Методическая статья

Выделение и культивирование первичных эпителиальных клеток области области человека с использованием Y-27632

5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62978

⸱

6 ноября 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tissue Engineering and Regeneration, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 2Department of Orthodontics, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 3Department of Stomatology, Shengli Oilfield Central Hospital, 4Department of Pediatric Surgery, Shengli Oilfield Central Hospital, 5Ningbo Stomatology Hospital of Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем модифицированный метод выделения и культивирования эпителиальных клеток реснь человека путем добавления ингибитора Породы, Y-27632, к традиционному методу. Этот метод проще, менее трудоемкий, усиливает свойства стволовых клеток и производит большее количество высокофомотриальных эпителиальных клеток как для лабораторных, так и для клинических применений.

Аннотация

Денцевая ткань является первой структурой, которая защищает ткани пародонта и играет значимую роль во многих функциях полости рта. Эпителий области енной области является важной структурой ткани енной области, особенно в восстановлении и регенерации ткани пародонта. Изучение функций эпителиальных клеток депо имеет решающее научное значение, такое как восстановление дефектов полости рта и выявление совместимости биоматериалов. Поскольку эпителиальные клетки ресничков человека являются высокодифференцированными ороговевших клетками, их продолжительность жизни коротка, и их трудно пройти. До сих пор существует только два способа выделения и культивирования эпителиальных клеток рысений: метод прямого эксплантата и ферментативный метод. Однако время, необходимое для получения эпителиальных клеток методом прямого эксплантата, больше, а выживаемость клеток ферментативным методом ниже. Клинически приобретение десочной ткани ограничено, поэтому необходима стабильная, эффективная и простая система изоляции и культивирования in vitro. Мы улучшили традиционный ферментативный метод, добавив Y-27632, ингибитор Rho-ассоциированной киназы (ROCK), который может избирательно способствовать росту эпителиальных клеток. Наш модифицированный ферментативный метод упрощает этапы традиционного ферментативного метода и повышает эффективность культивирования эпителиальных клеток, что имеет значительные преимущества перед методом прямого эксплантата и ферментативным методом.

Введение

Десна человека, первая линия защитной структуры, защищающей ткани пародонта, является не только физико-химическим барьером1,но и выделяет различные классы медиаторов воспалительного действия, которые участвуют в иммунных реакциях и составляют иммунный барьер2,3. Эпителий области ден играет важную роль в восстановлении и регенерации тканей пародонта. Поэтому изучение защиты и иммунитета эпителия депо имеет большое значение для понимания возникновения, диагностики и лечения пародонтита. Выделение и культивирование эпителиальных клеток области решетки человека является первым шагом, необходимым для изучения эпителия области решетки. Такая процедура требует основных операций, таких как производство семенных клеток для тканевой инженерии, моделей in vitro заболеваний, связанных с пародонтозом, и материалов для восстановления дефектов пародонта.

Первичные эпителиальные клетки депив характеризуются низкой скоростью деления in vitro4,исследователи десятилетиями искали оптимальный метод изоляции и культивирования. На сегодняшний день два различных метода, метод прямого эксплантата и ферментативный метод, обычно используются в лабораториях для получения первичных клеток эпителия десны in vitro4,5. Метод прямого эксплантирования имеет такие преимущества, как требование меньшего количества образцов тканей и простая процедура выделения, но он имеет недостатки в более длительном времени культивирования и восприимчивости к загрязнению5. Хотя ферментативный метод сокращает требуемое время культивирования, эффективность относительно низкая и варьируется в зависимости от используемых ферментов и среды. Kedjarune et al.6 показали, что метод прямого эксплантата, который требует больше времени до субкультуры (2 недели), оказался более успешным для культивирования эпителиальных клеток десны по сравнению с ферментативным методом. Однако, сравнивая эти два метода, Klingbeil et al.7 обнаружили, что ферментативный метод имел наилучшие результаты для первичных культур эпителиальных клеток полости рта, и можно было получить оптимальный выход клеток в течение кратчайшего периода времени (11,9 дня против 14,2 дня).

Поэтому важно было разработать более удобный и эффективный метод выделения и культивирования эпителиальных клеток полости рта4. Ранее мы сообщали, что добавление Y-27632, ингибитора Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK), упрощает процедуру выделения первичных клеток эпидермиса человека и кератиноцитов из тканей кожи взрослого человека8,9,10. Мы разработали G-среду, новую кондиционированную среду для прививки, которая спонтанно отделяет эпидермальные клетки от кожных и поддерживает рост и выход первичных эпидермальных клеток8,9,10. В настоящем исследовании мы разработали новую технику выделения и культивирования эпителиальных клеток без сыворотки без сыворотки путем объединения G-среды с Y-27632. По сути, наш метод основан на упрощении традиционного двухэтапного ферментативного метода, поэтому мы сравнили наш новый метод с методом прямого эксплантата. Этот модифицированный ферментативный метод значительно сокращает время, необходимое для отделения эпителиальных клеток деска от дежной ткани и повышает эффективность культивирования эпителиальных клеток деповидной.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Человеческие ткани, используемые в этом протоколе, представляют собой свежие взрослые деневые ткани, выброшенные из удаления ретинированных зубов в отделении челюстно-лицевой хирургии в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике исследований человека Учреждения (Протокол No. GR201711, Дата: 02-27-2017).

1. Препараты

  1. Соберите свежие взрослые ткани ребрышки в пробирки по 15 мл, содержащие 10 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), дополненного 3% пенициллина / стрептомицина (P / S), и держите ткани при 4 ° C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обработайте ткани, как описано ниже, в течение 24 ч после иссечения.

2. Подготовка реагентов и питательной среды

  1. Приготовить моющее раствор: 3% P/S. Смешать 50 мл PBS с 1,5 мл пенициллина (100 Ед/мл) и 1,5 мл стрептомицина (100 мг/л).
  2. Приготовьте 500 мл среды, содержащей фактор роста (называемой G-средой): среды DMEM/F12 (3:1), содержащей 1% P/S, 2% добавки B27, 20 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 40 нг/мл фактора роста фибробластов 2 (FGF2) и 40 мкг/мл грибка.
  3. Приготовьте растворы для ферментного сбраживания для нового метода: растворите 125 мг порошка Диспазы и 125 мг порошка коллагеназы типа I в 50 мл ДМЭМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтруйте все растворы ферментов через ситечко 0,22 мкм и храните при 4 °C.
  4. Готовят 500 мл среды для нейтрализации ферментативного пищеварения: 10% фетальной бычий сыворотки (FBS) и 1% P/S в среде DMEM.

3. Метод прямого эксплантата

  1. Предварительная обработка ткани ресни
    1. Промывайте ткани ресницы 5 мл 75% этанола в течение 30 с. Затем дважды промыть 5 мл моющих растворов (шаг 2.1) в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все мытья в посуде для клеточных культур диаметром 50 мм.
  2. Культура эпителиальных клеток области гин
    1. Разрежьте ткани области на 1 мм3 кусочка и рассыпьте их в чашке для культивирования клеток 100 мм. Используйте мелкоконечные щипцы и офтальмологические ножницы для операций резки.
    2. Добавьте G-среду (шаг 2.2) в блюдо для культивовки. Затем инкубируют культурную чашку в 5% CO2 инкубаторе при 37 °C. Используйте инвертированный микроскоп (40x) для изучения тканей каждые 24 ч.
    3. Удалите кусочки ткани области, когда эпителиальные клетки распространились до 2-5 мм в диаметре вокруг кусочков ткани. Меняйте G-среднюю каждые 2-4 дня.

4. Новый модифицированный ферментативный метод

  1. Предварительная обработка ткани ресни
    1. Для этого выполните те же действия, что и для метода прямого эксплантата, шаг 3.1.1.
  2. Переваривание ткани гневы
    1. Разрежьте денцевую ткань на крошечные кусочки, размером примерно <1 мм, двумя стерилизованными лезвиями. Повторите процесс измельчения двумя хирургическими лезвиями.
    2. Добавьте 1 мл 2,5 мг/мл диспазы + раствор коллагеназы в центрифужную трубку 1,5 мл, содержащую кусочки деповой ткани, а затем инкубируют трубку в течение 15-20 мин в инкубаторе при 37 °C.
    3. Когда ткань станет прозрачной и флокулентной, добавляют 1 мл нейтрализующих растворов для прекращения пищеварения. Тщательно перемешайте раствор, пипетируя вверх и вниз 10-15 раз. Пропустите раствор через сетчатый фильтр 100 мкм.
    4. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин.
    5. Удалите супернатант и повторно суспендируют клеточную гранулу на дне в 10 мл среды, содержащей фактор роста (этап 2.2). Переложите клеточную суспензию в чашку для культивовки клеток 100 мм. Добавьте 10 мкМ Y-27632 в чашку для культивируемости клеток.
    6. Культивьять клетки при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе. Заменяйте старую G-среднюю на свежую G-среднюю каждые 2 дня. Наблюдайте за клетками в День 1 и День 3.

5. Пасуя клеток

  1. Выньте посуду из инкубатора, удалите отработанный носитель и дважды вымойте PBS. Добавьте 2 мл 0,05% трипсина на каждое блюдо по 100 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхните блюдо, чтобы убедиться, что между раствором трипсина и дном блюда достаточно контакта.
  2. Оставьте блюдо в инкубаторе примерно через 5 минут при 37 °C для процесса пищеварения.
  3. Используйте микроскоп (40x), чтобы исследовать клетки и убедиться, что большинство клеток отделились от нижней части чашки.
  4. Добавьте 2 мл нейтрализующих растворов, чтобы остановить пищеварение и перенести клетки в пробирку объемом 15 мл. Пипетка вверх и вниз 10-15 раз. Центрифугировать ячейки при 200 х г в течение 5 мин.
  5. Медленно удаляйте супернатант. Повторно суспендируете клетки с 10 мл G-среды и подсчитайте количество клеток.
  6. Добавьте около 1 х 106 ячеек в 10 мл G-среды и 10 мкМ Y-27632 к каждой тарелке 100 мм.
  7. Обновляйте G-medium и Y-27632 каждые 2 дня. Просмотр ячеек на 1-й и 5-й день.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 показана принципиальная схема метода прямого экспланта и модифицированного ферментативного метода. Метод прямого эксплантата не нуждается в пищеварительном ферменте в течение всего процесса. Напротив, традиционный ферментативный метод обычно требует двух наборов пищеварительных ферментов, диспазы и коллагеназы, чтобы отделить эпителиальный лист от нижележащих слоев фибробластов, а затем трипсин для высвобождения эпителиальных клеток в суспензию. Наш новый метод опускает этап раз...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Денцевая ткань является ключевой структурой, которая поддерживает целостность пародонта и здоровье. Эпителиальные клетки десна играют значительную роль в восстановлении и регенерации ткани пародонта и могут быть использованы в научных исследованиях и клинических применениях и смежных областях, включая биологию полости рта, фармакологию, токсикологию и дефицит слизистой оболочки полости рта18. Поэтому необходимо разработать стабильный и эффективный метод сбора эпителиальных клеток полости рта

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Ключевой программой Фонда естественных наук провинции Шаньдун (ZR2019ZD36) и Ключевой программой исследований и разработок провинции Шаньдун (2019GSF108107) для X.W.; Ключевая программа исследований и разработок провинции Шаньдун (2018GSF118240) для J.G.; Проект развития науки и техники в области медицины и здравоохранения провинции Шаньдун (2018WS163) для Z.X. и Проект развития науки и техники в области медицины и здравоохранения провинции Шаньдун (2019WS045) для J.S.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Названия, аббревиатуры и Комментарии
Графиня автоматизированный счетчик клетокШанхай Ruiyu Bio-science& Технологии Co.Ltd.BBA0218ACАвтоматический подсчет клеток
CO2 ИнкубаторThermo Scientific51026333Для инкубации клеток
Sorvall ST 16R ЦентрифугаThermo Scientific75004380Центрифуга для клеток
Чашка для клеточных культурEppendorf30702115Для клеточных культур
50 мл ЦентрифугаKIRGEN171003Для центрифугирования клеток
Микроцентрифуга 1,5 мл ПробиркиKIRGEN190691JДля разложения клеток
Клеточный фильтрCorning встроенный431792Фильтрация клеток
Фосфатный буферный растворSolarbio Life ScienceP1020-500Моющий раствор
DMEMThermo ScientificC11995500Компонент нейтрализующей среды
Определенный срок службы K-SFM Технологии10785-012Эпителиальные клетки десны
Питательная среда Пенициллин СтрептомицинThermo Scientific15140-122Антибиотики
Фетальная бычья сывороткаБиологическая промышленность04-001-1АС5Компонент нейтрализующей среды
0,05% ТрипсинЛайф Технолоджис25300-062Для HGGEPC диссоциация
Разведение СредаLife Technologies50-9701Для покрытия матрицы
DispaseGibco17105-041Для выделения HGGEPCs
Коллагеназа типа ILife Technologies17100-017Для выделения HGGEPCs
F12 Питательная смесь, HamsLife Technologies31765035компонент G-среды
B27 SupplementLife Technologies17504044Фактор роста в G-среде
FGF-2 MilliporeMerck Biosciences341595Фактор роста в G-среде
Y-27632Работа генаIAD1011ингибитор ROCK
FungizoneGibco15290026Препарат для G-среды
EGF Рекомбинантный человеческий белокGibcoPHG0311Фактор роста в G-среде
Набор для подсчета клеток-8Dojindo Molecular TechnologiesCK04Для анализа пролиферации клеток
Rabbit Anti-Human CK18Abcamab82254Для иммунофлуоресцентного окрашивания для проверки маркера дифференцировки HGGEPCs
Rabbit Anti-Human Cytokeratin10Abcamab76318Для иммунофлуоресцентного окрашивания для проверки маркера дифференцировки HGGEPC
Мышиный против человека VimentinCell Signaling Technology3390Для иммунофлуоресцентного окрашивания фибробластов десны
Rabbit Anti-Human pan-ckBD550951Для иммунофлуоресцентного окрашивания для проверки маркера дифференцировки HGGEPCs
кролика anti-Ki67Abcam15580Для иммунофлуоресцентного окрашивания для проверки маркера дифференцировки HGGEPC
кролика anti-p63Biolegend619002Для иммунофлуоресцентного окрашивания для проверки маркера дифференцировки HGGEPC кролика
anti-p75NGFRAbcamab52987Для иммунофлуоресцентного окрашивания для проверки маркера дифференцировки HGGEPC

Ссылки

  1. Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158(2019).
  2. Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
  3. Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766(2014).
  4. Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
  5. Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
  6. Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
  7. Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
  8. Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
  9. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
  10. Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
  11. Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
  12. Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
  13. Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
  14. Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
  15. Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
  16. Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
  17. Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
  18. Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
  19. Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
  20. Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
  21. Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
  22. Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
  23. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
  24. Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
  25. Smola, H., Krieg, T. The keratinocyte handbook. Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. 375, Cambridge University Press. FEBS Letters 311(1994).
  26. Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
  27. Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
  28. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
  29. Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651(2015).
  30. Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
  31. Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780(2020).
  32. Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ROCK

Похожие статьи