Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация органоидов мозга из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в самодельных мини-биореакторах

5.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62987

⸱

11 декабря 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine, Federal Medical Biological Agency, 2Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, 3Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine, Federal Medical Biological Agency, 4Department of Pathological Anatomy, North-Western State Medical University, 5Department of Biology, Lomonosov State University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем протокол генерации органоидов мозга из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (IPSCs). Для получения органоидов головного мозга в больших количествах и высокого качества мы используем самодельные мини-биореакторы.

Аннотация

Органоид мозга, полученный из iPSC, является перспективной технологией для моделирования in vitro патологий нервной системы и скрининга лекарств. Эта технология появилась недавно. Он все еще находится в зачаточном зачаточном начале и имеет некоторые ограничения, которые еще не решены. Существующие протоколы не позволяют получить органоиды, чтобы быть достаточно последовательными для открытия лекарств и доклинических исследований. Созревание органоидов может занять до года, подталкивая исследователей к запуску нескольких процессов дифференцировки одновременно. Это налагает дополнительные расходы на лабораторию с точки зрения площади и оборудования. Кроме того, органоиды головного мозга часто имеют некротическую зону в центре, которая страдает от дефицита питательных веществ и кислорода. Следовательно, большинство современных протоколов используют циркулирующую систему для культивирования среды для улучшения питания.

Между тем, не существует недорогих динамических систем или биореакторов для культивирования органоидов. В этой статье описывается протокол производства органоидов головного мозга в компактных и недорогих самодельных мини-биореакторах. Этот протокол позволяет получать высококачественные органоиды в больших количествах.

Введение

Модели, полученные из iPSC человека, широко используются в исследованиях нейроразвития и нейродегенеративных расстройств1. За последнее десятилетие 3D-модели мозговой ткани, так называемые органоиды мозга, существенно дополнили традиционные 2D-нейронные культуры2. Органоиды в некоторой степени повторяют 3D-архитектуру эмбрионального мозга и позволяют более точно моделировать. Опубликовано много протоколов для генерации органоидов, представляющих различные области мозга: кора головного мозга3,4,5,мозжечок6,средний мозг, передний мозг, гипоталамус7,8,9и гиппокамп10. Было несколько примеров использования органоидов для изучения заболеваний нервной системы человека11. Также органоиды были внедрены в лекарственные открытия12 и использованы в исследованиях инфекционных заболеваний, в том числе SARS-Cov-213,14.

Органоиды головного мозга могут достигать до нескольких миллиметров в диаметре. Так, внутренняя зона органоида может страдать от гипоксии или неправильного питания и со временем становиться некротической. Поэтому многие протоколы включают специальные биореакторы8,шейкеры или микрофлюидные системы15. Эти устройства могут потребовать больших объемов дорогостоящих клеточных культур. Также стоимость такого оборудования обычно высока. Некоторые биореакторы состоят из множества механических частей, которые затрудняют их стерилизацию для повторного использования.

Большинство протоколов страдают от «пакетного эффекта»16,который порождает значительную вариабельность среди органоидов, полученных из идентичных ИПСК. Эта изменчивость препятствует тестированию лекарств или доклиническим исследованиям, требующим единообразия. Высокий выход органоидов, достаточный для выбора органоидов однородного размера, может частично решить эту проблему.

Фактор времени также является существенной проблемой. Matsui et al. (2018) показали, что органоидам мозга требуется не менее шести месяцев, чтобы достичь зрелости17. Trujillo et al. (2019) также продемонстрировали, что электрофизиологическая активность возникала у органоидов только после шести месяцев культивирования18. Из-за длительного времени созревания органоидов исследователи часто запускают новую дифференциацию до завершения предыдущей. Множественные параллельные процессы дифференциации требуют дополнительных затрат, оборудования и лабораторного пространства.

Недавно мы разработали мини-биореактор, который в основном решает проблемы, упомянутые выше19. Этот самодельный биореактор состоит из сверхнизкой адгезии или необработанная чашка Петри с пластиковой ручкой в центре. Эта пластиковая ручка предотвращает скопление органоидов и их смешение в центре чашки Петри, что вызвано вращением шейкер. В данной работе описано, как этот недорогой и простой самодельный мини-биореактор позволяет генерировать высококачественные органоиды мозга в больших количествах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильный метод во всем протоколе, исключая этапы 1.2 и 1.3. Прогрейте все культуральные среды и растворы до 37 °C перед нанесением на клетки или органоиды. Культивируйте клетки в инкубатореCO2 при 37 °C при 5% CO2 при влажности 80%. Схема протокола показана на рисунке 1.

1. Превращение чашек Петри в мини-биореакторы

  1. Нарезать стерильные 15 мл центрифужные трубки в кольца высотой 7-8 мм; автоклав колец.
  2. Разбейте низкоадгезионные, необработанные или микробиологические чашки Петри на крошки. Растворите около 1 г пластиковой крошки в 10 мл хлороформа на ночь для приготовления жидкого пластика.
    ВНИМАНИЕ: Работайте в вытяжном капюшоне.
  3. Убедитесь, что полученный жидкий пластик достаточно вязкий для пипетки; его капля сохраняет сферическую форму и не распространяется по поверхности. Если он очень жидкий, добавьте больше пластиковых крошек. Если он густой, то добавляют хлороформ.
  4. Сделайте пластиковую ручку в центре стерильной сверхнизкой адгезии 6-сантиметровой чашки Петри. Есть два одинаково подходящих способа, как подробно описано ниже.
    1. Поместите автоклавное пластиковое кольцо по центру и опустите жидкий пластик внутрь кольца.
    2. Без пластикового кольца опустите жидкий пластик на центр чашки Петри.
  5. Оставьте посуду открытой на 2-3 ч в ламинарном проточном вытяжке до полного высыхания. Обработать высушенную посуду ультрафиолетовым излучением в течение 15-20 мин.

2. Индукция нейронной дифференцировки ИПСК

  1. Культивируют иПСК в среде для плюрипотентных стволовых клеток до 75-90% слияния в 35 мм чашках Петри, предварительно покрытых матрицей, состоящей из внеклеточных белков.
  2. Готовят среду A-SR. Подробную информацию см. в таблице 1.
  3. Аспирировать питательную среду и добавить 2 мл среды A-SR на 0-й день дифференцировки.
  4. Подготовьте носитель А (см. табл. 2).
  5. Культивируют клетки в среде А в течение двух недель со 2-14 дней, освежая среду в чашках Петри через день.

3. Образование сфероидов из нейроэпителиальных клеток-предшественников на 14 день

  1. На 14-й день делают сфероиды из нейроэпителиальных клеток-предшественников, используя специальную 24-скважинную культуральную пластину, содержащую примерно 1 200 микроядер в каждой скважине(рисунок 2C). Следуйте процедуре, приведенной ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этой стадии дифференцировки чашка Петри размером 35 мм обычно содержит 3 - 3,5 х 106 нейроэпителиальных клеток-предшественников. Таким образом, одной 35-миллиметровой чашки Петри с нейроэпителиальными клетками-предшественниками достаточно для 3 - 4 скважин 24-скважинной культуральной пластины с микроэлементами.
  2. Подготовьте 24-скважинную культурную пластину с микролунками: к каждой скважине добавьте 1 мл среды А. Центрифуга ненадолго при 1 300 х г в течение 5 мин в качающемся роторе ковша, оснащенном держателем пластины. Контролируйте под микроскопом, чтобы в микровеллах не было пузырьков.
  3. Готовят среду В(таблица 3).
  4. Удалить среду из чашки Петри с нейроэпителиальными клетками-предшественниками; промыть ячейки 2 мл DMEM/F12. Для отслоения клеток обработать клетки 1,5 мл раствора ЭДТА 0,48 мМ, приготовленным в PBS. Контролируйте отсоединение клеток под микроскопом.
  5. Соберите клетки в трубку 15 мл. Добавьте 5 мл DMEM/F12 в пробирку для промывки клеток. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин. Удаляют супернатант и повторно суспендировали клетки в 2 мл среды В.
  6. Проверьте концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью окрашивания Trypan Blue и гемоцитометра. Рассчитайте объем суспензии, необходимый для содержания 1 х 106 жизнеспособных клеток в общей сложности.
  7. Перенесите клеточную суспензию, содержащую 1х 10 6 клеток, в каждую скважину 24-скважинной пластины с микроэлементами. Добавьте среду B до 2 мл в каждую скважину, аккуратно пипетку клеток вверх и вниз несколько раз и центрифугируйте ненадолго 100 х г в течение 1 мин для захвата клеток в микролунках.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек в скважине не должно превышать 1 х 106. В противном случае сфероиды из соседних микроуровнях сливаются.
  8. Проверьте под микроскопом, что клетки равномерно распределены в микрозвеллах. Повторите пипетку и центрифугирование, если ячейки распределены неравномерно.
  9. Инкубируйте пластину в течение ночи, чтобы позволить клеткам объединяться в сфероиды.

4. Получение и культивирование органоидов

  1. На следующее утро (день 15) проверьте качество сфероидов под микроскопом. Убедитесь, что они прозрачные и гладкие, если они здоровы(рисунок 2A,B). Осторожно соберите сфероиды из каждой лунки в трубку 15 мл, оставьте сфероиды выпадать в осадок под действием силы тяжести в течение 2-3 мин, а затем удалите супернатант.
  2. Добавьте к сфероидам 2 мл матрицы, размороженные за это же время на льду. Аккуратно перемешать путем пипетки и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
  3. Для промывания избытка матрицы добавляют в пробирку 8 мл среды Б. Пипетку аккуратно, затем центрифугируют трубку в течение 1 мин при 100 х г.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте время и скорость центрифугирования, чтобы избежать необратимой агрегации сфероидов.
  4. Удалите супернатант. Добавьте в туба 2 мл среды В, аккуратно пипетку. Разделите сфероидную суспензию между двумя мини-биореакторами, каждый из которых содержит 4 мл среды B. Поместите мини-биореакторы в чашку Петри 15 см, чтобы предотвратить испарение воды и избежать загрязнения.
  5. Поставьте чашку Петри с мини-биореакторами на орбитальный шейкер. Культивируют органоиды со скоростью вращения 70-75 об/мин.
  6. На 16 день приготовьте среду С(табл. 4).
  7. Перенесите органоиды в трубку 15 мл. В течение 5 мин дайте им упасть на дно, аспирировать супернатант, добавить 5 мл среды С. Верните органоиды в мини-биореакторы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не потерять сфероиды, которые прозрачны и едва заметны.
  8. Культивируйте сфероиды в среде С в течение двух недель, освежая среду каждые два дня. В конце этих двух недель оставьте около 100 сфероидов на мини-биореактор для последующего культивирования. Заморозьте избыточные сфероиды в морозильной среде в жидком азоте.
  9. На 30 день приготовьте среду D(табл. 5).
  10. Измените среду культивации на среду D, которая является средой созревания. Обновляйте культивирование среды каждые 2-3 дня в течение трех недель, затем используйте среду D без BDNF и GDNF.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Схема протокола показана на рисунке 1. Протокол включал пять сред, в которых IPSCs дифференцировались на органоиды мозга в течение как минимум одного месяца. Дифференциация была начата, после чего ИПСК достигли 75-90% слияния(Рисунок 2А,В). Первые признаки дифференцировки в сторону нейронов наблюдались на 10-11 день культивирования иПСК в среде А, когда клетки начали группироваться в «розетки»(рисунок 2С). На 14-15 ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный протокол имеет два важных этапа, позволяющих генерацию высококачественных органоидов одинакового размера. Во-первых, органоиды растут из сфероидов, которые почти идентичны по количеству клеток и зрелости клеток. Во-вторых, самодельные биореакторы обеспечивают каждому органоиду однородную среду, где органоиды не сгруппированы и не слипаются.

Качество клеток и состояние созревания клеток имеют важное значение для выполнения протокола. Крайне важно начинать дифференцировку нейронов при ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Данная работа была поддержана грантом 075-15-2019-1669 Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (анализ ОТ-ПЦР) и грантом No 19-15-00425 Российского научного фонда (на все остальные работы). Авторы также благодарят Павла Беликова за помощь в монтаже видео. Рисунки в рукописи были созданы с BioRender.com.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Усовершенствованный DMEM/F-12Gibco12634010DMEM/F-12
AggreWell400STEMCELL Technologies Inc3442524-луночный культуральный планшет с микролунками
B-27 Добавка Gibco17504044Нейрональная добавка B
GlutaMAX ДобавкаGibco35050061200 мМ L-аланил-L-глутамин
человека BDNFMiltenyi Biotec130-096-285
Человек FGF-2Miltenyi Biotec130-093-839
Человек GDNFMiltenyi Biotec130-096-290
Замена сыворотки KnockOutGibco10828028замена сыворотки
mTESR1STEMCELL Technologies Inc85850Плирипотентная среда стволовых клеток
N2 ДобавкаGibco
Нейробазальная средаGibco21103049Базальная среда для поддержания нейрональных клеток
Пенициллин-стрептомицин растворGibco15140130
ПлазмоцинInvivoGenant-mpt-1Противомикробные препараты
PurmorphamineEMD Millipore540220
StemMACS Y27632Miltenyi Biotec130-106-538Y27632
StemMACS ДорсоморфинMiltenyi Biotec130-104-466Дорсоморфин
StemMACS LDN-193189Miltenyi Biotec130-106-540LDN-193189
StemMACS SB431542Miltenyi Biotec130-106-543SB431542
Trypan Blue SolutionGibco15250061
Versen solutionGibco150400660,48 мМ ЭДТА в PBS
&бета;-меркаптоэтанолеGibco31350010
17502001

Ссылки

  1. Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
  2. Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).
  3. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284(2013).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).
  6. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  7. Qian, X., et al. Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  8. Qian, X., et al. Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  9. Jo, J., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  10. Sakaguchi, H., et al. Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue. Nature Communication. 6 (1), 8896(2015).
  11. Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
  12. Chen, K. G., et al. Pluripotent stem cell platforms for drug discovery. Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).
  13. Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
  14. Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids. Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).
  15. Ao, Z., et al. One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure. Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).
  16. Di Nardo, P., Parker, G. C. Stem cell standardization. Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).
  17. Jo, J., Xiao, Y., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  18. Matsui, T. K., et al. Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells. Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).
  19. Trujillo, C. A., et al. Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development. Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).
  20. Eremeev, A. V., et al. Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids. Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).
  21. Qian, X., et al. Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).
  22. Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
  23. Hall, G. N., et al. Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo. Biomaterials. 273, 120820(2021).
  24. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).
  25. Eremeev, A., et al. Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype. Cells. 10 (7), 1790(2021).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3D
Генерация органоидов мозга из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в самодельных мини-биореакторах
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.