Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Прямое перепрограммирование фибробластов мыши в меланоциты

2.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62911

⸱

27 августа 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Regenerative Medicine, Jiangsu University, 2Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Jiangsu University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем оптимизированную систему прямого перепрограммирования меланоцитов и высокоэффективную, концентрированную систему упаковки вирусов, которая обеспечивает плавное прямое перепрограммирование.

Аннотация

Потеря функции меланоцитов приводит к витилиго, что серьезно сказывается на физическом и психическом здоровье пораженных лиц. В настоящее время не существует эффективного долгосрочного лечения витилиго. Поэтому крайне важно разработать удобное и эффективное лечение витилиго. Технология регенеративной медицины для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, по-видимому, является многообещающим новым методом лечения витилиго. Это включает в себя прямое перепрограммирование клеток кожи пациента в функциональные меланоциты, чтобы помочь улучшить потерю меланоцитов у пациентов с витилиго. Однако этот метод необходимо сначала протестировать на мышах. Хотя прямое перепрограммирование широко используется, нет четкого протокола для прямого перепрограммирования в меланоциты. Более того, количество доступных факторов транскрипции ошеломляет.

Здесь представлен протокол концентрированной системы упаковки лентивируса для получения факторов транскрипции, выбранных для перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, включая Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 и Snai2. Мышиные эмбриональные фибробласты (MEF) были инфицированы концентрированным лентивирусом для всех этих факторов транскрипции для прямого перепрограммирования MEF в индуцированные меланоциты (iMels) in vitro. Кроме того, эти факторы транскрипции были проверены, и система была оптимизирована для прямого перепрограммирования на меланоциты. Экспрессия характерных маркеров меланина в iMels на уровне гена или белка была значительно повышена. Эти результаты свидетельствуют о том, что прямое перепрограммирование фибробластов в меланоциты может стать успешной новой терапевтической стратегией при витилиго и подтвердить механизм развития меланоцитов, что обеспечит основу для дальнейшего прямого перепрограммирования фибробластов в меланоциты in vivo.

Введение

Витилиго – это кожное заболевание, которое серьезно влияет на физическое и психическое здоровье пострадавших лиц. По разным причинам, включая метаболические нарушения, окислительный стресс, генерацию медиаторов воспаления, отслойку клеток и аутоиммунный ответ, функциональные меланоциты теряются, а секреция меланина прекращается, что приводит к развитию витилиго 1,2. Это состояние встречается широко и особенно проблематично на лице. Основным методом лечения является системное применение кортикостероидов и иммуномодуляторов. Фототерапия может быть использована при системных или местных заболеваниях, и существуют хирургические методы лечения, такие как перфорированная трансплантация кожи и аутологичная трансплантация меланоцитов 3,4,5. Однако пациенты, которые используют медикаментозную терапию и фототерапию, склонны к рецидивам, и эти методы лечения имеют слабые долгосрочные терапевтические эффекты. Хирургическое лечение травматично и только умеренно эффективно 2,6. Поэтому при витилиго необходима новая и эффективная терапевтическая стратегия.

Перепрограммирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) возвращает эти клетки из их терминального состояния в плюрипотентное состояние, процесс, опосредованный факторами транскрипции Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc7. Однако из-за возможности опухолегенности и длительного времени производства эта технология была встречена со скептицизмом при применении в клинических условиях8. Прямое перепрограммирование - это технология, которая заставляет один тип терминальной ячейки превращаться в другой тип терминальной ячейки9. Этот процесс достигается подходящими факторами транскрипции. Различные клетки уже были успешно перепрограммированы, включая кардиомиоциты10, нейроны11 и кохлеарные волосковые клетки12. Некоторые исследователи даже перепрограммировали ткань кожи непосредственно на месте, которая может быть использована для заживления ран13. Преимущества прямого перепрограммирования включают сокращение времени ожидания и затрат, более низкий риск развития рака, меньше этических проблем и лучшее понимание механизма, лежащего в основе определения судьбы клеток9.

Хотя метод прямого перепрограммирования широко используется, в настоящее время нет определенного метода прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, особенно из-за многочисленных факторов транскрипции, которые следует считать14,15. Факторы транскрипции, Mitf, Sox10 и Pax3, были использованы для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты14. Напротив, комбинация MITF, PAX3, SOX2 и SOX9 также использовалась для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты человека в другом исследовании15. В этом протоколе, несмотря на использование другого метода скрининга, тот же результат был получен с комбинацией Mitf, Sox10 и Pax3 для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, как описано ранее14. Разработка системы для генерации меланоцитов из других клеток кожи может обеспечить схему преобразования других клеток кожи пациентов с витилиго в меланоциты. Следовательно, крайне важно построить простой и эффективный метод для этого прямого перепрограммирования для успешной генерации меланоцитов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эта работа была одобрена Комитетом по управлению и использованию лабораторных животных в Университете Цзянсу (UJS-IACUC-AP--20190305010). Эксперименты проводились в строгом соответствии со стандартами, установленными Международной ассоциацией по оценке и аккредитации по уходу за лабораторными животными (AAALAC International). Не было никаких экспериментов с участием людей, поэтому эта работа не нуждалась в одобрении комитета по этике исследований человека. Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации о реагентах.

1. Построение концентрированной лентивирусной упаковочной системы для транскрипционных факторов

  1. Производство концентрированного вируса (рисунок 1A, B)
    1. Пластина 1,5 × 106 клеток HEK-293T в 60-миллиметровую чашку и культивируют эти клетки с нормальной средой (см. Таблицу 1) при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вирус необходимо упаковать партиями, можно использовать чашку для культивирования клеток толщиной 100 мм (подробнее см. таблицу 2).
    2. Через 24 ч убедиться, что клетки HEK-293T достигли 80-90% слияния в день трансдукции, и заменить среду 3,5 мл DMEM (150 мкл DMEM на 1см2). Оставьте клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2 в течение 2 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замещающая среда должна быть без сыворотки, чтобы клетки могли быть «голодными» для лучшей трансфекции плазмид.
    3. Готовят смесь плазмид (смесь А), содержащую 3 мкг плазмид-мишеней Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 или Snai2; 1 мкг упаковки плазмиды PMD2. G, и 2 мкг упаковочной плазмиды PSPAX2. Восполнить объем смеси А до 150 мкл с DMEM без сыворотки. Подготовьте смесь трансфекционного реагента (смесь В) путем добавления 12 мкл трансфекционного реагента (объем в два раза превышает общую массу всех плазмид) и восполните объем смеси В до 150 мкл с DMEM без сыворотки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При приготовлении смесей важно медленно добавлять жидкость, чтобы избежать пузырьков воздуха.
    4. Смешайте смесь А и перемешайте В, дав им постоять 5 мин при комнатной температуре. Инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 20-30 мин с образованием трансфекционного комплекса.
    5. Выньте клетки HEK-293T из инкубатора, замените среду DMEM + 2% FBS, добавьте смесь со стадии 1.1.4 по каплям и аккуратно перемешайте жидкость.
    6. Через 8 ч изменить среду на 3,5 мл нормальной среды. После смены среды собирают вирусный супернатант каждые 24 ч и 48 ч.
    7. Смешайте супернатанты вируса, собранные в двух разных временных точках. Центрифуга при 200 × г в течение 5 мин при 4 °С. Пропустите супернатант через фильтры 0,45 мкм и соберите его в стерильную коническую трубку объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вирус, собранный через 24 ч, можно хранить при 4 °C и смешивать с вирусом, собранным через 48 ч.
    8. Концентрировать супернатант вируса путем центрифугирования при 6000 × г при 4 °C в течение ночи (~16 ч). Убедитесь, что гранула вируса видна в нижней части конической трубки после центрифугирования.
    9. Выливайте супернатант медленно. Растворить вирусную гранулу в объеме нормальной среды, который составляет 1/100-ю объема супернатанта вируса. Используя микропипетку P1000, пипетку осторожно вверх и вниз до получения однородной смеси. Разделите концентрированный вирус на микроцентрифужные трубки по мере необходимости. Хранить при температуре −80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вирус концентрируется 100x с помощью этого метода. Концентрированный вирус (100x) может храниться >1 год при −80 °C. Избегайте повторного замораживания и оттаивания вируса.
  2. Обнаружение концентрированного титра вируса (рисунок 1С)
    1. Пластина 1 × 105 ячеек HEK-293T в одну скважину из 6-луночной пластины. Не забудьте добавить один из них в качестве отрицательного элемента управления. Культивируйте эти клетки с нормальной средой при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2.
    2. Добавляют 0,1 мкл или 0,2 мкл флуоресцентного концентрированного вируса (100x) в каждую лунку через 24 ч и добавляют 4 нг/мкл катионного полимерного трансфекционного реагента в каждую лунку. Примерно через 8-12 ч после заражения замените среду нормальной средой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения точности и эффективности обнаружения флуоресценции уровень инфицирования должен составлять 10-30%. Добавление 0,1 мкл или 0,2 мкл флуоресцентного концентрированного вируса может поддерживать эффективность инфекции в этом диапазоне. Концентрированный титр вируса может достигать 1 × 108 преобразовательных единиц (TU)/мл не менее.
    3. Примерно через 48 ч после заражения вымойте посуду 1 мл стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) для удаления мертвых клеток.
    4. Трипсинизируют эти клетки, используя 250 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА на лунку в 6-луночной пластине в течение 1 мин при комнатной температуре. Центрифуга при 200 × г в течение 5 мин при 4 °С, а затем удаляют надосадочное вещество.
    5. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 1 мл PBS, добавляют суспензию в 5 мл полистирольной трубки круглого дна и обнаруживают инфекционную эффективность флуоресценции вируса (зеленый флуоресцентный белок, GFP+) с помощью проточной цитометрии.
    6. Рассчитайте титр концентрированного вируса, используя следующую формулу: 105 (клеточный объем) × уровень инфицирования (GFP+%)/добавленный объем вируса (0,1 мкл или 0,2 мкл).

2. Прямое перепрограммирование фибробластов в меланоциты (рисунок 2А)

  1. Обмазывайте одну лунку 6-луночной клеточной культуральной пластины 1 мл 0,1% раствора желатина при комнатной температуре в течение 15-30 мин. Убедитесь, что скважина полностью покрыта 0,1% раствором желатина. Аспирировать 0,1% раствор желатина после нанесения покрытия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Готовят 0,1% раствор желатина (100 мл) следующим образом: 0,1 г желатинового порошка растворяют в 100 мл сверхчистой воды в автоклавном стеклянном флаконе и затем хранят при 4 °C не более 2 месяцев.
  2. Пластина 5 × 104 MEF в одну лунку из 6-луночной пластины, покрытой 0,1% желатина (как на стадии 2.1), и культивировать эти клетки с нормальной средой при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2 в течение ночи.
  3. Через 24 ч подтвердите, что МЭФ достигли 40-50% слияния. Замените среду обычной средой.
  4. На 0-й день достаньте концентрированный вирус из морозильной камеры и растопите вирус на льду. Рассчитайте объем добавляемого вируса с помощью экв. (1). Добавьте концентрированный вирус для шести факторов транскрипции, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 и Snai2 (см. Таблицу материалов) в каждую скважину в соответствии с расчетным объемом, а затем добавьте 4 мкг/мл катионного полимерного трансфекционного агента.
    Количество клеток (5 × 104) × 30 (множественность инфекции, MOI)/титр вируса (1)
  5. На 1-й день, через 8-12 ч после заражения, удалите среду, содержащую вирус, и замените ее свежей нормальной средой, добавив 0,5 мкг / мл пуромицина для скрининга стабильных инфицированных клеточных линий.
  6. На 2-й день, через 48 ч после заражения, замените надпочивающую среду постепенно средой перепрограммирования. Во-первых,измените 1/4 от общего объема среды и добавьте 3 мкм CHIR99021.
  7. С 3 по 7 день, в зависимости от состояния клеток, изменяют среду путем замены более высокой долей перепрограммирующей среды (см. табл. 1) постепенно, и переходят на полную перепрограммирующую среду в течение 5 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого периода пуромицин и CHIR99021 должны использоваться каждый день. Многие мертвые клетки появятся на первый и второй день смены среды перепрограммирования. Это нормально, так как клетки постепенно адаптируются к трансформации. Поэтому среду необходимо менять постепенно, чтобы обеспечить здоровую пролиферацию клеток.
  8. Для прохождения клеток добавляют 500 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА для переваривания клеток в течение 3 мин при комнатной температуре. Когда ~ 60% клеток всплывут, остановите пищеварение, добавив нормальную среду в 2 раза больше объема пищеварительного фермента. Собрать клеточную суспензию в 15 мл стерильной конической трубки, центрифугу при 200 × г в течение 5 мин при 4 °С, удалить надосадочный агент, повторно суспендировать клеточную гранулу с перепрограммирующей средой и наложить ячейки в 60 мм стерильную посуду при плотности 3 × 104/см2. Культивируйте эти клетки при 37 °C в увлажненном 5%CO2 инкубаторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С 8-го по 21-й день эти клетки субкультурируют каждые 3-5 дней и культивируют в 60-миллиметровых стерильных блюдах для расширения. Их можно культивировать, чтобы достичь по крайней мере прохода 5.

3. Оптимизация для прямого перепрограммирования и идентификации

  1. Скрининг оптимизированных факторов транскрипции
    1. Повторите шаги 2.1-2.7, каждый раз уменьшая один из шести факторов транскрипции. Заразить MEF вирусом комбинациями пяти факторов транскрипции.
    2. Через семь дней после заражения извлеките РНК этих клеток16 и проанализируйте уровни экспрессии их меланоцитарных генов с использованием ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)17 для скрининга факторов транскрипции с наибольшим влиянием на превращение в меланоциты, удаляя их один за другим (рисунок 3A).
    3. Используйте три основных фактора транскрипции, влияющих на превращение в меланоциты, чтобы заразить MEF. Повторите шаги 2.1–2.7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Через семь дней после заражения меланоцитарные гены должны быть обнаружены в этих трансформированных клетках (рисунок 3B). Информация о грунтовке для характеристики iMels приведена в таблице 3.
  2. Идентификация индуцированных меланоцитов (iMels)
    1. Используйте иммунофлуоресцентное окрашивание18 для проверки того, что iMels экспрессируют меланоцитарные белки, включая TYRP-1 и DCT (фиг.4A).
    2. Меланин-специфическое окрашивание 3,4-дигидроксифенилаланином (DOPA) (рисунок 4B)
      1. Готовят 4% параформальдегид (10 мл) следующим образом: растворяют 0,4 г порошка параформальдегида в 10 мл PBS. Поместите раствор в духовку при температуре 56 °C в течение 2 ч, чтобы способствовать растворению.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор можно хранить при температуре 4 °C не более одного месяца.
      2. Выращивайте iMels в посуде толщиной 30 мм и дважды мойте ее предварительно подогретым PBS. Добавьте 1 мл 4% параформальдегида, чтобы зафиксировать клетки в течение 20 минут, и вымойте посуду 3 раза PBS.
      3. Приготовьте 0,1% раствор для окрашивания DOPA (10 мл) непосредственно перед использованием, растворив 0,01 г порошка L-DOPA в 10 мл PBS. Поместите раствор на водяную баню при 37 °C в течение 30 мин; встряхните его несколько раз, чтобы способствовать растворению.
      4. Добавить 1 мл свежеприготовленного 0,1% раствора для окрашивания DOPA. Инкубировать в духовке при 37 °С в течение 2-5 ч. Если нет коричнево-черных частиц, продолжайте инкубировать при 37 °C еще 2 ч, но не в течение >5 ч. Проверяйте образцы каждые 30 минут.
      5. Мойте посуду 3 раза PBS в течение 1 мин каждый раз. Окрашивают ядро 1 мл раствора для окрашивания гематоксилина в течение 2 мин.
      6. Для длительного хранения обезвоживайте образцы, используя 95% этанол в течение 3 мин, а затем 100% этанол в течение 5 мин. Запечатайте блюдо ксилолом и нейтральным бальзамом.
    3. Меланин-специфическое окрашивание Массона-Фонтана (рисунок 4B)
      1. Пластину iMels в тарелку 30 мм и зафиксировать ячейки с 4% параформальдегидом в течение 20 мин; вымойте посуду 3 раза PBS.
      2. Добавьте 1 мл раствора А (раствора аммиачного серебра) из набора окрашивания Masson-Fontana (см. Таблицу материалов), поместите блюдо в темную коробку и поместите темную коробку в духовку при 56 °C на 15-40 мин.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если коричнево-черные частицы не видны через 15 мин в духовке, верните образцы в духовку с температурой 56 °C для продолжения инкубации, но не в течение >40 мин. Немного воды можно добавить в темный ящик, чтобы предотвратить высыхание.
      3. Аспирировать раствором А и промыть посуду 5-6 раз дистиллированной водой, по 1-2 мин каждый раз.
      4. Добавить 1 мл раствора В (гипо-раствор) из набора для окрашивания Массон-Фонтана и оставить посуду при комнатной температуре на 3-5 мин.
      5. Аспирировать раствором В и промыть посуду водопроводной водой 3 раза по 1 мин каждый раз.
      6. Добавить 1 мл раствора С (нейтральный красный краситель) из набора для окрашивания Masson-Fontana, и оставить посуду при комнатной температуре на 3-5 мин.
      7. Аспирировать раствор С и промыть посуду 3 раза дистиллированной водой, по 1 мин каждый раз.
      8. Добавьте 1 мл 100% этанола для быстрого обезвоживания и аспирируйте этанол через 3 мин.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашенные образцы могут храниться в течение длительного времени после герметизации ксилолом и нейтральным бальзамом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Данная статья включает протоколы концентрированной лентивирусной упаковочной системы для получения лентивируса факторов транскрипции для прямого перепрограммирования фибробластов в меланоциты и протоколы скрининга факторов транскрипции и прямого перепрограммирования меланоцитов из MEF.

Успешность концентрированного производства лентивируса оценивали путем наблюдения за интенсивностью флуоресценции GFP (рисунок 1A) или с помощью проточной цитометрии (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Качество вируса имеет решающее значение для успеха прямого перепрограммирования на меланоциты в этом протоколе. Способ упаковки и концентрирования вирусов в этом протоколе прост и легко повторяется и не опирается на какой-либо другой вспомогательный концентрированный реагент. Этот протокол можно успешно соблюдать в большинстве лабораторий. Для обеспечения качества концентрированного вируса особого внимания требуют следующие моменты. Одним из них является клеточный статус HEK-293T. Хотя клетки HEK-293T являются увековечен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Это исследование было частично поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (82070638 и 81770621) и Фонда естественных наук провинции Цзянсу (BK20180281).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05% трипсин-ЭДТАGibco25300-062при температуре -20 °°; С
0,45 μ М фильтрMilliporeSLHVR33RB
5 мл полистирольная трубка с круглым дномFalcon352052
95%/100% этанолLANBAO210106Хранится в RT
АденинSigmaA2786Исходная концентрация 40 мг/мл<бр/> Конечная концентрация 24 &; г/мл
Alexa Fluor 555 Козий антимышиный IgG2aInvitrogenA21137Разведение 1:500 для использования
антибиотиков (Pen/Strep)Gibco15140-122Хранится при -20 °deg; C
Антитело к TRP1/TYRP1МиллипорMABC592Хозяин/Изотип: Мышь IgG2a
Реакционная способность вида: Мышь/Человек
Разведение 1:200 для использования
антитела Anti-TRP2/DCTAbcamab74073Хозяин/Изотип: Кролик IgG
Реакционная способность: Мышь/Человек Разведение 1:200 для использования
CHIR99021Stemgent04-0004Исходная концентрация 10 мМ<бр/> Окончательный концентрация 3 μ M
Холерный токсинSigmaC8052Исходная концентрация 0,3 мг/мл
Конечная концентрация 20 pM
Cy3 Козий антикролик IgG (H+L)Jackson Immunoresearch111-165-144Разведение 1:500 для использования
DMEM (с высоким содержанием глюкозы)HyCloneSH30243.01Хранится при 4 ° C
DMSO SigmaD2650хранился в RT
FBSGibco10270-106хранился при температуре -20 градусов; C
Перед применением
желатинSigmaG9391инактивирован при нагревании
в плазмидах RT GFP-PURO (MITF, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 и Snai2)Hanheng Biological Technology Co., Ltd.pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325Хранится при температуре -20 ° C
ГематоксилинAbcamab220365Хранится в
RT Human EDN3American-Peptide88-5-10AИсходная концентрация 100 μ M
Конечная концентрация 0,1 μ M
HydrocortisoneSigmaH0888Стоковая концентрация 100 & микро; г/мл
Конечная концентрация 0,5 &; г/мл
L-ДОПАSigmaD9628Хранится в RT
Липофектамин 2000Инвитроген11668-019Реагент для трансфекции, хранится при 4 ° C
Набор для окрашивания Masson-FontanaSolarbioG2032Хранится при температуре 4 градуса; C
Нейтральный бальзамSolarbioG8590Хранится при температуре 4 ° C
ПараформальдегидSigmaP6148Хранение в RT
PBS (-)GibcoC10010500BTхранение в RT
Phorbol 12-миристат 13-ацетат (ТПА)SigmaP8139Исходная концентрация 1 мМ<бр/> Конечная концентрация 200 нМ
ПолибренSigmaH9268катионный полимерный реагент для трансфекции; Концентрация запаса 8 μ g/µ L
Конечная концентрация 4 нг/мкм; L
ПуромицинGibcoA11138-03хранится при -20 °°; C
Рекомбинантный человеческий bFGFInvitrogen13256-029Исходная концентрация 4 г/мл
Конечная концентрация 10 нг/мл
Рекомбинантный человеческий инсулинSigma I3536Исходная концентрация 10 мг/мл
Конечная концентрация 5&м; г/мл
Рекомбинантный человеческий SCFR& D255-SC-010Концентрация запасов 200 г/мл<бр/> Конечная концентрация 100 нг/мл
RPMI-1640Gibco11875-093Хранение при 4 ° C
ксилолсигма1330-20-7хранится в компании RT

Ссылки

  1. Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. Vitiligo. Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).
  2. Picardo, M., et al. Vitiligo. Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011(2015).
  3. Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
  4. Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
  5. Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. Surgical therapies for vitiligo. Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).
  6. Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509(2018).
  7. Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
  8. Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
  9. Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
  10. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  11. Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
  12. Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
  13. Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
  14. Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807(2014).
  15. Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891(2016).
  16. Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
  17. Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
  18. Donaldson, J. G. Immunofluorescence staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).
  19. Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Прямое перепрограммирование фибробластов мыши в меланоциты
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.