Методическая статья

Визуализация динамики микротрубочек Plus-End в модели болезни Гентингтона на основе первичных фибробластов кожи человека

2.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62963

⸱

8 января 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, 2Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, 3Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency, 4Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол предназначен для визуализации микротрубочек плюс конец путем трансфекции белка EB3 для изучения их динамических свойств в первичной клеточной культуре. Протокол был реализован на первичных фибробластах кожи человека, полученных от пациентов с болезнью Гентингтона.

Аннотация

Трансфекция флуоресцентно меченым маркерным белком, представляющим интерес, в сочетании с покадровой видеомикроскопией является классическим методом изучения динамических свойств цитоскелета. Этот протокол предлагает технику первичной трансфекции фибробластов человека, которая может быть затруднена из-за специфики условий культивирования первичных клеток. Кроме того, поддержание динамических свойств цитоскелета требует низкого уровня трансфекции для получения хорошего отношения сигнал/шум, не вызывая стабилизации микротрубочек. Важно принять меры по защите клеток от светового стресса и флуоресцентного затухания красителей. В ходе нашей работы мы протестировали различные методы и протоколы трансфекции, а также различные векторы, чтобы выбрать наилучшую комбинацию условий, подходящих для исследований первичных фибробластов на людях. Мы проанализировали полученные покадровые видео и рассчитали динамику микротрубочек с помощью ImageJ. Динамика плюсов микротрубочек в разных частях клеток не одинакова, поэтому мы разделили анализ на подгруппы — центросомную область, пластинку и хвост фибробластов. Примечательно, что этот протокол может быть использован для анализа in vitro динамики цитоскелетов в образцах пациентов, что позволяет сделать следующий шаг к пониманию динамики развития различных заболеваний.

Введение

Болезнь Гентингтона (БГ) является неизлечимой нейродегенеративной патологией, вызванной геном мутации, кодирующим белок хунтингтина (HTT). HTT в первую очередь связан с везикулами и микротрубочками и, вероятно, участвует в микротрубочезависимых транспортных процессах1,2. Для изучения влияния мутантного HTT на динамику микротрубочек мы использовали визуализацию in vitro белка EB3, который регулирует динамические свойства микротрубочек путем связывания и стабилизации растущих плюсов. Для загрузки флуоресцентно меченого EB3 в фибробласты кожи человека применяли плазмидную трансфекцию. Для этого исследования мы использовали первичную культуру фибробластов, полученную из биопсии кожи пациентов с БГ.

Мутация в гене белка HTT приводит к удлинению полиглутаминового тракта3. HTT играет роль в таких клеточных процессах, как эндоцитоз4,клеточный транспорт1,2,деградация белка5и др. Существенная часть этих процессов включает в себя различные элементы клеточного цитоскелета, в том числе и микротрубочки.

Первичные клетки человека являются лучшей моделью для максимально точного воспроизведения событий, происходящих в клетках пациента. Для создания таких моделей необходимо изолировать клетки из биопсийного материала человека (например, из хирургических образцов). Полученная первичная клеточная линия подходит для изучения патогенеза с использованием различных генетических, биохимических, молекулярных и клеточных методов биологии. Также первичные клеточные культуры человека служат предшественником для создания различных трансдифференцированных и трансгенных культур6.

Однако, в отличие от увековеченных клеточных культур, существенным недостатком первичных клеток является их ограниченная проходная способность. Поэтому мы рекомендуем использовать клетки на ранней стадии прохождения (до 15). Старые культуры очень быстро вырождаются, теряя свои уникальные свойства. Таким образом, вновь полученные первичные клетки следует хранить замороженными для длительного хранения.

Первичные клеточные культуры восприимчивы к условиям культивирования. Поэтому они часто требуют уникальных подходов и оптимизации условий выращивания. В частности, первичные фибробласты кожи человека, используемые в наших экспериментах, требовательны к субстрату. Следовательно, мы использовали различные дополнительные покрытия (например, желатин или фибронектин) в зависимости от типа эксперимента.

Клеточный цитоскелет определяет форму клетки, подвижность и локомоцию. Динамика цитоскелета имеет решающее значение для многих внутриклеточных процессов как в интерфазе, так и при митозе. В частности, цитоскелеты, полимеризованные из тубулина, обладают высокодинамичными и полярными структурами, обеспечивающими моторный белково-опосредованный направленный внутриклеточный транспорт. Концы микротрубочек находятся в постоянной перестановке, фазы их сборки чередуются с фазами разборки, и такое поведение называется «динамической нестабильностью»7,8,9. Различные ассоциированные белки смещают равновесие реакции полимеризации, приводя либо к образованию полимера, либо к образованию белкового мономера. Добавление субъединиц тубулина происходит в основном на плюс-конце микротрубочек10. Семейство конечных связывающих (EB) белков состоит из трех членов: EB1, EB2 и EB3. Они служат плюс-концевыми белками (+ТИПы) и регулируют динамические свойства микротрубочек, связывая и стабилизируя их растущие плюс-концы11.

Во многих исследованиях используется микроинъекция или трансфекция флуоресцентных молекул тубулина с покадровой визуализацией и видеоанализом для визуализации микротрубочек in vitro. Эти методы могут быть инвазивными и вредными для клеток, особенно первичных клеток человека. Наиболее сложным шагом является поиск условий для трансфекции клеток. Мы попытались достичь максимально возможного уровня трансфекции, не влияя на жизнеспособность и морфологию нативных клеток. В данном исследовании применяется классический метод изучения различий в динамике микротрубочек в фибробластах кожи здоровых доноров и пациентов с болезнью Гентингтона.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Данный протокол соответствует рекомендациям Федерального научно-клинического центра физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства от 08 сентября 2015 года.

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлен обзор протокола.

1. Получение первичной культуры фибробластов кожи человека(рисунок 2)

  1. Доставьте биопсию в лабораторию в течение нескольких часов в среде Dulbecco Modified Eagle Media (DMEM), дополненной 50 мкг / мл пенициллина и 50 Ед / мл стрептомицина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсия кожи должна быть выполнена в стерильных условиях врачом после того, как пациент подписывает информированное согласие.
  2. Поместите биопсийную ткань в чашку Петри 6 см вместе с небольшим количеством среды.
  3. Используя стерильный скальпель, разрежьте образец биопсии на кусочки размером около 0,5-1 мм. Поместите 1-2 полученных фрагмента в чашку Петри размером 3,5 см и поместите стерильную крышку поверх кусочков биопсии. Медленно добавляют 1,5 мл питательной среды в следующую композицию: ДМЭМ, 50 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
  4. Культивировать фибробласты в питательной среде внутри инкубатораСО2 поддерживается при 5%СО2,37 °С, влажности 80%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Через 4-7 дней сначала кератиноциты, затем фибробласты, начинают мигрировать из ткани на дно блюда.

2. Хранение, замораживание и размораживание первичной культуры

  1. Удалите клетки из чашки для культивирования (см. пункты 3.2-3.4).
  2. Переложите клеточную суспензию на коническую трубку объемом 15 мл и центрифугу в течение 5 мин при 200 х г. Затем выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки в 900 мкл охлажденного FBS.
  3. Переложить в криоконсервационную трубку капля за каплей и добавить 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО).
  4. Поместите криозонд в низкотемпературную морозильную камеру при -80 °C. Через двадцать четыре часа переводят криовиал в жидкий азот (−196 °C) для длительного хранения.
  5. Чтобы разморозить криоконсервированные клетки, извлекают криовиал из хранилища азота и в течение 1 мин переносят 1 мл содержимого в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 9 мл транспортной среды, предварительно нагретой до 37 °C.
  6. Осторожно повторно суспендировать, а затем центрифугировать трубку в течение 5 мин при 200 х г. Выбросьте супернатант, повторно суспендируйте ячейки гранулы в необходимом объеме питательной среды и поместите их на чашку Петри необходимого диаметра.

3. Культивирование клеток

  1. Накройте дно тарелки автоклавным 0,1% раствором желатина, приготовленным в дистиллированной воде. Инкубировать в течение 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для трансфекционной визуализации следует использовать посуду со стеклянным дном (конфокальные тарелки толщиной стекла 170 мкм).
  2. Готовят культуральную среду следующего состава: ДМЭМ, дополненную 10% ФБС, 2 мМ L-аланил-L-глутамина, 50 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина. Тщательно перемешать и хранить при температуре 4 °C. Прогрейте среду до 37 °C перед добавлением в ячейки.
  3. Оцените культуру под микроскопом. Удалите среду и промойте фибробласты фосфатно-солевым раствором Dulbecco (DPBS).
  4. Добавьте в клетки 1 мл предварительно подогретого 0,25% раствора трипсина. Проверьте клетки под микроскопом, если они полностью отсоединяются от подложки. Деактивировать трипсин 1 мл питательной среды.
  5. Переложите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 мл. Центрифугируют пробирку при 200 х г в течение 5 мин, удаляют надосадочную массу и повторно суспендируют клеточную гранулу в 1 мл питательной среды.
  6. Подсчитайте количество ячеек. Рассчитают необходимое количество клеток для засева их плотностью 8-15 х 103/см2и повторно суспендируют в 2 мл питательной среды.
  7. Удалите желатиновый раствор из чашки для культивирования и сразу же добавьте 2 мл клеточной суспензии. Культивируйте фибробласты при 37 °C в инкубатореCO2.
  8. Обновляйте среду каждые 2-4 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов используйте ячейки из 4-11 проходов.

4. Трансфекция

  1. Заменить культуральную среду свежей питательной средой за 24 ч до трансфекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слияние клеток должно составлять 70-80%.
  2. Готовят ДНК-липидный комплекс исходя из площади и плотности посева клеток. Используйте трансфекционный агент на основе липосом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте плотность посева клеток как 1 х 104 ячейки / см2.
  3. Добавьте 3 мкл коммерческого трансфекционного реагента к 125 мкл оптимальной минимальной существенной среды (Opti-MEM), не содержащей антибиотиков, не касаясь стенок трубки. Осторожно повторно суспендировать.
  4. Разбавляют плазмидную ДНК (GFP-EB3), добавляя 1 мкг плазмидной ДНК к 125 мкл Opti-MEM. Осторожно повторно суспендировать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Векторная кодировка экспрессии GFP-EB311 была получена в качестве любезного подарка от доктора И. Каверина (Университет Вандербильта, Нэшвилл) с разрешения доктора А. Ахмановой (Университет Эразма, Роттердам)11.
  5. Добавьте разбавленную плазмидную ДНК в каждую пробирку разбавленного трансфекционного реагента (1:1). Инкубировать в течение 30 мин.
  6. Добавьте ДНК-липидный комплекс в 6 см чашку Петри, содержащую клетки, и перемешайте крестообразным взмахом в течение 30 с. Инкубировать клетки с трансфекционным агентом в течение 24 ч, а затем перейти на свежую среду. Анализируют эффективность трансфекции через 24 ч и 48 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: через 24 ч после трансфекции КПД составил 10-15%, а через 48 ч до 40%.

5. Подготовка к визуализации

  1. Перед живой визуализацией клеток измените культуральную среду на среду без рН-индикаторного красителя для снижения автофлуоресценции.
  2. Осторожно нанесите минеральное масло на поверхность среды, чтобы полностью покрыть среду, изолируя ее от внешней среды, чтобы уменьшить проникновениеО2 и испарение среды.
  3. Используйте ртутную лампу и масляный погружной объектив 60x или 100x с высокой числовой диафрагмой для получения изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для наблюдений in vivo микроскоп должен быть оснащен инкубатором для поддержания необходимых условий для клеток, включая нагрев стола объекта и линзы до +37 °C, закрытую камеру с подачей CO2 и поддержку уровня влажности. Используйте двойную дистиллированную воду для создания влажности. Проверьте уровень двойной дистиллированной воды перед съемкой.
  4. Поместите конфокальную чашку с клетками в держатель микроскопа перед визуализацией. Убедитесь, что тарелка и камера надежно прикреплены к держателю, чтобы избежать дрейфа во время съемки.

6. Настройка параметров изображения

  1. Выберите низкие значения экспозиции, так как свет индуцирует повреждающие клетки активные формы кислорода (АФК).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения динамики микротрубочек в фибробластах кожи человека было выбрано воздействие 300 мс.
  2. Сосредоточьтесь на интересующем объекте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для долгосрочной покадровой съемки используйте автоматическую систему стабилизации фокусировки для компенсации возможного сдвига вдоль оси Z.
  3. Выберите оптимальные условия визуализации в зависимости от фоточувствительности клеток и скорости затухания фторхрома.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку микротрубочки являются высокодинамичными структурами, можно выбрать достаточно короткий временной интервал, а частота кадров должна быть достаточно высокой. Для исследования динамики микротрубочек в фибробластах кожи мы использовали с частотой 1 кадр/с в течение 3-5 мин.
  4. При выборе следующего объекта для получения изображения отойдите от уже изображенной области. Так как эта область находилась под воздействием света, будет заметно фотоотбеливание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку использовалась относительно высокая частота изображения, затвор не закрывался между изображениями, и лампа горела в течение всего периода изображения, из-за чего затухание увеличивалось.
  5. Выбрать оптимальное видео для визуального изучения динамики микротрубочек с учетом качества трансфекции, качества изображений микротрубочек (оптимальное отношение сигнал/шум) и отсутствия дрейфа в случае анализируемой ячейки(рисунок 3).
  6. Используйте выбранные видео для изучения динамики плюсов микротрубочек, отслеживая их в программе ImageJ или Fiji(рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкции по количественному анализу см. в дополнительном рисунке 2 и дополнительном файле 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Полученные фильмы GFP-EB3, созданные с использованием протокола(рисунок 1),иллюстрируют динамические свойства микротрубочек. Микротрубочки участвуют в различных клеточных процессах, и их динамические свойства влияют на различные жизненные характеристики первичной культуры клеток человека из биопсийного материала пациента(рисунок 2).

Динамическую нестабильность микротрубочек определяют следующие параметры: темпы роста (полимеризация) и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Более качественные результаты анализа динамики микротрубочек могут быть получены из высококачественных микроскопических изображений. Важно соблюдать все необходимые условия для покадровой визуализации живых клеток и правильно корректировать параметры визуализации. Важно использовать специальные блюда для клеточных культур со стеклянным дном (конфокальные блюда), так как стекло имеет иной показатель преломления света, чем пластик. Толщина стекла и его однородность по всей площади также чрезвычайно важны, так как эти парам...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Данное исследование финансировалось Министерством науки и высшего образования Российской Федерации, грант No 075-15-2019-1669 (трансфекция фибробластов), Российским научным фондом, грант No 19-15-00425 (все остальные работы по выращиванию фибробластов in vitro). Она была частично поддержана программой развития МГУ им. М.В. Ломоносова PNR5.13 (визуализация и анализ). Авторы признают поддержку Центра передового опыта «Никон» при Институте физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского. Мы хотим выразить особую благодарность Екатерине Таран за помощь в озвучивании. Авторы также благодарят Павла Беликова за помощь в монтаже видео. Рисунки в рукописи были созданы с BioRender.com.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Измерительные приборысильно>
фотоаппарат iXon DU897 EMCCDТехнология Andor Eppendorf
Centrifuge 5804 REppendorf Корпоративный
набор флуоресцентных фильтров HYQ FITCNikonАльтернатива: Leica, Olympus, Zeiss
LUNA-II Automated Cell CounteLogos BiosystemsL40002
Микроскоп-инкубатор для пожизненной киносъемкиOkolabРегулятор температуры H301-T-UNIT-BL-PLUS
Газовый контроллер CO2-O2-UNIT-BL
Объектив CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)NikonАльтернатива: Leica, Olympus, Zeiss
Широкопольный флуоресцентный микроскоп Eclipse Ti-ENikon: Leica, Olympus, Zeiss
Software
Fiji (Image J версии 2.1.0/1.53c)открытым исходным кодом для обработки изображений
NIS ElementsАльтернатива Nikon: Leica, Olympus, Zeiss
Дополнительные реагентысильносильно>
Минеральное масло (светлое белое масло)MPЧашка
Cell Culture
Cell Culture DishSPL Lifesciences20035
Конфокальная чашка (толщина стекла 170 и микро; m)SPL Lifesciences211350Альтернатива: MatTek
Коническая центрифужная трубкаSPL Lifesciences50015
Криогенные флаконыCorning-Costar430659
Микроцентрифужная трубкаГнездо 615001
Cultivation
Lipofectamine 3000 Реагент для трансфекцииThermo Fisher ScientificL3000001
ДиметилсульфоксидPanEkofigure-materials-1135
DMEM (модифицированная среда Dulbecco's EaglePanEkoC420figure-materials-2
DPBS (Dulbecco's фосфатно-солевой раствор)PanEkoP060figure-materials-3
Фетальная бычья сыворотка (FBS)ГиклонK053/SH30071.03
Желатин (бычья кожа)PanEkofigure-materials-4070
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050038
Opti-MEM (1x) + GlutamaxGibco519850026
пенициллин-стрептомицинPanEkoA063figure-materials-5
Trypsin-EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific25200072
Transfection
Плазмидная ДНК с помощью EB3-GFPЛюбезный подарок д-ра И. Кавериной [Университет Вандербильта, Нэшвилл] с разрешения д-ра А. Ахмановой
[Университет Эразма, Роттердам] Степанова		и др., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003
Nikon Альтернатива Программное обеспечение с для клеточных культур 151694)

Ссылки

  1. Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
  2. Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).
  3. MacMillan, J. C., et al. Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation. The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).
  4. Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus. Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).
  5. Steffan, J. S., et al. The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).
  6. Nekrasov, E. D., et al. Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).
  7. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  8. Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
  9. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).
  10. Allen, C., Borisy, G. G. Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella. Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).
  11. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  12. Shelden, E., Wadsworth, P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).
  13. O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).
  14. Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).
  15. Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).
  16. Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration. International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).
  17. van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
  18. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  19. Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).
  20. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy. PLoS One. 11 (7), 0158884(2016).
  21. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).
  22. Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

EB3ImageJ

Похожие статьи