Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Вскрытие и иммуноокрашивание личиночных слюнных желез комаров Anopheles gambiae

4.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62989

⸱

30 сентября 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Tufts School of Medicine, 3Department of Biomedical Sciences, Idaho College of Osteopathic Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Слюнная железа взрослого комара (SG) необходима для передачи всех переносимых комарами патогенов их человеческим хозяевам, включая вирусы и паразитов. Это видео демонстрирует эффективную изоляцию SGs от личиночных (L4) стадии комаров Anopheles gambiae и подготовку SGs L4 для дальнейшего анализа.

Аннотация

Слюнные железы комаров (SGs) являются необходимым органом-шлюзом для передачи патогенов, переносимых насекомыми. Болезнетворные агенты, в том числе вирусы и паразиты Plasmodium, вызывающие малярию, накапливаются в секреторных полостях SG-клеток. Здесь они готовы к передаче своим позвоночным хозяевам во время последующей кровяной трапезы. Поскольку взрослые железы формируются как развитие остатков почек личиночного протока SG, которые сохраняются после раннего гистолиза pupal SG, личиночный SG является идеальной мишенью для вмешательств, ограничивающих передачу заболевания. Понимание развития личиночного SG может помочь лучше понять его морфологию и функциональные адаптации и помочь в оценке новых вмешательств, которые нацелены на этот орган. Этот видеопротокол демонстрирует эффективную технику выделения, фиксации и окрашивания личинок SGs от комаров Anopheles gambiae. Железы, рассеченные из личинок в 25% растворе этанола, фиксируют в смеси метанола и ледниковой уксусной кислоты с последующей холодной промывкой ацетоном. После нескольких полосканий в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) SGs могут быть окрашены широким спектром маркерных красителей и / или антисывороток против SG-экспрессированных белков. Этот метод выделения личинок SG также может быть использован для сбора ткани для анализа гибридизации in situ, других транскриптомных применений и протеомных исследований.

Введение

Малярия является серьезной угрозой общественному здравоохранению, вызывающей почти 230 миллионов инфекций и, по оценкам, 409 000 смертей в 2019году 1. Большинство смертей происходит в странах Африки к югу от Сахары и вызваны паразитом Plasmodium falciparum, переносчикомнасекомых которого является Anopheles gambiae,предмет этой видеодемонстрации. Хотя цифры указывают на значительное снижение годового уровня смертности с начала века (>300 000 меньше ежегодных смертей), многообещающее снижение показателей заболеваемости, наблюдаемое с 2000 по 2015 год, сокращается, что свидетельствует о необходимости новых подходов к ограничению передачиболезней2. Среди перспективных дополнительных стратегий борьбы и, возможно, ликвидации малярии — нацеливание на потенциал комаров-переносчиков с использованием редактирования генов на основе CRISPR/Cas9 и генногодрайва3,4,5. Действительно, именно борьба с комарами-переносчиками (за счет более широкого использования обработанных инсектицидами надкроватных сеток длительного пользования) оказала наибольшее воздействие на сокращение передачи болезней6.

Самки комаров приобретают гаметоциты Plasmodium от инфицированного человека во время кровяной трапезы. После оплодотворения, созревания, прохождения эпителия средней кишки, расширения популяции и навигации гемокоэли в их облигатных комарах-хозяевах от сотен до десятков тысяч спорозоитов Plasmodium вторгаются в SG комаров и заполняют секреторные полости составляющих секреторных клеток. Оказавшись внутри секреторных полостей, паразиты имеют прямой доступ к слюнному протоку и, таким образом, готовы к передаче новому хозяину позвоночных при следующем приеме пищи в кровь. Поскольку SG имеют решающее значение для передачи вызывающих малярию спорозоитов их человеческим хозяевам, а лабораторные исследования показывают, что SG не являются необходимыми для кровоснабжения, выживания комаров или плодовитости7,8,9,они представляют собой идеальную мишень для мер по блокированию передачи. Взрослые комары SGs формируются как развитие остатков «протоковой почки» в личиночных SGs, которые сохраняются за пределами раннего гистолиза pupal SG10,что делает личиночную SG идеальной мишенью для вмешательств по ограничению передачи заболевания на взрослой стадии.

Характеристика личиночной стадии развития SG может помочь не только лучше понять его морфологию и функциональные адаптации, но также может помочь в оценке новых вмешательств, которые нацелены на этот орган посредством редактирования генов ключевых регуляторов SG. Поскольку все предыдущие исследования архитектуры личиночных слюнных желез предшествовали иммуноокрашиванию и современным методам визуализации10,11,мы разработали протокол выделения и окрашивания слюнных желез различными антителами и клеточными маркерами12. Это видео демонстрирует этот подход к извлечению, фиксации и окрашиванию личинок SGs из личинок Anopheles gambiae L4 для конфокальной визуализации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка растворов и инструментов

  1. Приготовление раствора для рассечения
    1. Для приготовления рассеченного раствора добавляют 2,5 мл 100% этанола к 7,5 мл дистиллированногоH2Oв пластиковой тубе из 15 штук. Переверните трубку 3 раза, чтобы перемешать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких недель.
  2. Приготовление 10-кратного запаса фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS)
    1. Чтобы приготовить 10 штоков PBS, добавьте 17,8 г Na2HPO4• 2H2O, 2,4 г KH2PO4,80 г NaCl и 2 г KCl до 800 мл деионизированной воды. Перемешать с перемешиванием на перемешиваемой пластине до полного растворения твердых веществ. Отрегулируйте конечный объем до 1 л с очищенной водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
  3. Подготовка 1x PBS
    1. Добавьте 10 мл 10x PBS к 90 млH2Oв стерильной стеклянной бутылке. Плотно закройте крышку и переверните в 3 раза, чтобы перемешать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор можно хранить при температуре 4 °C в течение нескольких недель.
  4. Приготовление фиксатора.
    1. Добавьте 600 мкл метанола к 200 мкл ледяной уксусной кислоты. Каждый раз делайте раствор свежим.
  5. Конструкция шпаклевочной пластины (тарелка для культивирования тканей, заполненная силиконовой резиной)
    1. Смешайте компоненты (1:50) эпоксидной смолы (1 г) и воды (50 мл) и перелейте смесь в чашку Петри. Подождите, пока компоненты высохнут перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После постройки шпаклевочная пластина может использоваться в течение многих лет.

2. Рассечение железы(рисунок 1А)

  1. Собирайте личинок L4 поздней стадии (~10 дней после вылупления; Рисунок 2) из лотков для кормления с использованием пластиковой передаточной пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите это полезное онлайн-руководство по стандартному разведению комаров и культуре личинок13.
    1. Поместите шпаклевочную пластинку на ступень рассекающего микроскопа и перенесите личинок на шпаклевочную пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При аликвотировании личинок для первоначального рассечения полезно перенести ~ 10 личинок на слайд за один раз с помощью пластиковой переносной пипетки.
  2. Поместите каплю раствора для рассечения (1:3 EtOH:H2O) на шпаклевочную пластину отдельно от 10 личинок.
  3. Используйте пластиковую переносную пипетку или одноразовую стеклянную пипетку, чтобы поместить одну личинку L4 в 25% каплю EtOH.
  4. Возьмите щипцы (No 5), по одному в каждой руке, и недоминирующей рукой захватите голову личинки. Используя доминантную руку, схватите личинку щипцами чуть ниже головы и осторожно потяните с минимальной постоянной силой, чтобы голова отделялась от остальной части тела, а железы оставались прикрепленными к голове. Отбросьте часть тела туши личинки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При вскрытии установите бумажное полотенце рядом, чтобы собрать туши личинок.
  5. Соберите головные железы в 1 мл 1x PBS в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл. Используйте 1 мл PBS для ~ 40 рассеченных желез с прикрепленными головками. Подождите, пока головки/СГ опустятся на дно буфера.

3. Фиксация для окрашивания антителами(рисунок 1B)

  1. Дренируйте PBS, начиная с верхней части трубки микроцентрифуги, используя стеклянную передаточную пипетку, избегая липких тканей комара и удаляя как можно больше раствора PBS, не повреждая ткани. Замените раствор 800 мкл смеси метанола 3:1 с уксусной кислотой ледниковой. Поместите в тубу при температуре 4 °C на ночь (рекомендуется 12-24 ч; предпочтительно 19 ч).
  2. На следующий день слейте раствор и замените его 1 мл холодного 100% ацетона. Оставьте на 90 с.
  3. Удалите ацетон и осторожно промойте ткани три раза по 1 мл 1x PBS каждый раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны медленно всплывать вместе с потоком, а затем падать обратно на дно трубы к моменту завершения каждого добавления PBS.

4. Иммуноокрашивание(рисунок 1B)

  1. Добавляют первичное антитело (например, Rab11) в соответствующем разведении (1:100) в 200 мкл от общего объема 1x PBS. Аккуратно покрутите содержимое трубки кончиком пипетки. Инкубировать в течение ночи при 4 °C.
  2. Удалите раствор первичного антитела и трижды промыть 1 мл 1x PBS (осторожно пипетку в пипетку и из нее).
  3. Добавляют вторичное антитело (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) в соответствующем разведении (1:200) в 200 мкл общего объема. Аккуратно покрутите содержимое трубки кончиком пипетки. Инкубировать при комнатной температуре в течение 90 мин.
  4. Добавьте красители, такие как Nile Red (липиды, 5 мкл 1 мкг/мкл) и/или Hoechst (ДНК, 3 мкл 1 мкг/мкл), в 200 мкл PBS на этом этапе. Инкубировать при комнатной температуре еще 60 мин. Аккуратно вымойте три раза с 1x PBS.

5. Монтаж окрашенных желез для микроскопии(рисунок 1С)

  1. Пипетка 200 мкл 100% глицерина на предметном стекле микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку глицерин вязкий, оставьте кончик пипетки в жидкости до тех пор, пока он не достигнет соответствующего объема. Не наблюдалось сокращения тканей при переходе прямо в 100% глицерин. Тем не менее, исследователи могут пройти через промывки 30% и 50% глицерина в пробирках, прежде чем перемещать образцы в 100% глицерин.
  2. Перенесите окрашенные головки (до 20 на слайд) с прикрепленными железами (вместе с другими внутренними структурами) на предметное стекло микроскопа с помощью мягкой кисти(рисунок 3А). Распределите образцы так, чтобы они равномерно распределились по стеклянной горке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При отложении желез на затворе щеткой щипцы можно использовать для мягкой ориентации СГ так, чтобы все они были ориентированы в одном направлении.
  3. Рассматривая под рассекающим микроскопом, отделите личиночную головку от желез с помощью двух пар щипцов и осторожно потяните две ткани в противоположных направлениях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку трудно полностью изолировать СГ, просто удалите головки, оставив СГ и связанные с ними внутренние структуры. Даже если SG остаются связанными с другими тканями, они легко распознаются при окрашивании Hoechst и другими маркерами(Рисунок 3B,C).
  4. Снимите и выбросьте головки и повторите процесс разделения для каждого SG.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При снятии головок установите бумажное полотенце рядом, чтобы собрать их.
  5. Аккуратно поместите сверху обшивку толщиной 1,5 мм (избегая пузырьков воздуха) и запечатайте прозрачным лаком для ногтей.
  6. Хранить при температуре 4 °C в светонепроницаемом контейнере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовленные слайды окрашенных желез можно хранить при температуре 4 °C в темноте от шести месяцев до одного года без каких-либо заметных изменений качества. Если глицерин начинает просачиваться с течением месяцев, осторожно поднимите крышку и пипетку в большее количество глицерина, чтобы заполнить отверстия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Слюнные железы относительно легко рассекаются от всех личинок 4 стадии. Личинки самцов и самок можно отличить на поздней личиночной стадии L4 по красной полосе вдоль спинной грудной клетки самок, но не самцов(рисунок 2). Мы также наблюдаем, что антеннальная морфология гораздо более сложна у самцов, чем у самок личинок L4(рисунок 2),аналогично различиям, наблюдаемым в этой структуре у взрослых комаров. Наряду со значительным общим ростом во время стадии L4, слюнн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол, описанный в настоящем описании, был адаптирован из протокола рассечения Drosophila SG и протокола рассечения взрослых комаров14,15,16. Однако большинство маркеров не проникали через базальную мембрану (данные не показаны) при использовании взрослых методов рассечения и окрашивания SG. Адаптация протокола для взрослых включала рассечение желез в 25% растворе EtOH, промывание желез комбинацией MeOH и ледниковой уксусной ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Научно-исследовательский институт по борьбе с малярией Университета Джона Хопкинса за доступ к личинкам An. gambiae и их выращивание.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
  KH2PO4Millipore SigmaP9791
  Na2HPO4 • 2H2OMillipore Sigma71643
  NaClMillipore SigmaS7653
АцетонMillipore Sigma179124
Кисть с мягкой щетинойAmazon (SN NJDF) Набор кистей для рисованиядеталей B08LH63D89
Покровные накладки (22 x 50 мм)VWR48393-195
DAPI (DNA)ThermoFisher ScientificD1306
Этиловый спирт 200 градусовMillipore SigmaEX0276
Пипетка Gilson Pipetman P200 ПипеткаGilsonP200
Ледяная уксусная кислотаSigma Aldrich695092
Jewelers щипцы, Dumont No. 5Millipore SigmaF6521
KClMillipore Sigma58221
МетанолMillipore Sigma1414209
Лак для ногтейАмазонка (Салли Хансен)B08148YH9M
Нил красный (липид)ThermoFisher ScientificN1142
Бумажные полотенца/салфеткиULINES-7128
Пластина Петри (для изготовления шпаклевочной пластины)ThermoFisher ScientificFB0875712
Наконечники для пипетокGilsonTips E200ST
Пластиковая трансферная пипеткаFisher НаучныеS304671
первичные антитела (например, Crb, Rab11)Исследования развития Банк гибридом (DSHB); Andrew LabMouse anti-Crb (Cq4) или Rabbit anti-Rab11
Вторичные антитела с флуоресцентными метками (например, Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit)ThermoFisher ScientificA11008
Силиконовая смола и отвердитель для шпатлевочной пластиныDow Chemicals - Ximeter SiliconePMX-200
Slides, матовые с одного конца для маркировкиVWR  20 X 50 мм48393-195
Агглютинин зародышей пшеницыThermoFisher ScientificW834

Ссылки

  1. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020).
  2. Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
  3. Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553(2020).
  4. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  5. Rostami, M. N. CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections. Parasite Immunology. 42 (9), 12762(2020).
  6. Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. Elife. 4, 09672(2015).
  7. Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti. Mosquito News. 41 (1), 115(1981).
  8. Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. Role of mosquito saliva in blood vessel location. Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).
  9. Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells. PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872(2016).
  10. Rishikesh, N. Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto. Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).
  11. Jensen, D. V., Jones, J. C. The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae). Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824(1957).
  12. Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands. Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).
  13. Benedict, M. Q. MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/ VectorResources/2016%20Methods%20in%20Anopheles%20Research%20full%20manual.pdf (2015).
  14. Wells, M. B., Andrew, D. J. Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Parasites & Vectors. 8, 617(2015).
  15. Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601(2017).
  16. Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238(2019).
  17. Clements, A. N. The physiology of mosquitoes. , Pergamon Press. Paris. (1963).
  18. Imms, A. D. On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen. Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).
  19. Favia, G., et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).
  20. Neira Oviedo, M., et al. The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).
  21. Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
  22. Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Вскрытие и иммуноокрашивание личиночных слюнных желез комаров Anopheles gambiae
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.