Методическая статья

Программное количественное измерение толщины остеоартритной субхондральной кости

DOI:

10.3791/62973

⸱

18 марта 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Harrington Laboratory for Molecular Orthopedics, Department of Orthopedic Surgery, University of Kansas Medical Center, 2Division of Sports Medicine, Department of Orthopedic Surgery, University of Kansas Medical Center, 3Department of Biochemistry & Molecular Biology, University of Kansas Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой методологической статье представлен программный протокол количественного измерения для количественной оценки толщины гистологической субхондральной кости в мышиных остеоартритных коленных суставах и нормальных коленных суставах в качестве контроля. Этот протокол очень чувствителен к тонкому утолщению и подходит для обнаружения ранних остеоартритных субхондральных изменений кости.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Утолщение субхондральной кости и склероз являются основными признаками остеоартрита (ОА), как у животных моделей, так и у людей. В настоящее время тяжесть гистологического субхондрального утолщения кости в основном определяется системами полуколичественной классификации на основе визуальной оценки. В этой статье представлен воспроизводимый и легко выполняемый протокол количественного измерения толщины субхондральной кости в мышиной модели ОА колена, вызванной дестабилизацией медиального мениска (DMM). Этот протокол использовал программное обеспечение ImageJ для количественной оценки толщины субхондральной кости на гистологических изображениях после определения области интереса в медиальном мыщелке бедренной кости и медицинском плато большеберцовой кости, где субхондральное утолщение кости обычно происходит при ОА коленного сустава, вызванного DMM. В качестве контроля использовались гистологические снимки коленных суставов с фиктивной процедурой. Статистический анализ показал, что недавно разработанная количественная субхондральная система измерения костной ткани была высоковоспроизводимой с низкой внутри- и межнаблюдательной изменчивостью. Результаты показывают, что новый протокол более чувствителен к тонкому или мягкому утолщению субхондральной кости, чем широко используемые системы визуальной классификации. Этот протокол подходит для выявления как ранних, так и прогрессирующих остеоартритных субхондральных изменений кости и для оценки эффективности in vivo лечения ОА в сочетании с классификацией хряща ОА.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Остеоартрит (ОА), характеризующийся рентгенографически сужением суставного пространства из-за потери суставного хряща, остеофитов и склероза субхондральной кости (SCB), является наиболее распространенной формой артрита1,2. Хотя роль перисуставной кости в этиологии ОА до конца не изучена, образование остеофита и scB-склероз обычно считаются результатами процесса заболевания, а не причинными факторами, но изменения в перисуставной костной архитектуре / форме и биологии могут способствовать развитию и прогрессированию OA3,4 . Разработка точной и легко выполняемой системы классификации ОА, включая измерение SCB, имеет решающее значение для сравнительных исследований среди исследовательских лабораторий и для оценки эффективности терапевтических агентов, предназначенных для предотвращения или ослабления прогрессирования ОА.

SCB построен с тонкой куполообразной костной пластиной и нижележащим слоем трабекулярной кости. Пластина SCB представляет собой кортикальную пластинку, лежащую параллельно и непосредственно под кальцинированным хрящом. Мелкие ветви артериальных и венозных сосудов, а также нервы проникают по каналам в пластине SCB, сообщаясь между кальцинированным хрящом и трабекулярной костью. Субхондральная трабекулярная кость содержит кровеносные сосуды, сенсорные нервы, костный мозг и является более пористой и метаболически активной, чем пластина SCB. Поэтому SCB выполняет амортизирующие и поддерживающие функции, а также важен для снабжения питательными веществами хряща и обмена веществ в нормальных суставах5,6,7,8.

Утолщение SCB (в гистологии) и склероз (в рентгенографии) являются основными отличительными чертами ОА и ключевыми областями исследований патофизиологии ОА. Измерение утолщения SCB является важным компонентом гистологических оценок тяжести ОА. Ранее сообщалось о цифровой микрорадиографии для измерения минеральной плотности SCB грызунов9, а также количественное измерение SCB на основе микрокомпьютерной томографии (micro-CT) на моделях грызунов OA10,11,12,13 улучшили наше понимание структуры SCB и роли изменений SCB в патофизиологии OA. Площадь и толщина SCB также были количественно определены с помощью гистологических слайдов с использованием сложной компьютерной системы со специальным и дорогостоящим программным обеспечением для гистоморфометрии кости14. Тем не менее, в настоящее время полуколичественные системы оценки ОА, в том числе сгущение SCB, используются более широко, чем микро-КТ, поскольку системы классификации просты в использовании, особенно для скрининга многочисленных гистологических изображений. Однако большинство существующих систем классификации ОА сосредоточены главным образом на изменениях хряща15,16,17. Широко используемый остеоартритный метод классификации толщины SCB, который классифицирует утолщение SCB как легкое, умеренное и тяжелое, в значительной степени субъективно, и его надежность не была полностью подтверждена15. Надежный и легко выполняемый пошаговый протокол измерения толщины остеоартрита SCB либо не полностью разработан, либо не стандартизирован.

Это исследование было направлено на разработку воспроизводимого, чувствительного и легко выполняемого протокола для количественного измерения толщины SCB в мышиной модели OA. Наши строгие измерительные тесты и статистический анализ показали, что этот программный протокол количественных измерений ImageJ может количественно оценить толщину SCB как в нормальных, так и в остеоартритных коленных суставах. Недавно разработанный протокол воспроизводим и более чувствителен к мягким изменениям SCB, чем широко используемые системы визуальной оценки. Он может быть использован для выявления ранних остеоартритных изменений SCB и для оценки эффективности in vivo лечения ОА в сочетании с классификацией хряща ОА.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры для животных, включенные в этот протокол, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинском центре Университета Канзаса в соответствии со всеми федеральными и государственными законами и правилами.

1. Создание ОА колена у мышей

  1. Создание мышиной модели ОА коленного сустава путем хирургической дестабилизации медиального мениска (ДММ), как описано Glasson et al.18 у 22 мышей с балб/с диким типом в возрасте 10-11 недель. Выполните фиктивную операцию в качестве контрольной процедуры на восьми мышах с одинаковым происхождением и возрастом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оба пола были использованы для первоначального проекта для удовлетворения требования NIH о рассмотрении пола в качестве биологической переменной, хотя изучение половых различий не входит в сферу действия этого протокола.
  2. Обезболивание животных путем вдыхания изофлурана. Проверьте глубину анестезии, контролируя частоту дыхания / усилие и отсутствие реакции на защемление пальца ноги / хвоста. Поставьте животных в лежачее положение.
  3. Побрить кожу в области коленного сустава и очистить кожу с помощью скраба для кожи Повидон-Йод + спирт; три чередующихся цикла.
  4. Выполните процедуру DMM на правом колене под хирургическим микроскопом. Обнажите коленный сустав через медиальный парапателларный разрез (1,2-1,5 см в длину) и разрезайте суставную капсулу. Сохраните надколенник и сухожилие надколенника неповрежденными. После тщательного воздействия медиальной менискотибиальной связки (MML), которая закрепляет медиальный мениск на плато большеберцовой кости, транссектируйте его микрохирургическими ножницами, чтобы дестабилизировать медиальный мениск.
  5. Выполните фиктивную операцию на правом колене в качестве контрольной процедуры, в которой ММЛ был визуализирован, но не трансектирован.
  6. Закройте суставную капсулу с 8-0 рассасывающиеся полиглактиновые швы и разрез кожи с 7-0 нерассасывающимися швами как для DMM, так и для фиктивных процедур, чтобы обеспечить правильное использование колена после заживления.
  7. Вводят СР Бупренорфин (0,20-0,5 мг/кг) подкожно (СК) непосредственно перед хирургической процедурой обезболивания, что обеспечивает облегчение боли до 72 ч после однократной инъекции. Наблюдение за прооперированными животными после операции.
  8. Усыпляйте животных с помощью камеры CO2 через 2, 8 и 16 недель после операции. После потери сознания подтвердите гибель животных физическим методом (вскрытие грудной полости). Эти методы эвтаназии согласуются с рекомендациями Группы по эвтаназии Американской ветеринарной медицинской ассоциации (AVMA).
  9. Соберите коленные суставы для гистологических анализов через 2, 8 и 16 недель после операции DMM и через 2 и 16 недель после операции Sham для получения коленных суставов мыши с различной степенью тяжести ОА или утолщением SCB.

2. Подготовка срезов тканей и гистологических изображений

  1. Зафиксируйте образцы тканей коленного сустава мыши в 2% параформальдегиде, декальцинируйте их в 25% муравьиной кислоты, встройте в парафин и разделите коронально для изучения как медиального, так и бокового компартментов.
  2. Отрежьте образцы колена с задней стороны колена с помощью микротома и соберите участки ткани толщиной 5 мкм с интервалом 70-80 мкм, чтобы получить около 40 слайдов ткани по всему коленному суставу. Оценка с помощью микрометра показывает, что скользящие номера 1-6 взяты из дальней задней части, 11-18 из средней задней, 23-30 из средней передней и 35-40 из дальней передней части коленного сустава. Выбросьте или соберите промежуточные участки для дополнительных пятен.
  3. Выполняйте Сафранин-О и быстрые зеленые пятна в соответствии с инструкциями производителя, чтобы конкретно идентифицировать хрящевые клетки и матрицы на каждых пяти слайдах. Выполните окрашивание гематоксилин-эозином в соответствии с инструкциями производителя для исследования коленных суставов на клеточном и тканевом уровнях, как описано ранее19,20,21,22.
  4. Получайте гистологические изображения с помощью микроскопа, оснащенного цифровой камерой. Общий гистопатологический анализ и гистологическая классификация ОА были проведены, как описано ранее15,19,20,21,22.

3. Количественное измерение остеоартритной субхондральной кости с помощью программного обеспечения ImageJ

  1. Загрузите программное обеспечение ImageJ и откройте интересующие гистологические изображения.
    1. Загрузите ImageJ в комплекте с Java 1.8.0_172 с https://imagej.nih.gov/ij/.
    2. Откройте программу ImageJ. Перейдите на вкладку Файл на ленте и выберите параметр Открыть , чтобы открыть гистологическое изображение.
    3. Найдите адрес каталога файла, выберите файл рисунка и нажмите кнопку Открыть.
  2. Откалибруйте ImageJ с помощью микрометра на гистологических изображениях.
    1. С помощью инструмента «Прямая линия» набросайте одну единицу длины на микрометре и нажмите «Анализировать > (затем) «Задать масштаб». Установите для параметров Известное расстояние и Пропорции пикселей значение 1 и нажмите кнопку ОК. ImageJ может преобразовать длину пикселя в единицу длины на микрометре.
    2. Установите измеряемый коэффициент в область. Щелкните Анализировать > Установить измерение и установите флажок Область и предел порогового значения в новом окне. Этот шаг настраивает ImageJ на измерение параметра «Площадь» в пределах выбранного «Порога».
  3. Измерение общей области интереса субхондральной кости (SCB).
    1. Определите интересующую область SCB (ROI), как показано на оранжевых коробках на рисунке 1A, который охватывает кортикальную пластину SCB и часть нижележащей трабекулярной кости, прилегающую к кортикальной пластине в медиальном мыщелке бедренной кости (MFC) и медиально-большеберцовом плато (MTP) с конкретными размерами для каждого ROI. Остеоартритное утолщение SCB обычно происходит в этих областях. Определите рентабельность инвестиций SCB с одинаковой формой и размером в каждом MFC или MTP для всех исследуемых соединений, чтобы гарантировать, что одинаковый размер конкретной ROI был измерен для всех животных.
    2. Набросайте контур общей области SCB, представляющей интерес, с помощью инструмента «Выделение полигонов» в главном окне ImageJ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инструменты выделения дают системе пороговое значение для ограничения измеряемой площади.
    3. Измерение общей площади SCB: после выбора порогового значения щелкните Анализировать > мера. Откроется окно "Результаты" с измерением площади.
  4. Измерьте область костного вещества, содержащую твердую кость без костного мозга.
    1. Нажмите кнопку Изменить > Очистить снаружи , чтобы исключить область за пределами общей области SCB.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После нажатия кнопки Очистить снаружи видна только общая площадь SCB. Изображение за пределами общей площади SCB станет черным. Этот шаг позволяет наблюдателям сосредоточиться на области костного вещества в пределах интересующей области.
    2. Нажмите «Изображение > «Настроить порог цвета > », чтобы открыть окно «Пороговый цвет». Нажмите «Оригинал » в нижней части окна «Цвет порога», чтобы восстановить исходное состояние изображения. Используйте инструменты выделения на шаге 3.3.2, чтобы нарисовать небольшую коробочку в области костного вещества. Нажмите на опцию «Образец » в нижней части окна «Пороговый цвет», чтобы определить область костного вещества.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опция «Образец» в окне «Пороговый цвет» позволяет ImageJ выбрать все те же пиксели общей площади SCB, что и область образца костного вещества. Выбранная область костного вещества станет красной.
    3. Нажмите кнопку Выбрать в нижней части окна цветового баланса порогового значения, чтобы создать пороговое значение измерения площади. Нажмите «Анализировать > измерение» в главном меню ImageJ, и результат измерения области костного вещества отобразится в окне «Результаты».
    4. Сохраните данные об общей площади SCB и площади костного вещества.
  5. Рассчитайте отношение площади костного вещества (мм2) к общей интересующей площади SCB (мм2), которая представляет толщину костного вещества (мм2/1,0 мм2) в пределах общей площади SCB.
  6. Измерьте толщину SCB гистологических срезов/изображений (как описано на этапах 3.1-3.5) дальнезаподней, средней задней, средней передней и дальней передней областей (как описано на этапе 2.2) ОА, индуцированного ДММ, для оценки специфической для области толщины SCB 6 коленных суставов (рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может подтвердить надежность этого протокола количественных измерений, поскольку известно, что остеоартритные изменения SCB совместно локализуются с поражениями хряща и что повреждение остеоартритного хряща с утолщением SCB является более серьезным в несущих областях (средняя часть) коленных суставов грызунов14,15. Поэтому целесообразно использовать средние срезы для количественного измерения остеоартритного утолщения SCB.

4. Статистика

  1. Выполняйте статистический анализ с использованием данных количественных измерений и визуальной классификации толщины SCB. Определите изменчивость и воспроизводимость между и внутри наблюдателя с помощью анализа коэффициентов корреляции Пирсона.
  2. Определите значимость различий между учебными группами с помощью t-тестов Student или одностороннего ANOVA, за которым следует пост-специальный тест (Tukey) с использованием программного обеспечения для работы с электронными таблицами. Считать p-значение менее 0,05 статистически значимым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сравнение воспроизводимости между оценкой визуальной оценки и количественным измерением с помощью ImageJ:
Толщина SCB в 48 областях, представляющих интерес (ROI) (24 MFC и 24 MTP), определенная из средней части каждого колена от 24 коленей / животных, была оценена тремя независимыми лицами с использованием существующей схемы визуального подсчета 0-3, как описано в литературе15,23, где 0 = нормально (без утолщения SCB), 1 = легкое, 2 = умеренное и 3 = тяжелое утолщени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Измерение утолщения SCB является важным компонентом гистологических оценок тяжести ОА. Большинство существующих систем классификации ОА сосредоточены главным образом на изменениях хряща15,16,17. Широко используемый мышиный остеоартритный метод классификации толщины SCB, который классифицирует утолщение SCB как легкое, умеренное и тяжелое, в значительной степени субъективно, и его надежность не была полностью по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих конфликтов интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным институтом артрита, опорно-двигательного аппарата и кожных заболеваний Национальных институтов здравоохранения (NIH) под номером награды R01 AR059088, Министерством обороны (DoD) под исследовательским номером W81XWH-12-1-0304 и Фондом выдающихся профессоров Мэри и Пола Харрингтонов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Safranin-OSigma-AldrichS8884
Fast greenSigma-AldrichF7252
ГематоксилинSigma-AldrichGHS216
EosinSigma-AldrichE4382
иллюстраторAdobe Не применимо

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kotlarz, H., Gunnarsson, C. L., Fang, H., Rizzo, J. A. Insurer and out-of-pocket costs of osteoarthritis in the US: evidence from national survey data. Arthritis and Rheumatology. 60 (12), 3546-3553 (2009).
  2. Buckwalter, J. A., Martin, J. A. Osteoarthritis. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (2), 150-167 (2006).
  3. Weinans, H., et al. Pathophysiology of peri-articular bone changes in osteoarthritis. Bone. 51 (2), 190-196 (2012).
  4. Baker-LePain, J. C., Lane, N. E. Role of bone architecture and anatomy in osteoarthritis. Bone. 51 (2), 197-203 (2012).
  5. Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: Insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research and Therapy. 15 (6), 223(2013).
  6. Madry, H., van Dijk, C. N., Mueller-Gerbl, M. The basic science of the subchondral bone. Knee Surgery, Sports, Traumatology, Arthrosclerosis. 18 (4), 419-433 (2010).
  7. Milz, S., Putz, R. Quantitative morphology of the subchondral plate of the tibial plateau. Journal of Anatomy. 185, Pt 1 103-110 (1994).
  8. Blalock, D., Miller, A., Tilley, M., Wang, J. Joint instability and osteoarthritis. Clinical Medicine Insights: Arthritis and Musculoskeleton Disorders. 8, 15-23 (2015).
  9. Waung, J. A., et al. Quantitative X-ray microradiography for high-throughput phenotyping of osteoarthritis in mice. Osteoarthritis Cartilage. 22 (10), 1396-1400 (2014).
  10. Botter, S. M., et al. Cartilage damage pattern in relation to subchondral plate thickness in a collagenase-induced model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 16 (4), 506-514 (2008).
  11. Nalesso, G., et al. Calcium calmodulin kinase II activity is required for cartilage homeostasis in osteoarthritis. Science Reports. 11 (1), 5682(2021).
  12. Ding, M., Christian Danielsen, C., Hvid, I. Effects of hyaluronan on three-dimensional microarchitecture of subchondral bone tissues in guinea pig primary osteoarthrosis. Bone. 36 (3), 489-501 (2005).
  13. Kraus, V. B., Huebner, J. L., DeGroot, J., Bendele, A. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the guinea pig. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 35-52 (2010).
  14. McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in Mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
  15. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 17-23 (2010).
  16. Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  17. Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery American. 53 (3), 523-537 (1971).
  18. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  19. Wang, J., et al. Transcription factor Nfat1 deficiency causes osteoarthritis through dysfunction of adult articular chondrocytes. Journal of Pathology. 219 (2), 163-172 (2009).
  20. Zhang, M., Lu, Q., Budden, T., Wang, J. NFAT1 protects articular cartilage against osteoarthritic degradation by directly regulating transcription of specific anabolic and catabolic genes. Bone Joint Research. 8 (2), 90-100 (2019).
  21. Zhang, M., et al. Epigenetically mediated spontaneous reduction of NFAT1 expression causes imbalanced metabolic activities of articular chondrocytes in aged mice. Osteoarthritis Cartilage. 24 (7), 1274-1283 (2016).
  22. Rodova, M., et al. Nfat1 regulates adult articular chondrocyte function through its age-dependent expression mediated by epigenetic histone methylation. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (8), 1974-1986 (2011).
  23. Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ImageJ

Похожие статьи