Повышение содержания опухоли с помощью макродиссекции опухоли

Формалин-фиксированные парафиновые (FFPE) ткани, собранные как часть нормального клинического диагностического процесса и сохраненные в клинических тканевых хранилищах, представляют собой обширный ресурс для исследований на людях, включая исследования рака¹. По мере углубления нашего понимания болезней человека становится все более очевидным, что болезни, ранее считавшиеся единичными сущностями, основанными на морфологических и иммунофенотипических характеристиках, на самом деле состоят из различных молекулярных подтипов, которые требуют молекулярных субтипических анализов. Следовательно, высокочувствительные геномные анализы, способные различать эти подтипы, становятся все более важными². Хотя ткани FFPE известны тем, что плохо совместимы с геномными методами из-за проблем, связанных с фиксацией, по мере развития технологий и протоколов эти методы становятся все более совместимыми с этим клинически вездесущим форматом ^{тканей 3,4,5}. Однако ткани FFPE часто представляют собой примеси опухолевых и неопухолевых тканевых материалов, где присутствие неопухолевого материала часто нежелательно и может, если оно присутствует в высокой пропорции, значительно подорвать и повлиять на результаты геномного анализа⁶. Действительно, минимальное содержание опухоли в 60% часто используется для таких анализов, где ткани, которые не достигают этого порога, могут быть исключены, несмотря на то, что в противном случае соответствуют критериям исследования⁷. Это может быть особенно проблематично в условиях редких заболеваний, где ткани пациента драгоценны и их трудно собрать в больших количествах.

Макродиссекция – это метод, который минимизирует последствия низкого содержания опухоли за счет уменьшения количества нормальной ткани³. Удаление такого смешивающего неопухолевого материала до экстракции нуклеиновых кислот может значительно увеличить процентное содержание опухоли и, следовательно, чистоту опухоли экстрагированных нуклеиновых кислот. Резекция ткани критически полагается на экспертный патологический обзор, в котором область опухоли идентифицируется и обводится на свежегенерированном участке ткани, окрашенном гематоксилином и эозином (H & E), сертифицированным патологоанатомом⁸. Обведенный H & E затем используется для руководства удалением и сбором нежелательных и целевых тканей соответственно. Этот протокол описывает этапы макродиссекции от патологического обзора до сбора тканей, как это выполняется в лаборатории технического ядра ресурса образцов СПИДа и рака (ACSR) в клинике Майо.

Все образцы были собраны и использованы в соответствии с утвержденными протоколами IRB клиники Майо (PR16-000507 и PR2207-02).

1. Пробоподготовка

1. Включите тканевую плавающую водяную баню. Установите температуру на 39 °C и дайте воде достичь температуры. Замачивайте деревянные коллекционные палочки на водяной бане.
2. Определите и извлеките тканевые блоки FFPE, подлежащие разделению.
3. Предварительно маркировочный микроскоп скользит с использованием перманентного маркера гистологического класса, который может выдерживать промывку растворителем.
4. Используйте микротом для секционирования блоков FFPE. Вырежьте не менее 2 полнолицевых секций толщиной 4-5 мкм на секцию для каждого блока (рисунок 1А).
5. Перенесите свежеразрезанную ленту срезов ткани в предварительно нагретую тканевую плавающую ванну для монтажа на горку (рисунок 1B, C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Теплая вода помогает «сгладить» морщины на участках (рисунок 1С).
6. Обрабатывая каждую секцию последовательно, используйте щипцы, чтобы оторвать один участок от ленты (рисунок 1D).
7. Соберите одну секцию на предварительно маркированном слайде микроскопа.
   1. Погрузите предметное стекло микроскопа под углом под сечением, расположив затвор таким образом, чтобы край участка ткани касался слайда (рисунок 1E).
   2. После контакта с участком ткани медленно вытащите горку из плавающей ванны, чтобы позволить секции ткани выпрямиться вровень с горкой, когда она выходит из воды (рисунок 1F).
8. Установите 1 секцию ткани на слайд и повторяйте до тех пор, пока все секции не будут собраны.
9. Дайте срезам ткани, установленным на слайдах, тщательно высохнуть при комнатной температуре (RT).

2. Патологический обзор

1. Выполните окрашивание H&E на одном репрезентативном участке ткани для каждого блока⁹.
2. Отправьте свежеиспачканный H&Es для патологического обзора сертифицированным патологоанатомом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время обзора патологоанатом определяет и записывает процентное содержание опухоли в каждой ткани и обводит область опухоли на каждом слайде H &E (см. Рисунок 2 и Рисунок 3, Строка 1). В таблице 1 приведен процентный процент содержания опухоли по клеточности, определяемый в ходе патологического обзора H&Es для образцов A-E, показанных на рисунке 3, строка 1. Участки с содержанием опухоли <60% требуют макродиссекции⁷. Количество участков, необходимых для экстракции нуклеиновых кислот, зависит от размера обведенной опухолевой области. Если в разделе 1 протокола было вырезано недостаточное количество секций и возможны дальнейшие сокращения, то, возможно, потребуется вырезать дополнительные участки.

3. Депарафинизация

1. В вытяжной вытяжке предварительно заполните две стеклянные витражи неразбавленной гистологической маркой d-лимонен или растворителем на основе d-лимонена и 1 стеклянную витражную посуду неразбавленным 200-стойким молекулярным этанолом.
   ВНИМАНИЕ: Избегайте контакта d-лимонена с кожей и глазами, избегайте вдыхания пара или тумана и держитесь подальше от источников возгорания. Держите этанол вдали от тепла, искр и открытого огня, избегайте разливов и контакта с кожей или глазами, хорошо проветривайте и избегайте вдыхания паров.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наполните посуду достаточно, чтобы погрузить горки (рисунок 4A); Для заполнения 20-слайдовой окрашенной посуды требуется 250 мл. Замените промывки d-лимонена и этанола после каждых 40 слайдов. D-лимонен (C₁₀H₁₆) является альтернативным, столь же эффективным и менее токсичным депарафинирующим агентом ксилола, который становится все более распространенным в гистологических методологиях и дает нуклеиновые кислоты хорошего качества после экстракции 10,11,12,13,14. Хотя этот протокол может быть выполнен с использованием более биодружественных альтернатив¹⁵, их влияние, если таковое имеется, на качество экстрагированных нуклеиновых кислот еще предстоит определить.
2. Поместите незапятнанные слайды FFPE, установленные на ткани, в стеклянные слайд-стойки Coplin (рисунок 4A, вставка).
3. Погружайте стеллажные горки в промывку d-Limonene 1 на 2 мин; осторожно перемешивайте в течение первых 20 секунд.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму перенос между стирками, при извлечении стойки с горками из стирки дайте стойке ненадолго стечь, прежде чем осторожно смазать дно стойки на папиросной бумаге, чтобы удалить лишнюю стирку.
4. Погружайте стеллажные горки в неразбавленную промывку D-Лимонена 2 на 2 мин; осторожно перемешивайте в течение первых 20 секунд. Снимите, слейте воду и снова смажьте стойку.
5. Погружайте стеллажные горки в промывку этанола на 2 мин; осторожно перемешивайте в течение первых 20 секунд. Снимите стойку и поместите ее на абсорбирующую ткань для слива. Дайте горкам высохнуть на воздухе не менее 10 мин, но не более 2 ч.

3. Макродиссекция

1. На скамейке предварительно наполните стеклянную банку Coplin 50 мл 3% глицерина в воде, свободной от ДНКазы/РНКазы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Замените глицериновую стирку после каждых 40 слайдов.
2. Предварительно маркировать и предварительно заполнять микротрубки 1,5 мл 160 мкл буфера тканевого пищеварения на микротрубку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракция нуклеиновых кислот, выполняемая после макродиссекции, использовала набор для экстракции ДНК/РНК FFPE (Таблица материалов). Таким образом, тканевый буфер пищеварения, используемый в этом протоколе, содержал 10 мкл протеиназы K и 150 мкл буфера PKD.
3. Проследите патологические отметины на H&E на задней части депарафинизированных тканевых слайдов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: По сравнению с недепарафинизированными тканями (рисунок 3, строка 2 и рисунок 4B), депараффинизированные ткани имеют белый цвет и хорошо видны (рисунок 3, строка 3 и рисунок 4C). Именно эта повышенная видимость и различимость депарафинизированных тканей позволяют макродиссекции. Поместите H&E лицевой стороной вниз на скамейку и поместите переднюю часть депарафинизированного слайда против спины соответствующего патологоанатома, рассмотренного H&E (рисунок 4D). Выровняйте депарафинизированную ткань с тканью H&E (рисунок 4E). Отслеживание маркировки патологоанатома является критическим шагом в процессе макродиссекции, и следует позаботиться о том, чтобы воспроизвести эти отметки как можно точнее. Это может быть особенно сложно для небольших и/или разрозненных тканей, таких как образцы B, D и E (рисунок 3, рисунок 4E и вставка i на рисунке 4E ). Чтобы облегчить трассировку, следует использовать чернильный тонкий или ультратонкий маркер (рисунок 4E, вставка II), чтобы проследить нарисованные патологоанатомом маркировки. Салфетки с этанолом могут быть полезны для устранения ошибок и при необходимости позволяют отследить их.
4. Поверните теперь отмеченную депарафинизированную ткань слайда лицевой стороной вверх и проведите линию маркера углом чистого лезвия бритвы, чтобы предварительно срезать края области опухоли.
5. Обрабатывая каждый слайд последовательно, окуните депарафинизированные слайды в 3% раствор глицерина. Убедитесь, что ткань полностью погружена, прежде чем медленно удалять слайд (рисунок 4F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цель глицеринового погружения состоит в том, чтобы ослабить ткань, чтобы помочь сбору тканей, а также уменьшить накопление статического заряда, который может вызвать отталкивание между тканью и пластиковой микротрубкой, в которую должна быть помещена собранная ткань.
6. Аккуратно протрите заднюю часть горки салфеткой, чтобы удалить лишний раствор глицерина, и уложите горку на скамейку, протерев стороной вниз. Дайте тканям ненадолго проветриться в течение 1-2 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перенос избытка глицерина в процесс экстракции может негативно повлиять на выход и качество экстракции нуклеиновых кислот. Ткани должны быть слегка влажными, но не видимо влажными при сборе.
7. В зависимости от того, где область опухоли, представляющая интерес, расположена на слайде, используйте плоский край лезвия бритвы, чтобы либо (а) непосредственно собрать опухолевую ткань, используя бритву, чтобы соскоблить / собрать интересующую ткань со слайда, или (б) сначала удалить и выбросить неопухолевую ткань, прежде чем собирать интересующую опухолевую ткань (рисунок 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Собранная ткань имеет тенденцию собираться или сворачиваться в нижней части лезвия (рисунок 4G)
8. Используйте деревянную палочку, чтобы удалить собранную ткань из лезвия (рисунок 4H и вставка) и перенести ее в соответствующую предварительно маркированную и предварительно заполненную микропробирку (рисунок 4I).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер пищеварения служит для «вытягивания» ткани из деревянной кирки в жидкость.
9. Приступайте к экстракции нуклеиновых кислот.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракция нуклеиновых кислот была завершена с использованием набора для экстракции ДНК / РНК FFPE в соответствии с инструкциями производителя, и полученные нуклеиновые кислоты были количественно определены с использованием спектрофотометра UV-vis. Полученная РНК была запущена на цифровом анализе DLBCL90 на основе профилирования генов¹⁶.

В общей сложности было разделено 5 тканевых блоков диффузной большой В-клеточной лимфомы (DLBCL) FFPE, и полученные участки были либо макродиссечены, либо нет до экстракции нуклеиновых кислот. Извлеченная РНК была запущена на анализе DLBCL9016. Макродиссекции образцов были запущены дважды, один раз с использованием 5 мкл концентрации запаса РНК, но не более 300 нг от общего входа РНК и один раз с использованием 5 мкл запаса РНК, разбавленного для соответствия входам РНК их соответствующих нерасфеченных аналогов. Результаты DLBCL90 приведены в таблице 2.

DLBCL состоит из 3 различных подтипов клеток происхождения (COO) с различной терапевтической реакцией, а именно GCB, ABC и промежуточной группы, известной как неклассифицированная или UNC17,18. Транслокации с участием MYC, BCL2 и или BCL6 отдельно или в комбинации (двойное или тройное попадание) также часто наблюдаются в DLBCL, особенно в подтипе GCB19. Анализ DLBCL90 является расширением своего предшественника, клинического анализа Lymph2Cx, и, таким образом, способен определять подтип DLBCL COO, но был в основном разработан для идентификации образцов, содержащих транслокации двойного попадания (DH) с участием BCL2 с использованием цифровой экспрессии генов в качестве альтернативы флуоресцентной гибридизации in-situ (FISH)16,20. Результаты в таблице 2 показывают, что макродиссекция изменила либо coo, либо статус DHITsig требует 60% (3/5) исследуемых образцов.

Макродиссекция образца A не повлияла на вызов COO, но изменила вызов DHITsig с NEG на UNCLASS, и это изменение наблюдалось независимо от макрорассектированного входа РНК образца и с аналогичными показателями вероятности (0,224, 0,254). Напротив, макродиссекция образца C не повлияла на вызов DHITsig, но изменила вызов COO с GCB на UNC. Опять же, это изменение наблюдалось независимо от макрорассектированного входа образца РНК. Однако при 0,117 вероятность вызова главного операционного директора была ближе к порогу вызова 0,1 для макрорассектированной выборки с уменьшенным входом РНК. Подобно образцу A, макродиссекция образца E не повлияла на вызов COO, но изменила вызов DHITsig. Однако для образца E вызов изменился с UNCLASS на NEG и сделал это независимо от макрораспределенного образца РНК с достаточно похожими вероятностными вызовами (0,849, 0,833). Примечательно, что это изменение вызова на DHITsig NEG имеет биологический смысл, учитывая, что образец E был обнаружен в ABC-DLBCL, а транслокации двойного попадания с участием BCL2, как сообщается, наблюдаются исключительно в GCB-DLBCL19.

Рисунок 1: Создание скользящих участков ткани с использованием микротома. (A) Тканевый блок FFPE удерживается на месте микротомным патроном и разрезается для получения ленты последовательных участков ткани FFPE. (B) С помощью предварительно пропитанных деревянных палочек лента собирается из микротома и переносится на ванну с теплой водой. (C) Тепло воды помогает сгладить складки в тканевой ленте. (D) Отдельные участки ткани FFPE удаляются из тканевой ленты путем размещения закрытых щипцов на стыке двух секций и осторожного открытия щипцов, что отделяет участки друг от друга. (E) Секции собираются из воды путем погружения стеклянной горки под углом и осторожного перемещения стороны к сечению ткани до тех пор, пока край секции не коснется стеклянного предметного стекла. (F) Как только слайд и секция соприкасаются, медленно извлеките горку из воды, позволяя участку ткани упасть вровень с горкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Патология и гистологический обзор окрашенных участков гематоксилина и эозина (H & E). (A, B) Участок ткани H & E подвергается микроскопическому обзору сертифицированным патологоанатомом. (С,Г) Как только патологоанатом осмотрел всю ткань и обнаружил, что это не 100% опухолевая ткань, патологоанатом будет использовать маркер для окружения опухолевой области ткани. (Э,Ф) Удержание маркированного H & E против исходного тканевого блока FFPE показывает, что не вся ткань является опухолевым материалом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Образцы тканей. Это изображение демонстрирует патологически рассмотренные и помеченные опухолью H&Es (Ряд 1), необработанные скользящие участки тканей FFPE (Ряд 2), депарафинизированные скользящие участки тканей FFPE (Ряд 3), депарафинизированные скользящие участки ткани FFPE с патологическими маркировками, прослеживаемыми на задней части слайда (Ряд 4), депарафинизированные и макрорассекционные скользящие участки тканей FFPE (Ряд 5) для 5 образцов (A-E), используемых для демонстрации этого протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Депарафинизация и макродиссекция участков тканей FFPE: (A) В вытяжном шкафу ткани FFPE, установленные в скользящей стойке, промываются в двух промывках d-лимонена и одной промывке этанола. (В,С) После стирки весь парафин был удален, и на слайде осталась только ткань, которая теперь белая и хорошо видна по сравнению с ее предварительно промытым аналогом. (D) Депарафинизированный скользящий участок ткани помещается лицевой стороной вниз на задней части его соответствия с маркировкой H & E. (E) Маркировка опухолевой области на H & E затем прослеживается на задней части депарафинизированного слайда с использованием тонкого или ультратонкого перманентного маркера (F) Отмеченный депарафинизированный участок ткани, установленный на слайде, затем погружается в глицериновую промывку, чтобы ослабить участок ткани для сбора. Слайд медленно удаляется из глицерина, а задняя часть слайда протирается салфеткой, чтобы удалить избыток глицерина, прежде чем положить ткань слайда лицевой стороной вверх на скамейку. (G) Используя плоскую сторону чистого лезвия бритвы, ткань макрорассекается, а нежелательная ткань вне маркировки патологоанатома отбрасывается перед сбором интересующей ткани, которая собирается вдоль края лезвия. (H) Деревянная палочка используется для удаления собранной ткани с края лезвия. (I) Затем ткань переносится в предварительно маркированный буфер переваривания ткани микротрубки и готова к экстракции нуклеиновых кислот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Данные обзора патологии. В таблице показано (a) процент жизнеспособной опухоли во всем участке ткани по областям, (b) процент жизнеспособной опухоли в области, обведенной / отмеченной патологоанатомом во время обзора по клеточности, (c) предполагаемая общая клеточность опухоли всей ткани (a x b), (d) предполагаемое увеличение клеточности опухоли, достигнутое с помощью макродиссекции, (e и f) количество извлеченных 5 мкм неокрашенных участков тканей, установленных на слайдах FFPE, и результирующие концентрации РНК для соответствующих немакроссекторных и макродиссектированных образцов. % Другое относится ко всем другим тканям, присутствующим в данном образце, которые не являются опухолевой тканью и могут включать соединительную ткань, стромальные фибробласты, кровеносные сосуды, а также другие присущие стромальные элементы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Результаты цифрового анализа экспрессии генов DLBCL90. Пять образцов (A-E) были либо не макрорассекнуты, либо макрорассекнуты до того, как была выполнена экстракция нуклеиновых кислот. Полученная РНК была запущена на анализе DLBCL90, для которого максимальный входной объем РНК составляет 5 мкл. Немакроссекции образцы были запущены с использованием 5 мкл запасной РНК. Каждый макрорасщепленный образец запускали дважды с использованием (а) 5 мкл исходной РНК, если только не были возможны аликвоты 60 нг/мкл и (б) 5 мкл исходной РНК, разбавленной для соответствия концентрациям/входу их нема макрорассекционных аналогов. Суффикс _M означает, что этот образец был макрораспределен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Авторам нечего раскрывать.