Method Article

Пробоподготовка и относительное количественное определение с использованием восстановительного метилирования аминов для исследований пептидомики

DOI:

10.3791/62971

⸱

November 4th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP), 2Biodiversity of Coastal Environments Postgraduate Program, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается метод пробоподготовки, основанный на тепловой инактивации для сохранения эндогенных пептидов, избегающих деградации посмертно, с последующим относительным количественным определением с использованием изотопной маркировки плюс LC-MS.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пептидомику можно определить как качественный и количественный анализ пептидов в биологическом образце. Его основные применения включают идентификацию пептидных биомаркеров заболевания или экологического стресса, идентификацию нейропептидов, гормонов и биологически активных внутриклеточных пептидов, обнаружение антимикробных и нутрицевтических пептидов из гидролизатов белка и могут быть использованы в исследованиях для понимания протеолитических процессов. Недавний прогресс в подготовке образцов, методах разделения, методах масс-спектрометрии и вычислительных инструментах, связанных с секвенированием белка, способствовал увеличению числа идентифицированных пептидов и характеризуемых пептидов. Пептидомические исследования часто анализируют пептиды, которые естественным образом генерируются в клетках. Здесь описан протокол пробоподготовки, основанный на термоинактивации, который исключает активность протеазы и экстракцию в мягких условиях, поэтому нет расщепления пептидных связей. Кроме того, показано относительное количественное определение пептидов с использованием метки стабильных изотопов путем восстановительного метилирования аминов. Этот метод маркировки имеет некоторые преимущества, поскольку реагенты коммерчески доступны, недороги по сравнению с другими, химически стабильны и позволяют анализировать до пяти образцов за один прогон LC-MS.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

«Омические» науки характеризуются глубоким анализом набора молекул, таких как ДНК, РНК, белки, пептиды, метаболиты и т.д. Эти крупномасштабные наборы данных (геномика, транскриптомика, протеомика, пептидомика, метаболомика и т. д.) произвели революцию в биологии и привели к продвинутому пониманию биологических процессов1. Термин пептидомика начал вводиться в начале 20 века, и некоторые авторы называли его ветвью протеомики2. Однако пептидомика имеет отличительные особенности, где основной интерес заключается в исследовании содержания естественно генерируемых пептидов в ходе клеточных процессов, а также характе....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующая процедура экстракции пептидов и восстановительного метилирования была адаптирована из ранее опубликованных процедур24,25,26,27. Этот протокол следовал руководящим принципам Национального совета по контролю за экспериментами на животных (CONCEA) и был одобрен Комиссией по этике использования животных (CEUA) в Институте бионауки Государственного университета Сан-Паулу. Шаги протокола показаны на рисунке 1.

ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте все водные растворы в сверхчистой воде.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Результаты, полученные в результате запусков, проведенных на масс-спектрометре, хранятся в необработанных файлах данных, которые могут быть открыты в программном обеспечении масс-спектрометра. В спектрах MS можно наблюдать пиковые группы, представляющие меченые пептиды по используемой схеме маркировки, начиная от 2-5 меток. Например, на рисунке 2 пары пиков, обнаруженных в хроматографическое время, представлены в эксперименте, где в двух разных образцах в одном и том же прогоне использовалис.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В большинстве исследований пептидомики одним из критических этапов, без сомнения, является пробоподготовка, которую следует тщательно выполнять, чтобы избежать присутствия пептидных фрагментов, генерируемых протеазами через несколько минут после вскрытия. Первоначальные исследования экстрактов мозга, полученных из образцов, не включенных в микроволновую печь, показали большое количество фрагментов белка, присутствующих в микрофильтратах 10 кДа. Для предотвращения деградации белка были описаны различные подходы, позволяющ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конкурирующих финансовых интересов не существует.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разработка и использование методов, описанных здесь, были поддержаны грантом Бразильского национального исследовательского совета 420811/2018-4 (LMC); Гранты Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) и 21/01286-1 (MEME). Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке статьи.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Отсечные фильтры 10 кДаMerck MilliporeUFC801024Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Мембрана, 10 кДа
ацетонSigma-Aldrich179124
ацетонитрилSigma-Aldrich1000291000
бикарбонат аммонияSigma-Aldrich11213
аналитическая колонка (EASY-Column)EASY-Column(SC200)  10 см, ID75 и микро; м, 3 и микро; m, C18-A2
Этил3-аминобензоат метансульфонатSigma-AldrichE10521MS-222
ФлуорескаминSigma-AldrichF9015
Раствор формальдегидаSigma-Aldrich252549
sup>13C, d2, растворSigma-Aldrich596388
Formaldehyde-d2 растворSigma-Aldrich492620
Муравьиная кислотаSigma-Aldrich33015
Вытяжной шкафQuimisQ216
Соляная кислота - HClSigma-Aldrich258148
LoBind-Protein удерживающие пробиркиEppendorfEP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap VelosThermo Fisher ScientificLTQ Velos
Микроволновая печьPanasonicNN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLCThermo Fisher ScientificLC140
PEAKS StudioBioinformatics Solutions Inc.ВЕРСИЯ 8.5
Фосфатно-солевой буферInvitrogen3002таблетки
для предварительной колонки (EASY-Column)Thermo Fisher Scientific(SC001)2 см, ID100 &; М, 5 и микро; m, C18-A1
Охлаждаемая центрифугаHermleZ326Kдля конических пробирок
Охлаждаемая центрифугаVisionVS15000CFNIIдля микропробирок
Обратно-фазовые очистные колонны    (Картридж Oasis HLB 1 куб. см)Воды186000383Оазис HLB 1 мл Картридж
Цианобородетерид натрия - NaBD3CNSigma-Aldrich190020
Цианоборогидрид натрия - NaBH3CNSigma-Aldrich156159
Sodium phosphate двухосновнойSigma-AldrichS9763ПРИМЕЧАНИЕ: 0,2 М PB= 0,1 М фосфатный буфер pH 6,8 (26,85 мл Na<суб>2HPO<суб>3 1М) плюс 0,1 М фосфатный буфер pH 6,8 (23,15 мл NaH2PO3 1M) до 250 мл воды
Одноосновной фосфат натрияS3139
SonicatorQsonica QsonicaQ55-110
Стандартная пептиднаяProteimax: LTLRTKL
Триэтиламмониевый буфер - TEAB 1 MSigma-AldrichT7408
Трифторуксусная кислота - TFASigma-AldrichT6508
Ультраочищенная водаMilli-QDirect-Q 3UV
Вакуумная центрифугаGeneVacMiVac Концентратор
Водяная баняCientec266
Xcalibur Программное обеспечениеThermoFisher ScientificOPTON-30965
Формальдегид-< аминокислотная последовательность ДНК

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of 'omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
  2. Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
  3. Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Peptidomics StudiesReductive MethylationIsotopic LabelingPeptide QuantitationSample PreparationMass SpectrometryPeptide ExtractionHeat InactivationNeuroblastoma CellsPeptide Biomarkers

Related Articles