Измерение β окисления жирных кислот в суспензии свежеизолированных гепатоцитов мыши

Окисление жирных кислот β является важным процессом в липидном обмене, обеспечивая катаболический путь для балансировки синтеза и потребления жирных кислот из рациона. Этот процесс генерирует энергию для нескольких органов, включая сердечную мышцу, кору почек и печень натощак, и использует жирные кислоты, полученные из рациона, липолиза жировой ткани и внутренних запасов триглицеридов ^1,2.

Окисление жирных кислот через β путь окисления приводит к последовательному укорочению жировой ациловой цепи двумя углеродами одновременно, высвобождаемыми в виде ацетил-КоА, и этот процесс происходит как в митохондриях, так и в пероксисомах. В то время как большинство жирных кислот подвергаются только β окислению, некоторые из них окисляются при различных углеродах, прежде чем войти в этот путь. Например, 3-метилзамещенные жирные кислоты, такие как фитановая кислота, подвергаются удалению одного углерода путем α-окисления в пероксисомах перед попаданием в β путь окисления. Аналогичным образом, некоторые жирные кислоты сначала превращаются в дикарбоновые жирные кислоты путем окисления концевой метильной группы (ω-окисление) в эндоплазматическом ретикулуме, прежде чем предпочтительно окисляются в пероксисомах путем β-окисления³.

Независимо от конкретной органеллы, жирная кислота должна быть сначала преобразована в тиоэстер коэнзима А (КоА), или ацил-КоА, для окисления через β путь окисления. β-окисление длинноцепочечных ацил-КоА в митохондриальном матриксе требует карнитинового челнока для их транслокации, где карнитин пальмитоилтрансфераза 1 (CPT1) катализирует превращение ацил-КоА в ацилкарнитины и является ферментом, ограничивающим скорость в этом процессе⁴. После перемещения в митохондриальный матрикс ацил-КоА повторно формируются и служат субстратами для митохондриального механизма β окисления. В состоянии голодания ацетил-КоА, образующийся в результате β-окисления в печеночных митохондриях, в основном направляется на кетогенез. Пероксисомы служат основным местом для β окисления очень длинноцепочечных, разветвленных и дикарбоновых жирных кислот. Пероксисомы не требуют карнитинового шаттла для импорта субстратов жирных кислот, вместо этого импортируя соответствующие ацил-КоА через активность транспортеров АТФ-связывающей кассеты (ABC) ABCD1-3⁵. Внутри пероксисом ацил-КоА затем окисляются специальным набором ферментов, отличных от митохондриальных жирных кислот β механизма окисления. Как митохондрии, так и пероксисомы также требуют поставок NAD⁺ и свободного КоА для окисления жирных ацильных цепей. Было показано, что уровни CoA в печени увеличиваются в ответ на голодание, поддерживая повышенную скорость окисления жирных кислот, которое происходит в этом состоянии⁶. Кроме того, повышенная деградация КоА в пероксисомах приводит к селективному снижению окисления пероксисомальных жирных кислот⁷. Поэтому процесс окисления жирных кислот внутри клетки регулируется уровнями экспрессии и активностью ферментов, участвующих в активации, транспорте и окислении жирных кислот, а также концентрациями кофакторов и других метаболитов в нескольких субклеточных компартментах.

Процедуры с использованием тканевых гомогенатов для измерения окисления жирных кислот разрушают клеточную архитектуру, регулирующую и поддерживающую этот процесс, что приводит к сбору данных, которые не точно отражают метаболизм in vivo. В то время как методы, использующие покрытые первичные гепатоциты, сохраняют эту систему, культивирование изолированных клеток в течение длительных периодов времени приводит к потере профиля экспрессии генов in vivo, который присутствовал в клетках, когда они все еще жили в животном ^8,9. Следующий протокол описывает способ выделения первичных гепатоцитов и анализа их способности к β окисления жирных кислот сразу после выделения и в суспензии с использованием [^1-14С]пальмитиновой кислоты. Анализ основан на измерении радиоактивности, связанной с кислоторастворимыми метаболитами (ASM) или продуктами, такими как ацетил-КоА, полученными β окисления [^1-14C]пальмитиновой кислоты^10,11.

Все экспериментальные процедуры на мышах (C57BL/6J, самцы, возраст 9-11 недель) были одобрены Институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Западной Вирджинии.

1. Выделение гепатоцитов

1. Подготовка
   1. В дни, предшествующие выделению гепатоцитов, подготавливают буферы и клеточные культуральные среды, перечисленные в таблице 1. Установите водяную баню с температурой, установленной до 37 ° C, близко к месту проведения операции.
   2. В день выделения гепатоцитов под ламинарной проточной вытяжкой переложить 35 мл буфера 1 в стерильную центрифужную трубку объемом 50 мл и 70 мл буфера 2 в стерильный стакан или флакон объемом 100 мл.
   3. Добавьте антибиотики гентамицин (50 мкг/мл) и пенициллин/стрептомицин (1x) в оба буфера.
   4. Переложить 20 мл буфера 2, приготовленного на стадии 1.1.3, в чашку для культивирования клеток толщиной 100 мм и поместить на лед.
   5. Перенесите оставшиеся 50 мл буфера 2 в стерильную центрифужную трубку объемом 50 мл. Поместите 50 мл пробирок, содержащих буферы 1 и 2 с добавлением антибиотиков, на водяную баню, установленную при 37 °C, и дайте им нагреться в течение не менее 15 минут перед началом перфузии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении нескольких выделений гепатоцитов за сеанс увеличьте количество аликвот буферов 1 и 2, дополненных антибиотиками, для подготовки соответствующим образом.
   6. Разморозить аликвоту раствора коллагеназы и держать на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При правильном хранении не происходит значительной потери активности фермента в растворах коллагеназы, замороженных и размороженных до 3 раз и используемых в течение 3 недель с момента приготовления.
   7. Подготовьте хирургические инструменты и перистальтический насос. Стерилизуют линии перистальтического насоса путем циркуляции 15 мл 70% этанола, а затем 15 мл стерильной воды.
   8. Подключите иглу 22 G к выходной линии (рисунок 1A). Полый фильтр катетера хорошо работает в качестве соединителя. Заполните линии буфером 1 и осмотрите линии, соединитель и иглу, чтобы убедиться, что пузырьки воздуха не задерживаются.

Рисунок 1: Перфузионный аппарат и перфузированная печень. (А) Перистальтический насос с выходной линией, соединенной с иглой, используемой для канюляции и перфузии печени. (B) Об успешной канюляции свидетельствует немедленное и однородное бланширование печени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Перфузия и диссоциация печени
   1. Обезболивание мыши с помощью вдыхания изофлурана с воздухом медицинского класса в качестве газа-носителя, используя 4% изофлурана для индукции и 1,5% изофлурана для поддержания анестезии. Проверьте глубину анестезии, оценив потерю педального рефлекса.
   2. Когда нет реакции на защемление пальца ноги, поместите мышь в лежачее положение на операционной доске, вытяните конечности и закрепите их на доске булавками.
   3. Обильно опрыскивайте брюшко и грудь мыши 70% этанолом.
   4. Используя щипцы, подтяните кожу и брюшную стенку возле основания живота и разрезайте сбоку, по обе стороны от средней линии и до диафрагмы, чтобы обнажить органы.
   5. Обнажите нижнюю полую вену (IVC), переместив кишечник в правую сторону и осторожно перевернув доли печени вверх. Вставьте небольшой цилиндрический объект, такой как колпачок иглы, под заднюю часть мыши, чтобы слегка наклонить IVC и облегчить его канюляцию (рисунок 1B).
   6. Запустите насос на самой низкой скорости и, с буфером 1, вставьте иглу в IVC.
   7. Перережьте воротную вену, чтобы снять давление и обеспечить дренаж буферов крови и перфузии, затем немедленно увеличьте скорость потока до 7 мл / мин. Если все сделано правильно, печень будет равномерно побледнеть в течение нескольких секунд (рисунок 1B).
   8. Для получения более стабильных результатов держите иглу в положении вручную в течение всего периода перфузии.
   9. Перфузируйте печень теплым буфером 1. Чтобы избежать попадания пузырьков воздуха, убедитесь, что линия, вставленная в трубку, содержащую буфер 1, остается непрерывно погруженной.
   10. Во время перфузии добавьте 130 мкл раствора коллагеназы в буфер 2 и перемешайте путем пипетки вверх и вниз или перемешивания с серологической пипеткой 5 мл или 10 мл.
   11. Поскольку объем в трубке, содержащей буфер 1, уменьшается примерно до 5 мл, медленно добавляйте 5 мл буфера 2 в буфер 1 путем пипетки на боковой стороне трубки. Цель состоит в том, чтобы избежать введения пузырьков воздуха в линию при переходе от буфера 1 к буферу 2.
   12. Подождите, пока объем снова уменьшится до 5 мл и медленно добавьте еще 5 мл буфера 2. Повторите еще раз. Когда буфер 2 заменяет буфер 1 и начинается диссоциация, печень будет набухать.
   13. Добавьте оставшийся буфер 2 в трубку, первоначально содержащую буфер 1. Прекратите перфузию, когда в пробирке останется около 5-10 мл буфера 2.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как буфер 2 перфузирует печень, воротная вена может быть периодически зажата щипцами в течение 5 с. Этот шаг является необязательным, но результирующее повышение давления по всей печени может улучшить ее диссоциацию и, таким образом, конечный выход гепатоцитов.
   14. Тщательно иссечь печень и переложите ее в 100-миллиметровую культуральную чашку, содержащую 20 мл ледяного буфера 2, отведенного в сторону на этапе 1.1.4.
   15. Под ламинарной вытяжкой аккуратно разбейте печень на части с помощью хирургических ножниц и пинцета.
   16. Добавьте около 20 мл ледяного M199 в суспензию гепатоцитов и отфильтруйте его через клеточный сетчатый фильтр 100 мкм с помощью поршня шприца, чтобы мягко способствовать высвобождению дополнительных гепатоцитов из более крупных кусочков печени.
   17. Вымойте 100-миллиметровую чашку для культивирования и клеточный ситечко дополнительным M199 до тех пор, пока трубка для сбора не заполнится.
   18. Центрифугировать суспензию при 50 х г в течение 2 мин при 4 °С. Осторожно аспирировать супернатант и осторожно повторно суспендировать гранулу гепатоцитов в 30 мл холодного M199 путем закручивания.
   19. Гранулирование гепатоцитов, как указано в шаге 1.2.18. Повторите стирку еще раз.
   20. Повторно суспендируют гепатоциты в 10 мл теплого M199 и определяют жизнеспособность и выход с помощью метода исключения трипанового синего и гемоцитометра¹².
   21. Разбавьте клетки в M199, нагретые до 37 ºC до конечной концентрации 1,0 х 10⁶ жизнеспособных клеток/мл и немедленно начинайте анализ.

2. Анализ β окисления жирных кислот

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ проводят в трех экземплярах, и каждая реакционная смесь содержит 750 000 клеток, 1,35 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA), 100 мкМ пальмитиновой кислоты и 0,4 мкКи [^1-14С]пальмитиновой кислоты в конечном объеме 2 мл.
ВНИМАНИЕ: Радиоактивные соединения опасны. Покупайте, обрабатывайте, храните и утилизируйте радиоактивные материалы в соответствии с институциональными, государственными и федеральными правилами.

1. Подготовка
   1. За несколько дней до анализа готовят растворы пальмитиновой кислоты и BSA (табл. 1) и хранят при -20 °C.
   2. В день анализа выполните шаги 2.1.3-2.1.9 перед началом перфузии печени.
   3. Разморозить растворы пальмитиновой кислоты и BSA. Подготовьте субстратную смесь для нескольких реакций плюс избыток 20%-30% с типичной установкой анализа, показанной в таблице 2.
   4. Aliquot 13,5 мкл раствора BSA на реакцию в микроцентрифужной трубке и нагревают до 41 °C, затем добавляют 1 мкл раствора пальмитиновой кислоты 200 мМ (BSA: молярное отношение пальмитиновой кислоты = 1:5) за реакцию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно дозировать растворы, приготовленные с использованием органических растворителей, таких как радиоактивные и нерадиоактивные растворы пальмитиновой кислоты, с пипеткой с положительным смещением и соответствующими наконечниками.
   5. Вихрь энергично и инкубируют при 41 °C, чтобы облегчить образование растворимой пальмитиновой кислоты: комплекс BSA. Вихрь изредка в течение инкубационного периода.
   6. Смесь первоначально будет мутной, но полностью прояснится после 20-30 мин инкубации при 41 °C. Держите его при температуре 41 °C до тех пор, пока не будете готовы к началу реакций.
   7. Аликвот 133 мкл 1 М хлорной кислоты в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл для остановки реакций.
      ВНИМАНИЕ: Соляная кислота является сильной кислотой и сильным окислителем. Для обработки этого соединения требуется соответствующее защитное снаряжение.
   8. Аликвота 485,5 мкл M199 на реакцию попадает в пробирку и держит ее при 37 °C для разбавления радиоактивного BSA: комплекс пальмитиновой кислоты, приготовленный на стадиях 2.1.4-2.1.6 перед началом реакций.
   9. Дозируйте 750 мкл M199 в столько же 14 мл трубки с круглым дном, сколько образцы. При желании добавляют ингибиторы β окисления жирных кислот, такие как этомоксир, ротенон и антимицин, включая контроль транспортного средства (таблица 2).
   10. Во время этапов промывания гепатоцитов, за 10-15 мин до начала реакций, переложите трубки, приготовленные на шаге 2.1.9, на встряхивающую водяную баню, установленную на 37 °C и встряхивающую при 180-200 об/мин.
2. Запуск, остановка и анализ реакций окисления жирных кислот β
   1. Если жизнеспособность гепатоцитов приемлема (обычно ≥ 75%, фиг.2), для каждой реакции переносят 0,8 мкл [^1-14С]пальмитиновой кислоты (0,5 мКи/мл) в микроцентрифужную трубку, содержащую осветленный BSA: раствор пальмитиновой кислоты (этапы 2.1.4-2.1.6). Вихрь и возвращение на водяную баню при 41 °C.
   2. Чтобы уравновесить гепатоциты до 37 °C и предварительно инкубировать их ингибиторами (если таковые имеются), сразу после окончательной ресуспенсии гепатоцитов (стадия 1.2.21) перенести 750 мкл суспензии гепатоцитов с пипеткой 1 мл в каждую из 14 мл круглодонных трубок в трясущейся водяной бане (этапы 2.1.9-2.1.10) и кратковременно вихрь на низкой скорости перемешать.
   3. Разложите каждое добавление на 30 с и высиживайте в течение 15 минут. Чтобы сохранить образец для определения белка, переведите еще одну аликвоту гепатоцитов в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и вращайтесь при 3000 х г в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время дозирования суспензию гепатоцитов необходимо непрерывно закручивать или осторожно перемешивать с помощью дозирующей пипетки 1 мл, чтобы предотвратить оседание и большую изменчивость количества клеток в образцах.
   4. Удалите супернатант и храните гранулу при -80 °C до тех пор, пока не будете готовы измерить общее количество белка в образце для нормализации результатов (рисунок 3).
   5. Пока гепатоциты находятся под предварительной инкубацией при 37 °C, добавьте радиоактивный комплекс BSA: пальмитиновой кислоты в теплую среду в 2,1,8 и держите при 37 °C до готовности к началу реакций. Это конечная субстратная смесь.
   6. Чтобы начать реакцию, удалите гепатоциты с водяной бани и добавьте 500 мкл субстратной смеси.
   7. Вихрь на низкой скорости в течение 5 с полностью суспендирует клетки и вернется на водяную баню. Повторите со всеми образцами, шатаясь на 30 с.
   8. Инкубировать в течение 15 мин. Запустите набор реакций и немедленно прекратите (см. шаги 2.2.10-2.2.11) для определения фоновой радиоактивности (таблица 2).
   9. Переложите дубликаты аликвот (200-250 мкл) оставшейся субстратной смеси в сцинтилляционные флаконы по 6 мл и отложите для подсчета. Используйте эти подсчеты для расчета радиоактивности, соответствующей общему количеству нмолей пальмитиновой кислоты, доступной для окисления в 500 мкл смеси субстрата.
   10. Чтобы остановить реакции, удалите гепатоциты с водяной бани, повторно суспендируйте гепатоциты путем вихрения с умеренной скоростью, а затем перенесите 400 мкл суспензии гепатоцитов в микроцентрифужные трубки, содержащие хлорную кислоту.
   11. Немедленно закройте трубки крышкой. Повторите эту последовательность для всех образцов, ошеломляя на 30 с.
   12. Энергично вращайте трубки микроцентрифуги объемом 1,5 мл и вращайте их вниз по микроцентрифужным трубкам объемом 1,5 мл при 13 000 х г в течение 10 минут.
   13. Перенесите 300 мкл надосадочного вещества во флакон 6 мл, добавьте 4 мл сцинтилляционной жидкости и подсчитайте радиоактивность в образцах и аликвотах смеси субстрата (стадия 2.2.9) в сцинтилляционном счетчике.
       ВНИМАНИЕ: После центрифугирования откройте трубки под вытяжным капюшоном, чтобы избежать вдыхания ¹⁴_C-CO2, образующихся при полном окислении ¹⁴C-ацетил-КоА, образующихся в результате β окисления жирных кислот и высвобождаемых кислотными условиями.

Таблица 1: Буферы, среды и другие растворы, необходимые для выделения гепатоцитов и анализа β окисления жирных кислот

Таблица 2: Пример экспериментальной установки для гепатоцитарной суспензии, анализируемой в трех экземплярах в присутствии и отсутствии этомоксира.

Перфузия печени, описанная здесь, обычно дает 30-40 миллионов клеток / печень со средней жизнеспособностью 80%, как оценивается по исключению синего трипана (рисунок 2). Типичная концентрация глюкозы в буфере Кребса-Хенселейта (KHB), который используется для приготовления перфузионных буферов 1 и 2, составляет 11 мМ. При измерении β окисления жирных кислот в гепатоцитах, выделенных у мышей натощак, концентрация глюкозы в KHB может быть снижена, чтобы лучше представить состояние натощак. Как показано на фиг.2, снижение концентрации глюкозы до 5,6 мМ не оказывает негативного влияния на выход или жизнеспособность гепатоцитов.

В таблице 2 показана типичная экспериментальная установка для суспензии гепатоцитов, анализируемой в трех экземплярах в присутствии и отсутствии этомоксира, мощного ингибитора CPT1 и, таким образом, окисления митохондриальных жирных кислот10,13. В присутствии этого или других ингибиторов окисления митохондриальных жирных кислот любые остаточные 14С-меченых продуктов, образующихся при [1-14C]окислении пальмитиновой кислоты, могут быть отнесены к первому циклу β-окисления в пероксисомах. Таким образом, вклад окисления митохондриальных жирных кислот в общее β окисления жирных кислот можно рассчитать как разницу между общим (-этомоксир) и пероксисомальным (+ этомоксир) окислением жирных кислот 7,14,15 (рис. 3).

Для гепатоцитов более 95% радиоактивности, связанной с продуктами β-окисления [1-14С]пальмитиновой кислоты, содержится в АСМ, а остальное высвобождается в виде 14С-СО210. Количество в минуту (CPM), связанное с фоновой радиоактивностью, изменяется в зависимости от партии [1-14C]пальмитиновой кислоты. Однако они по-прежнему значительно ниже, чем CPM, полученный в образцах, разрешенных для инкубации с субстратной смесью в течение 15 мин (рисунок 3A). Как и ожидалось, гепатоциты, выделенные у мышей натощак, показывают устойчивое увеличение скорости как митохондриальных, так и пероксисомальных жирных кислот β окисления, что согласуется с известной активацией этих путей 16,17,18,19.

Фиг.2: Жизнеспособность и выход гепатоцитов, выделенных с помощью процедуры, описанной в настоящем описании. Гепатоциты выделяли у самцов мышей, которых кормили ad libitum или голодали на ночь в течение 16-18 ч, со свободным доступом к воде. (A) Жизнеспособность гепатоцитов и (B) выход на печень. Данные представлены в виде среднего (баров) измерений на отдельных гепатоцитарных препаратах (кругах) ± SEM. Гепатоциты, выделенные у сытых и голодающих мышей, сравнивали с использованием непарного двуххвостого т-теста Стьюдента. * p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Жирная кислота β окислительную способность в гепатоцитах, выделенных из сытых и голодающих самцов мышей и проанализированных в суспензии. Свежеизолированные гепатоциты предварительно инкубировали с этомоксиром (45 мкМ, +Это) или ДМСО (носитель, -Это) перед добавлением субстратной смеси. (A) Общий CPM, введенный в каждом анализе и восстановленный в ASM фракции реакций, созданных для оценки фоновой радиоактивности, общей (-Eto), пероксисомальной (+Eto) и митохондриальной жирной кислоты β-окисления. Эти данные показаны до того, как была применена какая-либо коррекция (для фона, количества клеток или уровней белка) или любые другие расчеты. (В) Данные в (А) скорректированные для фона, общий объем анализа нормализованы до 1 млн жизнеспособных клеток и выражены как скорость, с которой пальмитиновая кислота окисляется в гепатоцитах, выделенных у скармливаемых и голодающих мышей. (C) Общий белок, соответствующий примерно 750 000 использованных гепатоцитов/анализов. (D) Данные в (А) скорректированы как в (В), но нормализованы до мг белка. Данные представлены в виде среднего (баров) измерений на отдельных гепатоцитарных препаратах (кругах) ± SEM. Гепатоциты, выделенные у сытых и голодающих мышей, сравнивали с использованием непарного двуххвостого т-теста Стьюдента. * p < 0,05; ** p < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.