DUCT: Двойное литье смолы с последующей микрокомпьютерной томографией для 3D-анализа печени

Краткое содержание

Микрокомпьютерная томография с двойным литьем смолы, или DUCT, позволяет одновременно визуализировать, оцифровывать и сегментировать две трубчатые системы для облегчения 3D-анализа архитектуры органов. DUCT сочетает в себе ex vivo инъекцию двух рентгеноконтрастных смол с последующим микрокомпьютерным сканированием и сегментацией томографических данных.

Аннотация

Печень является самым большим внутренним органом у людей и мышей, и высокая автофлуоресценция представляет собой значительную проблему для оценки трехмерной (3D) архитектуры органа на уровне всего органа. Архитектура печени характеризуется множественными ветвящимися люменизированными структурами, которые могут быть заполнены смолой, включая сосудистые и желчные деревья, устанавливая очень стереотипный рисунок в богатой гепатоцитами паренхиме. Этот протокол описывает конвейер для выполнения микрокомпьютерной томографии с двойной смолой, или «DUCT». DUCT влечет за собой инъекцию в воротную вену и общий желчный проток с двумя различными рентгеноконтрастными синтетическими смолами с последующей фиксацией ткани. Контроль качества путем очистки одной доли или всей печени оптическим очищающим агентом позволяет проводить предварительный скрининг надлежащим образом введенных образцов. Во второй части трубопровода DUCT доля или вся печень могут быть использованы для микрокомпьютерного сканирования (микроКТ), (полу)автоматизированной сегментации и 3D-рендеринга портальных венозных и желчных сетей. MicroCT приводит к 3D-координатным данным для двух смол, что позволяет проводить качественный, а также количественный анализ двух систем и их пространственных отношений. DUCT может применяться к постнатальной и взрослой печени мыши и может быть дополнительно распространен на другие канальцевые сети, например, сосудистые сети и дыхательные пути в легких.

Введение

Литье из органной смолы - это техника, которая восходит к 17 ^веку1. Один из первых примеров современного литья смолы был выполнен на печени человека после вскрытия. Внутрипеченочные желчные протоки заполняли контрастным веществом, смешанным с желатином, с последующей визуализацией с помощью рентгеновской ^КТ2. Целью метода DUCT является визуализация, оцифровка и анализ двух трубчатых смоляных сетей в тандеме в 3D.

DUCT основан на обширных существующих знаниях односистемного литья печеночной смолы3,4,5,6,7,8 и распространяется на одновременную 3D-визуализацию и анализ двух ^{систем9}. Усовершенствованное литье одной смолы DUCT для литья двойной смолы путем смешивания двух рентгеноконтрастных смол разного контраста и введения этих смол в две разные сети, в частности в общий желчный канал и портальную жилу. DUCT может быть применен к молодым постнатальным мышам с воспроизводимыми результатами уже на 15-й день (P15). По сравнению с методами визуализации, основанными на микроскопии, основным преимуществом является то, что DUCT быстрее, без антител, а аутофлуоресценция тканей печени не мешает визуализации. Кроме того, DUCT предоставляет количественные данные, описывающие состояние люменизации, внутренний диаметр, сетевое подключение и перфузию. Дифференциация между присутствием просветообразующих клеток и их де-факто морфогенезом в трубки имеет важное значение для анализа органов, в которых проточные клетки присутствуют, но не образуют трубок, как это может быть в случае синдрома Алагилле10. Основным недостатком DUCT является ограниченное проникновение смолы, которая является вязкой и не попадает в трубки с малым калибром (<5 мкм). DUCT может применяться для любой трубчатой структуры после определения точки входа инъекции, такой как артериальная и венозная системы кровообращения, дыхательные пути, внепеченочный желчный проток или лимфатические сосуды. Таким образом, это может облегчить анализ архитектуры целых органов других тканей, таких как легкие и поджелудочная железа.

Сегментированные изображения MicroCT могут быть обработаны с использованием коммерчески доступного программного обеспечения для обработки изображений, такого как ImageJ, или специально написанных конвейеров (например, MATLAB). Печень, введенная смолой, может быть качественно проанализирована на предмет расширения сети и связности или количественно на объем, длину, ветвление, извилистость одной системы и взаимодействие между двумя системами, такое как расстояние между двумя системами или зависимость от точки ветвления (разветвляется ли система 1 в непосредственной близости от ветвления системы 2?). Трубопровод DUCT, охватывающий инъекцию смолы, микроКТ-сканирование и сегментацию данных КТ, в сочетании с подробным количественным анализом архитектурных механизмов двух трубчатых систем, может обеспечить стандарт для анализа всей печени на животных моделях.

Протокол

Протокол, описанный в этом исследовании, был одобрен и соответствует правилам и положениям о благополучии животных Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd (Стокгольмский совет по этике исследований животных). Животные, использованные в этом исследовании, были дикими или гомозиготными мутантными мышами Jag1H268Q на смешанном фоне C3H / N и C57bl6J. В исследование были включены как мужчины, так и женщины. Животных использовали на 15-й послеродовой день или во взрослом возрасте от 3 до 8 месяцев.

1. Двойные инъекции смолы

1. Подготовка
   1. Приготовьте раствор смолы. Для двойных системных впрысков смолы приготовьте как желтые, так и зеленые смолы, как описано на этапах 1.1.2-1.1.4.
   2. Приготовьте 1 мл аликвоты разбавленной смолы на мышь.
   3. Желтая смола: Разбавьте желтый силиконовый каучук (с высокой рентгенопроницаемостью) прозрачным разбавителем в разведении 3:1 для приготовления желтой смолы для инъекций.
   4. Зеленая смола: смешайте синюю силиконовую резину (неопределяемую рентгенопроницаемость) с прозрачным разбавителем в разведении 1:1 для получения синей смолы. Для получения зеленой смолы смешайте разбавленную синюю смолу с разбавленной желтой смолой в соотношении 1:1. Тщательно вихрьте зеленую смолу, пока цвет не станет однородным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Синяя смола имеет очень низкую рентгенопроницаемость, которая не обнаруживается с помощью микроКТ, что поэтому требует разбавления желтой смолой для создания двух смол с различной рентгенопастульностью.
      ВНИМАНИЕ: Смола может содержать хромат свинца, который является канцерогеном. Он производит ядовитые газы в огне. Обращайтесь с осторожностью и утилизируйте смолу как опасные отходы.
   5. Подготовьте два набора инъекций (набор инъекций No1 и набор инъекций No2) с трубками, как описано на этапах 1.1.6-1.1.11.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для взрослых мышей (>P30 (послеродовой день 30) = P30 - 2 лет) используйте инъекционный набор No1 (трубка PE10 с наружным диаметром 0,6 мм) для инъекции в общий желчный проток и инъекционный набор No2 (трубка PE50 с наружным диаметром 0,96 мм) для инъекции в воротную вену. Для молодых послеродовых мышей (до P30) приготовьте два набора инъекций No 1, один для желчных протоков и один для инъекции в воротную вену (без набора инъекций No 2, поскольку портальная вена слишком узкая, чтобы вместить трубку PE50).
   6. Для приготовления инжекционного набора No1 нарежьте 30 см трубки PE10 и растяните один конец трубки вручную, потянув его до тех пор, пока он не станет как можно более тонким (рисунок 1A,B, диаметр примерно 0,15 мм, нерастянутая трубка PE10 диаметром 0,6 мм).
   7. Вырежьте наконечник растянутой трубки PE10 по диагонали, чтобы создать скошенный наконечник (рисунок 1B).
   8. Подключите нерастянутый конец трубки PE10 к игле 30 Г (Рисунок 1А, Набор для инъекций No1).
   9. Чтобы подготовить инъекционный набор No2, отрежьте 30 см трубки PE50 и растяните один конец трубки вручную, потянув его до тех пор, пока он не станет достаточно тонким, чтобы поместиться в портальную жилу (рисунок 1A,B, приблизительно 0,7 мм, нерастянутая трубка PE50 диаметром 0,96 мм).
   10. Вырежьте наконечник растянутой трубки PE50 по диагонали, чтобы создать скошенный наконечник (рисунок 1B).
   11. Подключите нерастянутый конец трубки PE50 к игле 23 G (рисунок 1A, набор инъекций No2).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый набор инъекций может быть использован только для одной инъекции, так как смола затвердеет в шприце и трубке. Отрегулируйте размер растянутого и скошенного кончика в зависимости от размера общего желчного протока и воротной вены мыши в зависимости от ее возраста, генотипа и фенотипа. Если вы не уверены в размере и посадке трубки, вставьте трубку в соответствующий канал или сосуд после разреза и до того, как трубка будет заполнена смолой. Если трубка слишком широкая, чтобы поместиться в канале/сосуде, растяните ее дальше.
   12. Обезболить животное путем вдыхания изофлурана (первые 4% в индукционной камере и ~2% с помощью носового конуса).
   13. Поместите мышь на вентилируемую скамью на подушечку для рассечения, пока мышь дышит изофлураном через носовой конус. Убедитесь, что животное находится без сознания, с помощью метода, рекомендованного институтом / IRB, например, путем ущипывания одной из лап.
       ВНИМАНИЕ: Изофлуран может вызвать сонливость или головокружение при вдыхании и может вызвать повреждение сердечно-сосудистой системы и центральной нервной системы при длительном или повторном воздействии. Не вдыхайте его. Обрабатывайте вещество на вентилируемой скамье и в хорошо проветриваемых помещениях.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать другой метод обезболивания, если он совместим с перфузией сердца.
   14. Как только животное потеряет сознание, опрыскивайте брюшную сторону 70% этанолом, чтобы предотвратить вмешательство из шерсти.
   15. Используя кожные ножницы, разрезайте кожу, фасции и мышечный слой, начиная со средней линии брюшной полости и прорезайте до грудной полости, чтобы обнажить внутренние органы.
   16. Захватите мечевидный отросток щипцами, чтобы поднять грудину и разрезать диафрагму и грудную клетку с обеих сторон, чтобы обнажить сердце и легкие.
   17. Снимите грудную клетку, разрезав ножницами ребра с левой и правой сторон грудной клетки. Будьте особенно осторожны, чтобы не повредить печень, так как это приведет к утечке смолы.
   18. С помощью прямых щипцов потяните сердце в сторону печени и отрежьте правое предсердие.
   19. Ввести иглу бабочки (23 г), соединенную с перистальтическим перфузионным насосом, в левый желудочек. Перфицитируйте мышь транскардиально сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS) и гепарином (1 ЕД/г массы тела мыши). Перфузия в течение 3 мин со скоростью перфузии 5 мл/мин.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышь перфузируется правильно, внутренние органы станут бледными, особенно печень. Если вместо этого легкие становятся белыми, игла вводится в правый желудочек и должна быть перемещена. После перфузии мышь отчаивается и может быть удалена из носового конуса и изофлурана.
   20. Выключите насос изофлурана.
2. Инжекция смолы - Билиарная система литья смол
   1. Переместите мышь к микроскопу рассечения, живот вверх, хвост к экспериментатору и отойдите от экспериментатора. Анатомические ориентиры, представляющие интерес, изображены на рисунке 2А.
   2. Найдите нижнюю полую вену (рисунок 2А), переместив кишечник в сторону. Используйте пружинные ножницы, чтобы сделать небольшой поперечный разрез в нижней полой вене, чтобы обеспечить освобождение печеночного сосудистого давления (рисунок 2Bi).
   3. Обнажите общий желчный проток и воротную вену, как описано в шагах 1.2.4- 1.2.6.
   4. Переместите кишечник и поджелудочную железу в правую сторону (экспериментатора) с помощью фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), смоченного ватным тампоном.
   5. Переверните вентральную сторону печени к сердцу, используя смачиваемый PBS ватный тампон, чтобы обнажить висцеральную поверхность и область хилара.
   6. Найдите общий желчный проток, который проходит из хилярной области через поджелудочную железу и в кишечник в сфинктере Одди (Рисунок 2Bii, общий желчный проток, очерченный желтой пунктирной линией, черные наконечники стрел указывают на Сфинктер Одди).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что печень влажная на протяжении всей процедуры, посыпав ее PBS.
   7. Очистите окружающие ткани (площадь ~ 5 мм) от общего желчного протока с помощью прямых щипцов. Поместите шелковую шовную нить (размер 4-0, 0,17 мм, длиной 3 - 5 см) под общий желчный проток (рисунок 2Bii) и завяжите свободный узел вокруг общего желчного протока (рисунок 2Biii).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите область для узла на полпути между хилярной областью и сфинктером Одди и на некотором расстоянии от воротной вены, чтобы после того, как шов будет затянут вокруг общего желчного протока, он не мешал инъекции воротной вены.
   8. Держите пружинные ножницы плоско против общего желчного протока, чтобы сделать косой разрез к общему желчному протоку в том месте, где общий желчный проток попадает в поджелудочную железу и кишечник рядом со сфинктером Одди. (Рисунок 2Biv), желтая пунктирная линия очерчивает сфинктер области Одди, подчеркнутый черными наконечниками стрелок).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный шаг. Сделайте косой, а не поперечный разрез, и сделайте разрез; не разрывайте желчный проток. Разрезание всего желчного протока делает вставку трубки очень сложной.
   9. Непосредственно перед использованием смешайте 1 мл желтой смолы с 50 мкл отверждающего агента (путем заполнения и опорожнения шприца 1 мл) и заполните шприц Luer объемом 1 мл смесью смолы и отверждающего агента.
   10. Соедините наполненный шприц с трубкой (комплект No1). Нажмите на плунжер, чтобы полностью заполнить трубку. Убедитесь, что смесь смолы/отверждающего агента капает с кончика трубки.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте и удаляйте пузырьки в шприце и трубке для достижения наилучших результатов.
   11. С помощью щипцов выпрямите область вокруг разреза общего желчного протока и вставьте трубку в отверстие в общем желчном протоке (рисунок 2Bv), с самым длинным краем скошенного кончика вниз к дорсальной стороне желчного протока. Такая ориентация гарантирует, что смола может выйти из отверстия трубки, которое обращено вверх, в воздуховод (рисунок 2Bv).
   12. Затяните узел шелковой нити, чтобы закрепить трубку внутри общего желчного протока (рисунок 2Bvi).
   13. Введите смолу в общий желчный проток. Наблюдают за желчным пузырем и отдельными долями печени.
   14. Массируйте печень ватным тампоном, смачиваемым PBS, чтобы помочь равномерно распределить смолу. Заполненные смолой концевые ветви желчных протоков (у мышей дикого типа) слабо видны на поверхности печени.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемое время наполнения печени составляет 30 -100 с.
   15. Прекратите инъекцию смолы при появлении точек смолы на поверхности печени (рисунок 2Ci, синие наконечники стрелок) или при достижении сопротивления.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте как можно быстрее, так как смола начинает затвердевать после добавления отверждающего агента смолы. Рабочее время от добавления отверждающего агента составляет примерно 15 мин.
   16. Снимите трубку, вытащив ее из общего желчного протока, и быстро затяните шелковый узел с помощью щипцов, чтобы предотвратить утечку смолы. Отрежьте рыхлые концы шелкового шва, чтобы они не мешали инъекции воротной вены.
   17. Утилизируйте трубки, содержащие смолу и оставшуюся смолу, в опасные отходы, а иглу в отходы острых предметов.
3. Инжекция смолы - Портальное литье из венозной смолы
   1. Очистите воротную вену (площадь ~ 5 мм) от окружающих ее тканей примерно в 2 см от ее поступления в печень с помощью прямых щипцов. Поместите шелковую шовную нить (размер 4-0, 0,17 мм, длиной 3 - 5 см) под очищенный участок воротной жилы (рисунок 2Ci) и завяжите свободный узел (рисунок 2Cii).
   2. Сделайте продольный разрез в воротной вене дистально к печени и узлу (рисунок 2Ciii).
   3. Смешайте 1 мл зеленой смолы с 50 мкл отверждающего агента (путем заполнения и опорожнения шприца объемом 1 мл) и заполните шприц Luer объемом 1 мл смесью смолоотверждающего агента.
   4. Соедините заполненный шприц с трубкой (набор No2 для мышей >P30, новый набор No1 для мышей ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте и удаляйте пузырьки в шприце и трубке для достижения наилучших результатов.
   5. С помощью щипцов выпрямите воротную вену, потянув окружающие ткани в сторону экспериментатора и вставьте трубку с самым длинным краем скошенного кончика в сторону спинной стороны сосуда (рисунок 2Ciii).
   6. Затяните шелковую нить, чтобы закрепить трубку в воротной вене.
   7. Ввести смолу в воротную вену. Наблюдайте, как кровеносные сосуды заполняются смолой. Массируйте печень ватным тампоном, смачиваемым PBS, чтобы помочь равномерно распределить смолу (рисунок 2Civ).
   8. Прекратите инъекцию смолы, когда все кровеносные сосуды заполнены (концы портальных вен видны на периферии печени) или когда сопротивление будет удовлетворено.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, так как смола начинает затвердевать после добавления отверждающего агента. Рабочее время от добавления отверждающего агента составляет приблизительно 15 мин для инъекционного набора No1 и 25 мин для инъекционного набора No2.
   9. Снимите трубку, вытащив трубку из портальной вены, и быстро затяните шелковый узел с помощью щипцов, чтобы предотвратить утечку смолы.
   10. Утилизируйте трубки, содержащие смолу и оставшуюся смолу, в опасные отходы, а иглу в отходы острых предметов.
4. Рассечение и фиксация печени
   1. Рассекните всю печень, отрезав ее от окружающих тканей и диафрагмы.
   2. Осторожно поместите всю печень в пустую коническую трубку объемом 50 мл, причем вентральная сторона обращена вверх, а спинная сторона опирается на стенку конической трубки, чтобы предотвратить деформацию печени. Храните коническую трубку горизонтально в течение ночи при температуре 4 °C, чтобы смола полностью затвердела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любой контейнер, который достаточно велик, чтобы вместить печень, может быть использован вместо конической трубки объемом 50 мл. Использование контейнера с плоским дном увеличит вероятность того, что печень не деформируется.
   3. Разделите печень на отдельные доли. Сделайте выбор лепестков, которые будут использоваться для микроАКТ-анализа (1.4.4-1.4.5) или контроля качества (1.4.6-1.4.8). Необязательно используйте всю печень как для оптической очистки, так и для микроКТ, не разделяя ее на отдельные доли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Архитектура печени желчевыводящей и сосудистой систем различна в каждой доле, и поэтому необходимы соответствующие анализы долей. Оптическая очистка не препятствует микроКТ-сканированию, а мочки, используемые для контроля качества, могут быть впоследствии отсканированы с помощью микроКТ. И наоборот, образцы, отсканированные с помощью микроКТ, могут быть впоследствии оптически очищены для сравнения. Таким образом, возможен анализ всей печени. У мышей дикого типа (генетический фон C3H / C57bl6) правая медиальная доля заполняется сначала инъекциями смолы, что делает ее подходящей долей для анализа микроКТ с самой высокой воспроизводимостью. Левая боковая доля является самой большой долей, в которой, следовательно, легко провести предварительный скрининг на качество инъекции. Выбор доли (или всей печени), используемой для контроля качества и микроКТ-сканирования, зависит от животной модели и исследовательского вопроса.
   4. В проветриваемой вытяжке готовят 4% раствор формальдегида (10 -20 мл на пробирку). Зафиксируйте доли, используемые для микроКТ, 4% формальдегида на ночь при 4 °C, а затем промыть один раз PBS (10 -20 мл на тюбик).
   5. Соберите отходы формальдегида в отдельный контейнер. Держите доли печени в PBS при 4 °C для краткосрочного хранения или 70% этанола для длительного хранения. Перейдите к разделу 2: Микрокомпьютерная томография.
      ВНИМАНИЕ: Формальдегид вызывает острую токсичность при проглатывании, вдыхании или контакте с кожей. Формальдегид представляет собой легковоспламеняющуюся жидкость и пары. Это вызывает сильные ожоги кожи и повреждение глаз. Может вызвать аллергическую кожную реакцию. Смертельный исход при вдыхании (концентрированном или в порошке). Может вызвать раздражение дыхательных путей. Подозревается в возникновении генетических дефектов. Может вызвать рак. Вызывает поражение органов (глаз, центральной нервной системы). Меры предосторожности - держитесь подальше от тепла, горячих поверхностей, искр, открытого пламени и других источников возгорания. Не курить. Носите защитные перчатки и защитную одежду. В случае разлива немедленно снимите всю одежду, которая была загрязнена. При контакте с кожей: промойте загрязненный участок водой. При вдыхании: выводите человека на свежий воздух и следите за дыханием, если это удобно. Немедленно позвоните в токсикологический центр / врача. Если в глазах: промыть глаза водой в течение нескольких минут. Если есть и возможно, снимите контактные линзы.
   6. Для контроля качества зафиксируйте оставшиеся доли (по крайней мере, одну) 50% метанолом (смешанным с деионизированной водой) в течение минимум 4 ч, раскачивая при комнатной температуре, с последующим 100% метанолом в ночное раскачивание при комнатной температуре. Собирайте отходы метанола в отдельный контейнер.
      ВНИМАНИЕ: Метанол вызывает острую токсичность при проглатывании, вдыхании или контакте с кожей. Метанол представляет собой легковоспламеняющуюся жидкость и пар. Носите защитные перчатки и одежду. Избегайте дыхания при обращении и держитесь подальше от огня и тепла. Тщательно вымойте кожу после использования. В случае разлива немедленно снимите всю загрязненную одежду. Смойте кожу водой. При вдыхании: Выведите человека на свежий воздух и поддерживайте комфорт для дыхания. При вдыхании, проглатывании или воздействии вызовите токсикологический центр / врача.
   7. В вентилируемой вытяжке готовят бензиловый спирт и бензилбензоат (БА: ВВ, 1:2) (5 -10 мл на долю) раствор.
   8. Поместите долю печени в полипропиленовую трубку объемом 15 или 50 мл (в зависимости от размера доли), содержащую раствор BABB. Оставьте его раскачиваться при комнатной температуре до прозрачности. Этот шаг может занять от 2 до 16 часов в зависимости от размера доли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор BABB растворяет некоторые виды пластика. Безопасно хранить образцы в полипропиленовых трубках или стеклянной таре.
      ВНИМАНИЕ: Бензилбензоат может вызвать острую токсичность при проглатывании. Он токсичен для водной флоры и фауны с длительными последствиями. Меры предосторожности: тщательно вымойте кожу после обработки. Он вреден при проглатывании, при контакте с кожей или вдыхании. Избегайте вдыхания дыма / паров. Тщательно вымойте руки после обработки. Не ешьте, не пейте и не курите при употреблении этого продукта. При проглатывании – вызовите токсикологический центр/врача при плохом самочувствии Используйте в проветриваемых помещениях. Соберите разливы. Утилизируйте содержимое/контейнер на утвержденном заводе по утилизации отходов.
   9. Проверьте качество инъекции. Только хорошо введенная печень должна быть сканирована микроКТ.

2. Микрокомпьютерная томография

1. Пробоподготовка
   1. Приготовить 1% агарозный гель, смешав 100 мл дистиллированной воды и 1 г порошка агарозы. Поместите смесь в микроволновую печь и кипятите раствор до тех пор, пока порошок агарозы не растворится.
   2. Смягчите 1% агарозный гель до ~40 °C, чтобы избежать термического повреждения образца печени.
   3. Поместите интересующую долю (доли) в коническую трубку объемом 15 мл и заполните ее 1% агарозным гелем примерно до 2/3 от общего объема трубки. Этот шаг сводит к минимуму нежелательное движение образца во время измерения КТ.
2. Измерение КТ
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги зависят от устройства КТ, и конкретные настройки и действия могут отличаться для разных устройств и производителей КТ. В этом протоколе используемый микрокомпьютерный томограф был оснащен нанофокусной рентгеновской трубкой (180 кВ/15 Вт) и плоскопанельной динамической 41|100 (4048 px x 4048 px, размер пикселя 100 мм с биннингом 2) для измерений КТ.
   1. Установите коническую трубку объемом 15 мл с образцом на вращательную ступень устройства КТ и позвольте ему термически адаптироваться к измерительной камере в течение не менее 1 ч.
   2. Когда образец термически адаптирован, центрируйте его в поле зрения (FOV).
   3. Оптимизировать расстояния до источника-образца и образца-детектора (SSD, SDD) для достижения достаточного разрешения воксела, например, 12 мкм для образца печени взрослой мышей или 6,5 мкм для печени
   4. Установите параметры сбора (т.е. ускорение напряжения и тока, экспозиция, биннинг, усреднение) в соответствии с рекомендациями производителя КТ-устройства для достижения достаточного уровня обнаруженного сигнала. Эти параметры зависят не только от устройства КТ, но и от образца и должны быть оптимизированы для каждого образца. В Hankeova et ^al.9 настройки были следующими: ускоряющее напряжение 80 кВ, ускоряющий ток 160 мкА, время экспозиции 400 мс и 2000 изображений.
   5. Начните измерение КТ. Используйте специальное программное обеспечение для томографической реконструкции для реконструкции данных КТ.

3. Анализ и сегментация данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги зависят от программного обеспечения обработки изображений; конкретные настройки и действия могут отличаться в зависимости от используемого программного обеспечения.

1. Загрузите данные КТ: выберите команду «Файл > импорт >». Дальнейший выбор зависит от конкретного формата обрабатываемых данных КТ.
2. Используйте функцию Определение поверхности на верхней панели, чтобы сегментировать смолу в данных с помощью глобального порогового значения. В диалоговом окне определите пороговое значение с помощью оценки гистограммы, установив положение красной линии «Isovalue» для сегментирования только наполненных смолой сосудов (т.е. охватываемых желтой линией в представленной «Панели предварительного просмотра») (рисунок 3A).
3. На левой панели выберите модуль Создать ROI из Volume/CAD/Mesh , чтобы создать интересующую область (ROI) емкостей, заполненных смолой. В диалоговом окне используйте опцию Создать окупаемость инвестиций из Solid, выберите имя обрабатываемого тома и подтвердите.
4. Исключить ошибочную сегментацию шумовых кластеров в фоновой области данной окупаемости инвестиций. Отметьте эту рентабельность инвестиций на правой панели, щелкните по ней правой кнопкой мыши и выберите модуль Split ROI.
5. В диалоговом окне задайте параметр Minimum Volume [voxel] для исключения всех шумовых частиц - это значение зависит от эксперимента и данных и должно быть оптимизировано для каждого анализируемого образца (рисунок 3B).
6. Создавайте гладкие, непрерывные и твердые маски каналов без артефактов в окупаемости инвестиций, например, присутствия пузырьков воздуха или утечки смолы.
7. На левой панели используйте модуль Сглаживание, установите для параметра Прочность сглаживания значение 1 или 2 (в зависимости от отдельных данных, когда более высокие значения могут привести к деформации модели, особенно при работе с тонкими структурами). При необходимости запустите этот процесс дважды (рисунок 3C).
8. Определите и разделите отдельные трубчатые системы в сегментированной смоляной маске.
   1. Создайте отдельную рентабельность инвестиций для системы, заполненной более абсорбирующей смолой (желтая смола, используемая для инъекции общего желчного протока) с более высокими значениями интенсивности в данных КТ. Выполните процедуру, описанную в шаге 3.2. (Рисунок 3Di).
   2. Отметьте новую рентабельность инвестиций и рентабельность инвестиций в маску смолы, щелкните правой кнопкой мыши и выберите Вычесть ROI (S) и вычтите новую рентабельность инвестиций из ROI маски смолы, чтобы создать новую рентабельность инвестиций для оставшейся трубчатой системы (рисунок 3Dii, iii).
9. Экспортируйте результирующие ROI для обеих трубных систем в различных форматах, на основе предпочтений оператора, для последующей обработки в различном программном обеспечении. Кроме того, обработайте результирующие ROI в программном обеспечении объемной графики для экспорта окончательной визуализации в виде изображения или видео.

Результаты

Что делать
Успешная двойная инъекция смолы достигается, когда хорошо заполнены как внутрипеченочные желчные протоки, так и воротная сосудистая вена. В качестве этапа контроля качества очистка одной доли (например, левой боковой доли) позволяет проверить успешную инъекцию с последующей визуализацией интересующих долей. Оптически очищенная доля может быть отсканирована позже с помощью микроКТ; следовательно, можно оптически очистить всю печень. В хорошо вводимой печени мыши сосудистая ткань воротной вены должна быть заполнена смолой до тех пор, пока периферия печени и смола не будут видны в боковых ветвях (рисунок 4), и эта архитектура точно повторяется в микроКТ-сканированных и сегментированных данных. Далее хорошо введенные внутрипеченочные желчные протоки должны быть видны рядом с основными веянными ветвями воротной вены, простирающимися почти до периферии, а смола должна быть видна в основных боковых ветвях. Если контрольная доля проходит этап контроля качества, интересующие лепестки (включая оптически очищенную) могут быть отсканированы с помощью микроКТ. Результат сегментированных данных из хорошо введенной печени показан для мыши P15 (рисунок 4A, B) и взрослой мыши (рисунок 4C, D).

Чего не стоит делать
Интактная ткань печени является обязательным условием для успешной инъекции. Соблюдайте особую осторожность при разрезании брюшной полости и диафрагмы, чтобы случайно не проколоть ткань печени. Если во время этой процедуры происходит физическое повреждение печени, смола, скорее всего, вытечет во время инъекции воротной вены (рисунок 5А). Невозможно добиться хорошего введения сосудистой системы, если печень физически повреждена.

Одной из распространенных ошибок является недополнение печени смолой, что может привести к проблемам с визуализацией или анализом. Одной из причин подпитки системы является преждевременное затвердевание смолы в игле или наконечнике трубки до завершения инъекции (рисунок 5B, синие наконечники стрел, кронштейны изображают большие пузырьки). Хорошей практикой является использование одного набора инъекций для каждого животного и быстрой работы после добавления отверждающего агента в смолу. Если смола затвердевает во время инъекции (что может наблюдаться по наполовину заполненной системе, здесь на примере наполовину заполненной воротной сосудистой вены) извлеките трубку, отрежьте кончик трубки (всегда по диагонали, чтобы создать скошенный наконечник) и толкните плунжер. Если смола снова начинает капать, осторожно снова вставьте трубку и закрепите ее швом. Если смола затвердела в игле, полностью замените трубку, заполните ее смолой (избегая пузырьков), осторожно снова вставьте трубку и закрепите ее швом. Может быть сложно заменить трубку, особенно у молодых постнатальных мышей рисунок 5С, синие наконечники стрелок обозначают кровь, видимую в терминальных ветвях). Это можно наблюдать, когда кончики сосудов заполнены кровью вместо смолы. Чтобы этого избежать, убедитесь, что воротная вена (вне печени) не содержит крови перед инъекцией. Третья причина недополненной печени заключается в том, что трубка вводится слишком глубоко в печень и входит в ветвь к одной из долей. Чтобы предотвратить это, вставьте трубку на расстоянии не менее 0,5 см от входа в печень.

И наоборот, одна или обе системы переполняются смолой (рисунок 5D). Необходимо визуально контролировать печень на протяжении всей инъекции. Литье по билиарной системе со смолой является более сложной задачей, чем литье из портальной жильной смолы, поскольку заполненные смолой протоки видны только слабо на поверхности печени, и трудно оценить, когда система почти заполнена, а когда остановиться. Когда на поверхности печени появляются небольшие желтые смоляные точки (рисунок 2Ci, синий наконечник стрелки), это признак того, что желчная система полностью заполнена, и смола начинает просачиваться из протоков. Незначительная утечка смолы может быть исправлена вручную во время сегментации данных microCT (рисунок 5D, правые панели).

Если давление впрыска слишком высокое, это может привести к разрыву сосудов или протоков (рисунок 5E), необратимо повреждая архитектуру сосудов или протоков. Печень не будет пригодна для микроКТ-сканирования или анализа. Чтобы избежать переполнения смолой, оптимизируйте правильный объем и давление, используемые для впрыска в каждой модели мыши. При работе с мышами, которые столкнулись с токсичной диетой, генетической модификацией или повреждением печени, которое влияет на билиарную или венозную систему, или жесткостью печени, давление и объем инъекции, возможно, потребуется отрегулировать, поскольку объем и давление могут отличаться от мышей дикого типа. Этот протокол описывает ручной впрыск двух систем, но можно подключить шприц к насосу для стандартизации давления впрыска. Пузырьки являются еще одним очень распространенным инъекционным артефактом, который приводит к разреженному заполнению трубчатых сетей (рисунок 5F-H, синие наконечники стрелок). Чтобы избежать образования пузырьков, убедитесь, что шприц и трубка не содержат пузырьков, полностью заполнены смолой, а смола капает с кончика трубки перед инъекцией. Небольшие пузырьки, которые появляются как отрицательные области на данных microCT, могут быть вручную исправлены на этапах постобработки, хотя это трудоемко.

Свежее – лучшее
Использование свежей желтой смолы является решающим фактором, значительно влияющим на контрастность двух смол и сегментацию данных microCT. При использовании свежеоткрытой смолы (рисунок 6А) наблюдается четкое различие в контрасте между желтыми желчными протоками, вводимыми смолой (ярко-белые), и зелеными портальными прожилками, впрыскиваемыми смолой (ярко-серый). Печень, в которую вводят свежую смолу, легко обрабатывается с использованием автоматизированного глобального порогового значения. При длительном хранении смола выпадает в осадок, а контраст уменьшается. После 3 месяцев хранения контраста все еще может быть достаточно, чтобы отличить воротную вену от желчного протока (рисунок 6B), но осаждение влияет на перемешивание двух смол, которое видно как неоднородное помутнение в заполненной воротной вене (рис. 6B, синие наконечники стрел). Гетерогенный контраст негативно влияет на автоматизированное пороговое значение и требует ручной коррекции, что увеличивает время обработки. Если смола старше шести месяцев, контраст снизился до точки, в которой невозможно отличить желтый желчный проток от зеленой впрыскиваемой воротной вены на основе только их контраста (рисунок 6C). В этом случае желчный проток и портальная вена должны быть сегментированы вручную на основе их диаметра и положения в хилярной области и контролироваться вручную на протяжении всех данных микроКТ. Эта процедура чрезвычайно трудоемка и ее лучше избегать.

Рисунок 1: Набор впрыска для литья смолы. (A) Инъекционный набор No1 содержит иглу 30 Г и трубку PE10 длиной ~30 см. Инъекционный набор No2 состоит из иглы 23 Г и трубки PE50 длиной ~30 см. (B) Наконечник трубки растягивается и разрезается под углом для создания скошенного наконечника. Линейка в форматах A и B представляет собой сантиметровую линейку с большим шагом 1 см, промежуточным шагом 5 мм и незначительным шагом 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Блок-схема литья двойной смолы. (А) Схема, показывающая мышиную венозную систему кровообращения и сердце с выделенным правым предсердием, которое следует отрезать перед перфузией, и левым желудочком, в который следует ввести иглу для перфузии, чтобы смыть кровь из кровеносной системы. Нижняя полая вена должна быть разорвана под почками для снятия сосудистого давления. (B) Схема впрыска смолы желчных протоков. i) Увеличить изображение (А), изображающее, где следует разорвать IVC. (ii) Изображение, изображающее общий желчный проток (желтая пунктирная линия) от области печени до сфинктера Oddi (черные наконечники стрел), со шовной нитью под очищенным общим желчным протоком. iii) Подходящее положение для свободного узла вокруг общего желчного протока. iv) Желтая пунктирная линия и черные наконечники стрел обозначают сфинктер Одди, демонстрируя косой угол разреза и то, как должно выглядеть отверстие после разреза косого угла. v) схема, демонстрирующая ориентацию конического отверстия трубки ПЭ10 (вверх) при установке. vi) внешний вид впрыскиваемой желтой смолы; смола должна легко проходить через слабо завязанный узел. IVC, нижняя полая вена; CBD, общий желчный проток. (C) Блок-схема впрыска портальной веновой смолы. i) Зеленая пунктирная линия обозначает воротную жилу из области хилар. Синие наконечники стрелок обозначают переполненную желчную систему. ii) Подходящее место для свободного накладного узла вокруг воротной жилы. iii) схема, показывающая скосное отверстие (вверх) при вставке. iv) появление печени при инъекции зеленой смолы и желтой смолы; обратите внимание на заполненный смолой кровеносный сосуд на периферии печени. PV, портальная жила. Рисунок 2A был создан с помощью Biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Обработка данных Микро КТ в программном обеспечении объемной графики. (A) Определение поверхности, (i) завышенное изозначение (текущий предварительный просмотр выбора показан желтым цветом), (ii) заниженное изозначение, (iii) оптимальный выбор изозначения для правильного определения поверхности портальных жил и желчных протоков. (B) Расщепление интересующей области (ROI), созданное определением поверхности, (i) установить значение в диалоговом окне достаточно высоким, чтобы остался только один сегмент (самый большой), (ii) в желтых рамках показаны более мелкие (исключенные) частицы. (C) Сглаживание поверхности данных, (i) функция сглаживания находится на левой панели, (ii) установить силу сглаживания на 1 (макс. 2) и создать новую сглаженную рентабельность инвестиций, (iii) сглаженные данные. (D) Разделение отдельных трубчатых систем, (i) в функции определения поверхности установить изозначение таким образом, чтобы в выбор включалась только билиарная система (текущий предварительный просмотр выбора показан желтым цветом), (ii) отметить ROI обеих систем и ROI только билиарной системы и вычесть ROI билиарной системы из ROI обеих систем, iii) воротная вена, показанная серым цветом, билиарная система - зеленым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Хорошо введенные системы желчных протоков (BD) и портальных вен (PV). (A) Оптически очищенная правая медиальная доля (RML) печени на 15-й день (P15) вводится двумя смолами в две системы. Шкала 1 мм. (B) 3D-рендеринг P15 RML показан в (A) с изображением сосудистой системы портальных вен белым цветом и билиарной системы зеленым цветом. Шкала 1 мм. (C) Оптически очищенный RML печени взрослого человека, вводимый двумя смолами в две системы. Шкала 1 мм. (D) 3D-рендеринг взрослого RML показан в (C) с изображением сосудистой системы воротной вены в белом цвете и билиарной системы зеленым цветом. H = хилар, P = периферийный. Шкала стержня 1 мм. Панели A, B, D адаптированы с разрешения Hankeova et ^al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Общие проблемы двойных инъекций смолы в печень. (А) На изображении изображена печень, которая была случайно повреждена во время первоначального вскрытия брюшной полости, и смола просачивается через разрез (синий наконечник стрелы). (B) Плохо впрыскиваемая портальная венозная система из-за затвердевания смолой. Синие наконечники стрелок обозначают пустые концевые ветви, а красные скобки обозначают большие пузырьки. Шкала стержня 1 мм. (C) Плохо вводится портальная венозная система из-за плохой транскардиальной перфузии. Синие наконечники стрелок маркируют кровь, видимую в терминальных ветвях. Шкала стержня 1 мм. (D) Переполненная желчная система проявляется изолированными шариками смолы. Левые панели показывают оптически очищенную печень, а правые панели показывают 3D-изображение, визуализированное микроCT. Синие пунктирные контуры изображают области увеличения. Черные наконечники стрел помечают часть печени, которая была повреждена во время оптического очищения после микроCT-сканирования. Шкала стержня 1 мм. (E) Высокое давление при впрыске смолы может вызвать разрыв воротной вены (животное в этой панели несет мутацию Jag1H268Q), отмеченную синими наконечниками стрел. Шкала 1 мм. (F) Пузырьки в смоле во время впрыска в воротную вену (синие наконечники стрелок) и (G) инъекции билиарной системы (синий наконечник стрелки), шкала 1 мм. (H) МикроCT сканирование пузырьков (синий наконечник стрелки), плохо заполненные концевые ветви (красные скобки) и утечка смолы (желтый наконечник стрелки), шкала 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Дифференциальный контраст смолы. (А) Свежеоткрытая желтая смола создает достаточный контраст, чтобы различать инжекционируемую смолой портальную вену (серый) и желчные протоки (белый). (B) Трехмесячное хранение желтой смолы приводит к осаждению смолы, что приводит к неоднородной непрозрачности (серо-белая воротная жила, синий наконечник стрелки). (C) Длительное хранение (>6 месяцев) желтой смолы уменьшает контраст между воротной жилкой (серый) и желчными протоками (серый). Шкала 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Несколько критических шагов определяют успех DUCT, от подготовки образца до параметров устройства КТ. Для достижения наилучших результатов следует использовать хорошо контрастную, хорошо впрыскиваемую и безпузырьковую смолу, чтобы обеспечить простую цифровую обработку с автоматическим пороговым значением для получения 3D-данных, изображений и фильмов. При обучении и следовании этому протоколу 90% инъекций являются успешными и приводят к воспроизводимым данным. Важно использовать свежую желтую смолу для достижения наилучшего контраста между двумя инжекторными системами. Желтая смола имеет очень сильную рентгенопроницаемость, в то время как синяя смола имеет неопределяемую рентгенопроницаемость. Наилучшие результаты достигаются в течение первых трех месяцев после открытия новой бутылки с желтой смолой. Со временем смола выпадает в осадок, и после более длительного хранения (>6 месяцев) желтая и зеленая смолы больше не будут различимы на КТ. Изображения с плохой контрастностью требуют обширной и трудоемкой ручной трассировки и сегментации двух систем. Далее, хорошо растянутая трубка незаменима, чтобы вписаться в общий желчный проток взрослых мышей и общий желчный проток и воротную вену постнатальных мышей. Точка входа для инъекции должна быть создана с осторожностью. Если общий желчный проток разрезать поперечно, он, вероятно, отсоединится от окружающих тканей, препятствуя успешному проникновению трубки. Этот шаг особенно деликатный для постнатальных мышей, у которых общий желчный проток втягивается и «сворачивается», если он отделился от окружающих тканей, что делает введение трубки чрезвычайно сложным. Общий вход в желчный проток и инъекция могут потребовать некоторой практики. При приготовлении трубки со смолой и на протяжении всей инъекции избегайте образования пузырьков, так как пузырьки создадут негативное пространство на изображениях КТ и потребуют трудоемкой ручной коррекции. Важно мягко массировать печень, перекатываясь по ее поверхности смоченным ватным тампоном во время и после процедуры инъекции, так как это облегчает равномерное распространение смолы. После завершения инъекции и снятия трубки шелковый шовной узел необходимо быстро и осторожно затянуть, чтобы смола не вытекала из печени до того, как она полностью полимеризуется. Для успешной микроКТ-визуализации образец должен быть правильно закреплен на месте с помощью агарозы и термически адаптирован для устранения артефактов движения в данных КТ. Настройки сбора также имеют ключевое значение, которое должно быть оптимизировано для достижения адекватного пространственного разрешения для разрешения тонких структур.

Технические изменения в процедуре инъекции могут быть сделаны для достижения инъекции у молодых мышей. В настоящее время литье смолы молодых печени мышей ограничено наличием достаточно тонких трубок, причем PE10 является самой маленькой коммерчески доступной трубкой. Tanimizu et al. успешно ввели углеродные чернила в эмбриональный желчный проток 17 (E17) с использованием стеклянных ^{капилляров11}. Поэтому будущее тестирование того, может ли смола быть доставлена через стеклянный капилляр, будет представлять интерес. DUCT был дополнительно адаптирован для инъекции других канальцевых систем, таких как дыхательные пути и сосудистая система легочной артерии ^{легких9}. Двойное впрыскивание смолы также может быть модифицировано для использования с другими коммерчески доступными смолами, или этот протокол может быть использован для инъекций углеродными чернилами.

Одним из основных ограничивающих факторов трубопровода DUCT является вязкость смолы. DUCT может быть использован только для литья смолы трубчатых конструкций диаметром выше 5 мкм. В этом наборе данных смола могла проникать в трубы с наименьшим диаметром 5 ^мкм9. Это ограничение размера исключает анализ тонких протоков и мелких капилляров. Для дальнейшего продвижения трубопровода DUCT к сосудам меньшего калибра должны быть протестированы другие коммерчески доступные смолы, или разработка новых низковязких рентгеноконтрастных агентов может улучшить проникновение просвета.

В Hankeova et ^al.9 DUCT сравнивали с двумя другими широко используемыми методами: двойными инъекциями углеродных чернил с последующей очисткой тканей и стандартной фотографией и iDISCO+ с окрашиванием кровеносных сосудов актином альфа-гладкомышечных клеток и желчных протоков цитокератином 7, с последующей 3D-визуализацией9. DUCT превзошел два других метода с точки зрения двойного анализа (что было сложно для iDISCO+ из-за высокой аутофлуоресценции печени), 3D-визуализации и количественной оценки (невозможно при инъекции углеродных чернил) и люменизации (DUCT предоставляет данные для архитектуры внутреннего просвета и перфузии системы). Как упоминалось выше, основным ограничением DUCT является минимальный размер светового потока, который может быть введен и проанализирован (предел 5 мкм), параметр, в котором как впрыск углеродных чернил, так и iDISCO+ работали лучше. DUCT превосходит односистемное литье ^{смолы3,5,6, поскольку} позволяет анализировать каждую инжектируемую систему отдельно, а также облегчает двойное 3D-исследование для изучения архитектурных отношений между двумя системами.

DUCT может быть применен для изучения любых двух трубчатых сетей в 3D. В качестве доказательства принципа DUCT был использован для визуализации систем желчных и портальных вен печени, а также сосудистой системы и дыхательных путей легочной артерии в ^{легких9}. Внутрипеченочные желчные протоки развиваются рядом с портальной веной, а портальная вена обеспечивает структурный шаблон и сигнальный центр, который регулирует рост и дифференцировку желчевыводящего ^{дерева12}. В Hankeova et ^al.9 DUCT исследовал билиарную регенерацию в мышиной модели для детского заболевания человека синдрома Алагилле. DUCT выявил ранее неизвестные архитектурные механизмы, которые билиарная система использовала для достижения дикого типа ^тома9. Мыши с синдромом Алагилле использовали две различные стратегии: (1) в хиларной и центральной областях печени билиарная система увеличила свое ветвление, и (2) на периферии печени de novo-генерируемые желчные протоки были очень извилистыми. Эти два фактора в совокупности дали почти нормальный объем билиарной системы, несмотря на аномальную архитектуру. Кроме того, DUCT обнаружил аномальное ветвление желчных протоков, которое происходило независимо от ветвления портальных вен и желчных протоков, образующих соединительные мосты между двумя портальными ^{венами9}. Эти фенотипы было бы невозможно обнаружить при литье одной смолы и могут быть неправильно истолкованы в 2D гистологических срезах как пролиферация желчных протоков. Таким образом, DUCT предоставляет данные, описывающие 3D-архитектуру двух трубчатых сетей на уровне всего органа или доли с возможностью качественного и глубокого количественного анализа. DUCT может стать новым стандартом для анализа постнатального развития печени и регенерации печени на различных животных моделях.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1,5 мл микропробирки SafeSeal	Sarstedt	72.706
23 г игла бабочка с трубкой	BD bioscience	367283
игла 23 г BD	bioscience	305892
игла 30 г BD	bioscience	305106
агароза	Top-Bio	P045
Бензиловый спирт	Sigma Aldrich
Бензилбензоат	Sigma Aldrich	B6630
Пробирки Corning 50 мл	Sigma Aldrich	CLS430829-500EA	полипропиленовые
ватные палочки	Medicarier	60406
Диссекционный микроскоп	Leica Camera AG		Leica M60
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко	ThermoFisher Scientific
Этанол 70%	VWR	83801.41
Соколиная трубка 15 мл	Verkon	331.850.084.006
Щипцы изогнутые	Fine Science Tools	11051-10	Fine Graefe 10 см изогнутые
Щипцы прямые	Fine Science Tools	11050-10	Fine Graefe 10 см прямой
Раствор формальдегида	Sigma Aldrich	F8775
GE Phoenix v|tome|x L 240	Waygate Technologoies		микрокомпьютерный томограф
Hanks' Balanced Salt Solution	ThermoFisher Scientific	14025092
Heparin	Leo Pharma	B01AB01	5000 МКР/мл
изолфуран	Baxter	FDG9623
метанол	ThermoFisher Scientific	11413413
MICROFIL	Flowtech	MV-122	синтетическая смола желтая
MICROFIL	Flowtech	MV-120	синяя
MICROFIL	Flowtech	MV-разбавитель	прозрачная смола разбавитель
Пастеровская пипетка	Verkon	130.690.424.503
Перистальтический насос	AgnThos	010.6131.M20
phoenix программное обеспечение datos|x 2.0 Программное обеспечение	восстановления данных	Baker Hughes
Rocker	VWR	444-0142
Шелковый шов	AgnThos	14757	Черный шелк, 4-0, стерильный, 100 м
Ножницы для кожи	Fine Science Tools	14058-09	Ирис прямой наконечник 9 см
Пружинные ножницы	Fine Science Tools	15000-03	Vannas micro, прямой наконечник 2 мм
Шприц 1 мл Luer	BD бионаука	303172
трубка PE10	BD бионаука	427401
трубка PE50	BD бионаука	427411
программное обеспечение VG Studio MAX 3.3	Volume Graphics GmbH		программное обеспечение для обработки и анализа данных CT