Этот протокол представляет собой одночастично-интерферометрическую визуализацию отражательной способности, которая предназначена для многоуровневых и всесторонних измерений размера внеклеточных везикул (ВВ), количества ВВ, фенотипа ВВ и колокализации биомаркеров ВВ.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Интерферометрическая визуализация отдельных внеклеточных везикул и популяционной динамики с помощью интерферометрической визуализации отдельных внеклеточных везикул и популяционной динамики
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Внеклеточные везикулы (ВВ) — это везикулы нанометрового размера с липидным бислоем, которые секретируются большинством клеток. ВВ несут множество различных биологических молекул, включая белки, липиды, ДНК и РНК, и постулируются для облегчения межклеточной коммуникации в различных тканях и органах. В последнее время ВВ привлекают значительное внимание в качестве биомаркеров для диагностики и терапевтических средств при различных заболеваниях. Для определения характеристик электромобилей было разработано множество методов. Тем не менее, все современные методы анализа электромобилей имеют различные ограничения. Таким образом, разработка эффективных и действенных методов выделения и определения характеристик электромобилей остается одним из важнейших шагов для этой передовой области исследований по мере ее развития. В этой статье мы предоставляем подробный протокол, описывающий одночастичный интерферометрический датчик отражения (SP-IRIS) в качестве метода, способного обнаруживать и характеризовать ВВ из неочищенных биологических источников и очищенных ВВ с помощью других методологий. Этот передовой метод может быть использован для многоуровневых и всесторонних измерений для анализа размера ВВ, количества ВВ, фенотипа ВВ и колокализации биомаркеров.
Введение
Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой мембранные везикулы клеточного происхождения нанометрового размера, которые могут быть выделены из многочисленных биологических жидкостей, включая кровь, грудное молоко, слюну, мочу, желчь, сок поджелудочной железы, а также спинномозговую и перитонеальную жидкости. Образование ВВ происходит с помощью трех основных механизмов: апоптоза, высвобождения путем слияния многовезикулярных телец с плазматической мембраной и блеббинга плазматической мембраны. Данные о переносе компонентов донорских клеток в соседние или отдаленные клетки и ткани позволяют предположить, что эти мембранные пак....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Образцы сыворотки были собраны у мышей в соответствии с утвержденным протоколом Институциональных комитетов по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинском центре Университета Канзаса (KUMC). Использование этих биологических образцов в этих экспериментах также было одобрено KUMC.
1. Подготовка образцов (День 1)
- Определение концентрации EV с помощью отслеживания наночастиц или аналогичного метода.
- Разбавить образец инкубационным раствором до концентрации 5 x 107-5 x 108 EVs/мл; необходимо минимум 50 μл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов, в которых концентрация EV неизвестн....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 7 (левая панель) показано трехцветное составное изображение электромобилей, полученное из кондиционированного носителя HEK293, привязанного к пятну CD63 на чипе и окрашенного для CD81, CD63 и CD9 в следующих каналах: зеленый, красный и синий соответственно. На рисунке 7 (верхняя правая панель) показано увеличенное изображение, показывающее, что каждый из захваченных электромобилей может отображать колокализацию одного или нескольких цветов с различной.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Современные методы определения характеристик ЭВ в значительной степени опираются на очищенные ВВ, что ограничено текущими экспериментальными ограничениями методов очистки ЭВ 9,10,11,12,13. Одночастично-интерферометрическая визуализация отражательной способности (SP-IRIS) — это эффективная технология, которая позволяет исключит.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Клейтон Дейган и Джордж Даабул являются сотрудниками и акционерами NanoView Biosciences Inc.
Благодарности
Эта работа была частично спонсирована Программой наград за научное оборудование и закупки ресурсов Медицинской школы Канзасского университета. PCG, LKC, FD и AR были поддержаны за счет средств NIA R21 AG066488-01.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10-см стерильная чашка Петри | Fisher | FB0875712 | |
| 15 мл стерильная пробирка | н/а | различные | |
| 24-луночные планшеты для культивирования клеток, плоское дно | Fisher | 08-772-1 | |
| Блокирующий раствор | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | можно найти в наборе ExoView Human Tetraspanin. |
| Чипфайлы | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | можно найти в наборе ExoView Human Tetraspanin. |
| Чипы | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | можно найти в наборе ExoView Human Tetraspanin. |
| Chuck | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | можно найти в наборе ExoView Human Tetraspanin. |
| Одноразовые стерильные бутылки из полистирола Corning Easy Grip 250 мл | Fisher | 09-761-4 | |
| Одноразовые полистирольные стерильные бутылки Corning Easy Grip 500 мл | Fisher | 09-761-10 | |
| Деионизированная (DI) вода | Пинцет в | LC267404 | |
| с наконечниками из углеродного волокна | Fisher | 50-193-0842 | |
| Набор ExoView Human Tetraspanin Kit | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Capture для hCD81, hCD9, hCD63, IgG Control + красители для hEV-A (hEV-CD63-647, hEV-CD81-555, hEV-CD9-488) 16 чипов в комплекте |
| ExoView R100 Imager | NanoView Biosciences | EV-R100 | Интерферометрический микроскоп, включая высокоспециализированную камеру, включая 3 цветных флуоресценции и безметочных внеклеточных везикул |
| Флуоресцентно лабинированные антитела хума CD9 IgG антитела | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | можно найти в наборе ExoView Human Tetraspanin. |
| Флуоресцентно лалированное антитело к человеческому CD63 IgG | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | можно найти в наборе ExoView Human Tetraspanin. |
| Флуоресцентно лабинированное антитело к человеческому CD81 IgG | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | можно найти в наборе ExoView Human Tetraspanin. |
| Инкубационный раствор | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | можно найти в наборе ExoView Human Tetraspanin. |
| Орбитальный шейкер или вибростенд с цифровыми настройками, способный встряхивать со скоростью 500 об/мин | без | различных | |
| пломб Plate-Seal | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | можно найти в комплекте ExoView Human Tetraspanin. |
| Решение: NanoView | Biosciences | EV-TETRA-C | можно найти в наборе ExoView Human Tetraspanin. |
| Решение B | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | можно найти в наборе ExoView Human Tetraspanin. |
| Решение C | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | можно найти в наборе ExoView Human Tetraspanin. |
| Решение D | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | можно найти в наборе ExoView Human Tetraspanin. |
| Пинцет с квадратным/плоским концом | Fisher | 50-239-62 | |
| Прямой пинцет типа Boley Fisher | 16-100-124 | ||
| Термонаучный клей для ПЦР-пластин | Seals Fisher | AB-0558 |
Ссылки
- Maas, S. L. N., Breakefield, X. O., Weaver, A. M. Extracellular vesicles: Unique intercellular delivery vehicles. Trends in Cell Biology. 27 (3), 172-188 (2017).
- Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New E....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
