Этот протокол предназначен для визуализации микротрубочек плюс конец путем трансфекции белка EB3 для изучения их динамических свойств в первичной клеточной культуре. Протокол был реализован на первичных фибробластах кожи человека, полученных от пациентов с болезнью Гентингтона.
Методическая статья
Визуализация динамики микротрубочек Plus-End в модели болезни Гентингтона на основе первичных фибробластов кожи человека
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Трансфекция флуоресцентно меченым маркерным белком, представляющим интерес, в сочетании с покадровой видеомикроскопией является классическим методом изучения динамических свойств цитоскелета. Этот протокол предлагает технику первичной трансфекции фибробластов человека, которая может быть затруднена из-за специфики условий культивирования первичных клеток. Кроме того, поддержание динамических свойств цитоскелета требует низкого уровня трансфекции для получения хорошего отношения сигнал/шум, не вызывая стабилизации микротрубочек. Важно принять меры по защите клеток от светового стресса и флуоресцентного затухания красителей. В ходе нашей работы мы протестировали различные методы и протоколы трансфекции, а также различные векторы, чтобы выбрать наилучшую комбинацию условий, подходящих для исследований первичных фибробластов на людях. Мы проанализировали полученные покадровые видео и рассчитали динамику микротрубочек с помощью ImageJ. Динамика плюсов микротрубочек в разных частях клеток не одинакова, поэтому мы разделили анализ на подгруппы — центросомную область, пластинку и хвост фибробластов. Примечательно, что этот протокол может быть использован для анализа in vitro динамики цитоскелетов в образцах пациентов, что позволяет сделать следующий шаг к пониманию динамики развития различных заболеваний.
Введение
Болезнь Гентингтона (БГ) является неизлечимой нейродегенеративной патологией, вызванной геном мутации, кодирующим белок хунтингтина (HTT). HTT в первую очередь связан с везикулами и микротрубочками и, вероятно, участвует в микротрубочезависимых транспортных процессах1,2. Для изучения влияния мутантного HTT на динамику микротрубочек мы использовали визуализацию in vitro белка EB3, который регулирует динамические свойства микротрубочек путем связывания и стабилизации растущих плюсов. Для загрузки флуоресцентно меченого EB3 в фибробласты кожи человека применяли плазмидную трансфекцию. Для этого исследова....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Данный протокол соответствует рекомендациям Федерального научно-клинического центра физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства от 08 сентября 2015 года.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлен обзор протокола.
1. Получение первичной культуры фибробластов кожи человека(рисунок 2)
- Доставьте биопсию в лабораторию в течение нескольких часов в среде Dulbecco Modified Eagle Media (DMEM), дополненной 50 мкг / мл пенициллина и 50 Ед / мл стрептомицина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсия кожи должна быть в....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Полученные фильмы GFP-EB3, созданные с использованием протокола(рисунок 1),иллюстрируют динамические свойства микротрубочек. Микротрубочки участвуют в различных клеточных процессах, и их динамические свойства влияют на различные жизненные характеристики первичной культуры клеток человека из биопсийного материала пациента(рисунок 2).
Динамическую нестабильность микротрубочек определяют следующие параметры: темпы роста (полимеризация) и.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Более качественные результаты анализа динамики микротрубочек могут быть получены из высококачественных микроскопических изображений. Важно соблюдать все необходимые условия для покадровой визуализации живых клеток и правильно корректировать параметры визуализации. Важно использовать специальные блюда для клеточных культур со стеклянным дном (конфокальные блюда), так как стекло имеет иной показатель преломления света, чем пластик. Толщина стекла и его однородность по всей площади также чрезвычайно важны, так как эти парам.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Данное исследование финансировалось Министерством науки и высшего образования Российской Федерации, грант No 075-15-2019-1669 (трансфекция фибробластов), Российским научным фондом, грант No 19-15-00425 (все остальные работы по выращиванию фибробластов in vitro). Она была частично поддержана программой развития МГУ им. М.В. Ломоносова PNR5.13 (визуализация и анализ). Авторы признают поддержку Центра передового опыта «Никон» при Институте физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского. Мы хотим выразить особую благодарность Екатерине Таран за помощь в озвучивании. Авторы также благодарят Павла Беликова за помощь в монтаже видео. Рисунки в рукописи были созда....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Измерительные приборысильно> | |||
| фотоаппарат iXon DU897 EMCCD | Технология Andor Eppendorf | ||
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf Корпоративный | ||
| набор флуоресцентных фильтров HYQ FITC | Nikon | Альтернатива: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Микроскоп-инкубатор для пожизненной киносъемки | Okolab | Регулятор температуры H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Газовый контроллер CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Объектив CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Альтернатива: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Широкопольный флуоресцентный микроскоп Eclipse Ti-E | Nikon | : Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J версии 2.1.0/1.53c) | открытым исходным кодом для обработки изображений | ||
| NIS Elements | Альтернатива Nikon | : Leica, Olympus, Zeiss | |
| Дополнительные реагентысильносильно> | |||
| Минеральное масло (светлое белое масло) | MP | Чашка | |
| Cell Culture | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Конфокальная чашка (толщина стекла 170 и микро; m) | SPL Lifesciences | 211350 | Альтернатива: MatTek |
| Коническая центрифужная трубка | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Криогенные флаконы | Corning-Costar | 430659 | |
| Микроцентрифужная трубка | Гнездо 615001 | ||
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Реагент для трансфекции | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Диметилсульфоксид | PanEko |  135 | |
| DMEM (модифицированная среда Dulbecco's Eagle | PanEko | C420 | |
| DPBS (Dulbecco's фосфатно-солевой раствор) | PanEko | P060 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Гиклон | K053/SH30071.03 | |
| Желатин (бычья кожа) | PanEko | 070 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| пенициллин-стрептомицин | PanEko | A063 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Плазмидная ДНК с помощью EB3-GFP | Любезный подарок д-ра И. Кавериной [Университет Вандербильта, Нэшвилл] с разрешения д-ра А. Ахмановой [Университет Эразма, Роттердам] Степанова | и др., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
Ссылки
- Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
- Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение