Методическая статья

Визуализация динамики микротрубочек Plus-End в модели болезни Гентингтона на основе первичных фибробластов кожи человека

2.2K просмотров

DOI:

10.3791/62963

8 января 2022 г.

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол предназначен для визуализации микротрубочек плюс конец путем трансфекции белка EB3 для изучения их динамических свойств в первичной клеточной культуре. Протокол был реализован на первичных фибробластах кожи человека, полученных от пациентов с болезнью Гентингтона.

Аннотация

Трансфекция флуоресцентно меченым маркерным белком, представляющим интерес, в сочетании с покадровой видеомикроскопией является классическим методом изучения динамических свойств цитоскелета. Этот протокол предлагает технику первичной трансфекции фибробластов человека, которая может быть затруднена из-за специфики условий культивирования первичных клеток. Кроме того, поддержание динамических свойств цитоскелета требует низкого уровня трансфекции для получения хорошего отношения сигнал/шум, не вызывая стабилизации микротрубочек. Важно принять меры по защите клеток от светового стресса и флуоресцентного затухания красителей. В ходе нашей работы мы протестировали различные методы и протоколы трансфекции, а также различные векторы, чтобы выбрать наилучшую комбинацию условий, подходящих для исследований первичных фибробластов на людях. Мы проанализировали полученные покадровые видео и рассчитали динамику микротрубочек с помощью ImageJ. Динамика плюсов микротрубочек в разных частях клеток не одинакова, поэтому мы разделили анализ на подгруппы — центросомную область, пластинку и хвост фибробластов. Примечательно, что этот протокол может быть использован для анализа in vitro динамики цитоскелетов в образцах пациентов, что позволяет сделать следующий шаг к пониманию динамики развития различных заболеваний.

Введение

Болезнь Гентингтона (БГ) является неизлечимой нейродегенеративной патологией, вызванной геном мутации, кодирующим белок хунтингтина (HTT). HTT в первую очередь связан с везикулами и микротрубочками и, вероятно, участвует в микротрубочезависимых транспортных процессах1,2. Для изучения влияния мутантного HTT на динамику микротрубочек мы использовали визуализацию in vitro белка EB3, который регулирует динамические свойства микротрубочек путем связывания и стабилизации растущих плюсов. Для загрузки флуоресцентно меченого EB3 в фибробласты кожи человека применяли плазмидную трансфекцию. Для этого исследова....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Данный протокол соответствует рекомендациям Федерального научно-клинического центра физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства от 08 сентября 2015 года.

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлен обзор протокола.

1. Получение первичной культуры фибробластов кожи человека(рисунок 2)

  1. Доставьте биопсию в лабораторию в течение нескольких часов в среде Dulbecco Modified Eagle Media (DMEM), дополненной 50 мкг / мл пенициллина и 50 Ед / мл стрептомицина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсия кожи должна быть в....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Полученные фильмы GFP-EB3, созданные с использованием протокола(рисунок 1),иллюстрируют динамические свойства микротрубочек. Микротрубочки участвуют в различных клеточных процессах, и их динамические свойства влияют на различные жизненные характеристики первичной культуры клеток человека из биопсийного материала пациента(рисунок 2).

Динамическую нестабильность микротрубочек определяют следующие параметры: темпы роста (полимеризация) и.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Более качественные результаты анализа динамики микротрубочек могут быть получены из высококачественных микроскопических изображений. Важно соблюдать все необходимые условия для покадровой визуализации живых клеток и правильно корректировать параметры визуализации. Важно использовать специальные блюда для клеточных культур со стеклянным дном (конфокальные блюда), так как стекло имеет иной показатель преломления света, чем пластик. Толщина стекла и его однородность по всей площади также чрезвычайно важны, так как эти парам.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Данное исследование финансировалось Министерством науки и высшего образования Российской Федерации, грант No 075-15-2019-1669 (трансфекция фибробластов), Российским научным фондом, грант No 19-15-00425 (все остальные работы по выращиванию фибробластов in vitro). Она была частично поддержана программой развития МГУ им. М.В. Ломоносова PNR5.13 (визуализация и анализ). Авторы признают поддержку Центра передового опыта «Никон» при Институте физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского. Мы хотим выразить особую благодарность Екатерине Таран за помощь в озвучивании. Авторы также благодарят Павла Беликова за помощь в монтаже видео. Рисунки в рукописи были созда....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Измерительные приборысильно>
фотоаппарат iXon DU897 EMCCDТехнология Andor Eppendorf
Centrifuge 5804 REppendorf Корпоративный
набор флуоресцентных фильтров HYQ FITCNikonАльтернатива: Leica, Olympus, Zeiss
LUNA-II Automated Cell CounteLogos BiosystemsL40002
Микроскоп-инкубатор для пожизненной киносъемкиOkolabРегулятор температуры H301-T-UNIT-BL-PLUS
Газовый контроллер CO2-O2-UNIT-BL
Объектив CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)NikonАльтернатива: Leica, Olympus, Zeiss
Широкопольный флуоресцентный микроскоп Eclipse Ti-ENikon: Leica, Olympus, Zeiss
Software
Fiji (Image J версии 2.1.0/1.53c)открытым исходным кодом для обработки изображений
NIS ElementsАльтернатива Nikon: Leica, Olympus, Zeiss
Дополнительные реагентысильносильно>
Минеральное масло (светлое белое масло)MPЧашка
Cell Culture
Cell Culture DishSPL Lifesciences20035
Конфокальная чашка (толщина стекла 170 и микро; m)SPL Lifesciences211350Альтернатива: MatTek
Коническая центрифужная трубкаSPL Lifesciences50015
Криогенные флаконыCorning-Costar430659
Микроцентрифужная трубкаГнездо 615001
Cultivation
Lipofectamine 3000 Реагент для трансфекцииThermo Fisher ScientificL3000001
ДиметилсульфоксидPanEkofigure-materials-1135
DMEM (модифицированная среда Dulbecco's EaglePanEkoC420figure-materials-2
DPBS (Dulbecco's фосфатно-солевой раствор)PanEkoP060figure-materials-3
Фетальная бычья сыворотка (FBS)ГиклонK053/SH30071.03
Желатин (бычья кожа)PanEkofigure-materials-4070
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050038
Opti-MEM (1x) + GlutamaxGibco519850026
пенициллин-стрептомицинPanEkoA063figure-materials-5
Trypsin-EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific25200072
Transfection
Плазмидная ДНК с помощью EB3-GFPЛюбезный подарок д-ра И. Кавериной [Университет Вандербильта, Нэшвилл] с разрешения д-ра А. Ахмановой
[Университет Эразма, Роттердам] Степанова
и др., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003
Nikon Альтернатива Программное обеспечение с для клеточных культур 151694)

Ссылки

  1. Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
  2. Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

EB3ImageJ

Похожие статьи