЦР
    1. Подготовьте следующую основную смесь ПЦР и загрузите 82 мкл на образец, как описано в таблице 8.

Таблица 8: Рецепт мастер-микса для ПЦР-амплификации.

2. К каждой трубке, содержащей мастер-микс, добавляют 5 мкл циркуляризированной ДНК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Храните остальные циркулированные образцы ДНК при -80 °C.
3. Добавьте к каждому образцу различный праймер с обратным штрих-кодом ПЦР объемом 1 мкл 20 мкМ (см. Таблицу 9) и вихрь для тщательного перемешивания.
4. Aliquot каждая трубка в четыре отдельные ПЦР-трубки, каждая из которых будет использоваться для разного количества циклов ПЦР.
5. Запустите реакцию ПЦР в соответствии со следующей программой, как описано в таблице 10.

Таблица 10: Программа ПЦР для реакции ПЦР.

6. После циклов 8, 9, 10 и 11 удаляют трубки ПЦР (для образцов IP циклы варьируются от 9 до 15) в качестве первой попытки. После каждого цикла приостанавливайте программу, вынимайте одну аликвоту и кладите ее на лед, а затем быстро возобновляйте программу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество циклов должно быть скорректировано в зависимости от количества циркуляризированной ДНК в каждой реакции. Обратитесь к рисунку 4 для примера и дальнейших разъяснений.
7. К каждой 17-мкл реакции добавляют 3,5 мкл 6-кратного ДНК-нагрузочного красителя.
8. Разморозьте лестницу ДНК 10 bp.
9. Для разделения размеров с помощью гель-электрофореза погрузьте 8% полиакриламид TBE в 1x TBE рабочий буфер и загрузите образцы каждого различного номера цикла в соседние скважины и запустите гель в течение 50 мин при 180 В.
10. Разбавить 6 мкл золота SYBR (концентрат 10 000 х) в 60 мл 1x TBE буфера и окрашивания при встряхивании в светонепроницаемых коробках в течение 15-20 мин.
11. При окрашивании геля приготовьте стерильный скальпель и 0,5 мл гелеобразующих тюбиков в маркированных тюбиках по 1,5 мл.
12. Сделайте снимок окрашенных нуклеиновых кислот.
13. Стерильным скальпелем нарежьте нужную полосу с ожидаемым размером полосы 174-176 bp и поместите ломтик геля в подготовленную гелеобразную трубку объемом 0,5 мл (тщательно очистите между образцами и используйте инактивирующий агент RNase или переключитесь на новое лезвие).
14. Центрифугируйте пробирки в течение 5 мин при 20 000 х г и 4 °C, а затем перенесите оставшиеся кусочки геля из гелеобразной трубки 0,5 мл в трубку 1,5 мл.
15. Добавьте 500 мкл 10 мМ Tris, рН 8,0 и встряхните в термомешалке при 1 400 об/мин в течение 10 мин и 70 °C.
16. Переложите растворенный гель на столб ацетата целлюлозы с широким отверстием пипетки.
17. Центрифугируйте колонну в течение 3 мин при 20 000 х г и 4 °C и перенесите проточную трубу в новую трубку объемом 1,5 мл и охладите на льду.
18. Чтобы вывести нуклеиновую кислоту в осадок, добавьте: 550 мкл IPA, 32 мкл 5 M NaCl, 1 мкл 0,5 M EDTA и 2 мкл GlycoBlue и вихрь для тщательного смешивания.
19. Храните образцы в течение не менее 1 ч при -80 °C или -20 °C в течение ночи.
    ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Образцы могут храниться при температуре -80 °C в течение ночи или дольше.
20. Повторите шаги 5.3.11-5.3.12.
21. Повторное суспендирование в 11 мкл 10 мМ Tris, рН 8,0. Открутите при 450 х г, 4 °C в течение 20 с и перенесите образец в новую трубку объемом 1,5 мл.
    ОСТАНОВКА: Образцы могут храниться при -80 °C в течение многих лет.

11. Количественная оценка распределения по размерам с помощью биоанализатора
    1. Сделайте разбавление 1:4 каждого образца, смешав 1 мкл образца с 4 мкл воды, обработанной DEPC.
    2. Запустите биоанализатор Малый чип РНК. Следуйте протоколу производителя.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемая длина составляет 175 ± 5 bp.
12. Количественная оценка концентрации ДНК с помощью флуорометра
    1. Выполните проверку концентрации dsDNA с высокой чувствительностью с помощью флуорометра в соответствии с рекомендациями производителя.
    2. Образцы мультиплексов и последовательностей в соответствии с рекомендациями Illumina (Index Adapters Pooling Guide¹²).

6. Анализ данных

1. Выполните анализ, как описано в дополнительном файле.

Как показано на блок-схеме этого протокола (рисунок 1), клетки выращивали до логарифмической фазы, а затем быстро собирали путем фильтрации и лизировали криогенным измельчением. Затем лизат был разделен на два: один для общих следов мРНК, защищенных рибосомами, а другой для выбранных следов мРНК, защищенных рибосомами, на которых мы выполнили аффинную очистку для снижения помеченных белково-рибосомно-зарождающихся цепей комплексов. Мы обеспечили экспрессию помеченного белка и успех анализа вытягивания с помощью вестерн-блоттинга, как видно на рисунке 2. Мы проверили выделение защищенных рибосом следов, которые обычно имеют длину 20-45 нт с помощью электрофореза малой РНК (система BioAnalyzer 2100), что позволяет обнаруживать сдвиг в размере 5-10 нт, согласно руководству по системе (рисунок 3). Затем мы создали библиотеку кДНК для глубокого секвенирования и анализа больших данных. При генерации библиотеки кДНК обратите внимание, что недостаточная цикличность может привести к низкому выходу (как видно на полосе 2 на рисунке 3), но возможно повторное усиление для восстановления сгенерированной библиотеки. Чрезмерная цикличность может произойти, когда праймеры ПЦР истощены, но реакция продолжается. Когда dNTP все еще присутствуют, реакция продолжается, генерируя более длинные артефакты ПЦР с химерными последовательностями из-за продуктов ПЦР, заправляющих себя13 (как видно на полосах 3-4 на рисунке 3, обозначенных видимым мазком). Если концентрация дНТП также становится предельной, могут появляться продукты, указывающие на наличие гетеродуплексов, состоящих только из частично гомологичных фрагментов библиотеки. Рисунок 4 выступает в качестве эталона, причем полоса 2 представляет оптимальное усиление, а полоса 3 - приемлемое усиление. Образцы из полос 4 и 5 (циклы 10 и 11) не должны использоваться из-за возможности введения дубликатов и артефактов ПЦР. Сгенерированная библиотека была дополнительно подтверждена высокочувствительным электрофорезом ДНК (использовалась та же система BioAnalyzer) для точного распределения размеров и количественной оценки (рисунок 5). После 3'-концевой лигирования линкера, обратной транскрипции и амплификации ПЦР ожидается распределение длины кДНК как таковое с резким пиком около 175 нт.

Мы обрезали и удалили адаптеры и штрих-коды из секвенированной библиотеки, и для дальнейшего анализа были выбраны только считывания между 20 и 45 нтами. На рисунке 6 показано результирующее распределение длины. Показания были разделены на различные группы: кодирующие последовательности, интроны и интергенные последовательности (рисунок 7) и далее классифицированы, как показано на рисунке 8.

Окончательный анализ для обнаружения и характеристики котрансляционных взаимодействий проводили на основе обогащения рибосомно-защищенных фрагментов мРНК, получив графики на рисунке 9. Мы сравнили нормализованное заполнение рибосом (на каждом нуклеотиде вдоль каждого орфа) общего транслейтома с соответствующим выбранным транслейломом (зарождающимся интерактомом). Сравнение по нуклеотидам исключает артефакты скорости трансляции. Воспроизводимость между биологическими репликами оценивали по корреляции Пирсона (пороговое > 0,6). Мы представляем селективные рибосомные профили, анализирующие котрансляционные взаимодействия Vma2p с тремя белками: рибосомно-ассоциированным шапероном Ssb1p, Pfk2p (фосфофруктокиназа) и Fas1p (синтаза жирных кислот), причем каждый белок C' терминально помечен GFP. Мы выполнили протокол в биологических репликах. Рисунок 9 A, D и G показывает экспериментальную схему очистки каждого аффинности. Далее мы показываем заполненность рибосом суммарных транслейломов по сравнению с интерактомами Ssb1 вдоль Vma2p orf, кодирующими субъединицу вакуолярной H+-АТФазы (рисунок 9 B, E и H). Наконец, мы выполнили профилирование рибосом на основе соотношения (IP/Total) в каждой позиции рибосомы в [кодоне/aa] вдоль орфа (рисунок 9 C, F и I). Сравнение котрансляционных взаимодействий этих трех белков с Vma2p, который синтезируется рибосомой, показало, что шаперон Ssb1 взаимодействует с зарождающимся Vma2p в четырех различных областях вдоль orf, поскольку мы определили четыре значительных пика обогащения SeRP. Иначе говоря, Pfk2p показывает только один значительный пик обогащения, идентифицированный SeRP, в другом положении по сравнению с котрансляционным шапероном Ssb1. Анализ котрансляционных взаимодействий Fas1 с зарождающимся Vma2p не обнаружил какого-либо значительного обогащения. Таким образом, сравнение этих рибосомных профилей обогащения на основе соотношения демонстрирует силу этого протокола в обнаружении и характеристике различных котрансляционных взаимодействий в близком к кодон-разрешении.

Рисунок 2: Репрезентативный результат вестерн-блоттинга после аффинной очистки штамма BY4741 с HA-меткой Naa10. Репрезентативный результат западного пятна после аффинной очистки штамма BY4741 с HA-меткой Naa10 показывает полосу около 27,8 кДа, в то время как дикий тип, как отрицательный контроль, не показывает полосы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Репрезентативный результат BioAnalyzer после выделения следа и экстракции РНК кислотой-фенолом:хлороформом и средним размером 25 нт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Репрезентативный гель-электрофорез ПЦР-амплификации. Репрезентативный гель-электрофорез ПЦР-амплификации с полосами 2-5, нагруженными продуктами ПЦР из циклов 8-11, и лестницами с обеих сторон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Репрезентативный результат BioAnalyzer, полученный после создания библиотеки кДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Ожидаемое распределение длин чтения после удаления адаптеров с Cutadapt (удаление показаний короче 20 или длиннее 45). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Ожидаемый процент успеха выравнивания после удаления некодирующих считываний РНК с Bowtie2 и использования TopHat для выравнивания оставшихся показаний для разных организмов. Образец был взят из S. cerevisiae (мутировавший вариант BY4741). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: График, сгенерированный с помощью RiboToolkit, представляющий ожидаемое и некодирующее соотношение выровненных считываний после использования Bowtie2 для удаления элементов рРНК в считываниях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 9: Котрансляционные взаимодействия трех различных белков: Ssb1p, Pfk2p и Fas1p с Vma2p, который синтезируется рибосомой, анализируемой SeRP. Все оси y показаны в считывании считываний на миллион (RPM). (А, Д, Г) Экспериментальная схема SeRP Ssb1p, Pfk2p и Fas1p C' терминально помечена GFP соответственно. (В, Е, Н) Заполненность рибосом вдоль орфа общих транслейломов по сравнению с интерактомами Ssb1, Pfk2p и Fas1p соответственно (в биологических репликатах). (С, Ф, И) Среднее обогащение Ssb1p, Pfk2p и Fas1p (отношение IP/Total) в каждой позиции рибосомы в [кодоне/aa] вдоль orf, соответственно. На вариацию между биологическими репликами указывает затененная область. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 9: 3' Последовательности компоновщика и грунтовки. 3' Linker L1: Linker 3-L1 с 5ʹ аденилированием и 3ʹ дидезокси-цитидин уникальными молекулярными идентификаторами ('NN...') (Очистка ВЭЖХ без РНКазы; Обратный транскрипционный линкер: обратная транскрипция (L(rt)) с 5ʹ фосфорилированными, уникальными молекулярными идентификаторами (очистка ВЭЖХ без РНКазы); ПЦР форвард праймер: PCRf; ВЭЖХ очищена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительный файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.