Слюнная железа взрослого комара (SG) необходима для передачи всех переносимых комарами патогенов их человеческим хозяевам, включая вирусы и паразитов. Это видео демонстрирует эффективную изоляцию SGs от личиночных (L4) стадии комаров Anopheles gambiae и подготовку SGs L4 для дальнейшего анализа.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Вскрытие и иммуноокрашивание личиночных слюнных желез комаров Anopheles gambiae
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Слюнные железы комаров (SGs) являются необходимым органом-шлюзом для передачи патогенов, переносимых насекомыми. Болезнетворные агенты, в том числе вирусы и паразиты Plasmodium, вызывающие малярию, накапливаются в секреторных полостях SG-клеток. Здесь они готовы к передаче своим позвоночным хозяевам во время последующей кровяной трапезы. Поскольку взрослые железы формируются как развитие остатков почек личиночного протока SG, которые сохраняются после раннего гистолиза pupal SG, личиночный SG является идеальной мишенью для вмешательств, ограничивающих передачу заболевания. Понимание развития личиночного SG может помочь лучше понять его морфологию и функциональные адаптации и помочь в оценке новых вмешательств, которые нацелены на этот орган. Этот видеопротокол демонстрирует эффективную технику выделения, фиксации и окрашивания личинок SGs от комаров Anopheles gambiae. Железы, рассеченные из личинок в 25% растворе этанола, фиксируют в смеси метанола и ледниковой уксусной кислоты с последующей холодной промывкой ацетоном. После нескольких полосканий в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) SGs могут быть окрашены широким спектром маркерных красителей и / или антисывороток против SG-экспрессированных белков. Этот метод выделения личинок SG также может быть использован для сбора ткани для анализа гибридизации in situ, других транскриптомных применений и протеомных исследований.
Введение
Малярия является серьезной угрозой общественному здравоохранению, вызывающей почти 230 миллионов инфекций и, по оценкам, 409 000 смертей в 2019году 1. Большинство смертей происходит в странах Африки к югу от Сахары и вызваны паразитом Plasmodium falciparum, переносчикомнасекомых которого является Anopheles gambiae,предмет этой видеодемонстрации. Хотя цифры указывают на значительное снижение годового уровня смертности с начала века (>300 000 меньше ежегодных смертей), многообещающее снижение показателей заболеваемости, наблюдаемое с 2000 по 2015 год, сокращается, что свидетельствует о необходимости новых подходов к ограничению ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка растворов и инструментов
- Приготовление раствора для рассечения
- Для приготовления рассеченного раствора добавляют 2,5 мл 100% этанола к 7,5 мл дистиллированногоH2Oв пластиковой тубе из 15 штук. Переверните трубку 3 раза, чтобы перемешать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких недель.
- Для приготовления рассеченного раствора добавляют 2,5 мл 100% этанола к 7,5 мл дистиллированногоH2Oв пластиковой тубе из 15 штук. Переверните трубку 3 раза, чтобы перемешать.
- Приготовление 10-кратного запаса фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS)
- Чтобы приготовить 10 штоков PBS, добавьте 17,8 г Na2HPO4• 2H2O, 2,4 г KH2PO4,80 г NaCl и 2 г KCl до 800 мл деио....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Слюнные железы относительно легко рассекаются от всех личинок 4 стадии. Личинки самцов и самок можно отличить на поздней личиночной стадии L4 по красной полосе вдоль спинной грудной клетки самок, но не самцов(рисунок 2). Мы также наблюдаем, что антеннальная морфология гораздо более сложна у самцов, чем у самок личинок L4(рисунок 2),аналогично различиям, наблюдаемым в этой структуре у взрослых комаров. Наряду со значительным общим ростом во время стадии L4, слюнн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, описанный в настоящем описании, был адаптирован из протокола рассечения Drosophila SG и протокола рассечения взрослых комаров14,15,16. Однако большинство маркеров не проникали через базальную мембрану (данные не показаны) при использовании взрослых методов рассечения и окрашивания SG. Адаптация протокола для взрослых включала рассечение желез в 25% растворе EtOH, промывание желез комбинацией MeOH и ледниковой уксусной .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Научно-исследовательский институт по борьбе с малярией Университета Джона Хопкинса за доступ к личинкам An. gambiae и их выращивание.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Ацетон | Millipore Sigma | 179124 | |
| Кисть с мягкой щетиной | Amazon (SN NJDF) Набор кистей для рисования | деталей B08LH63D89 | |
| Покровные накладки (22 x 50 мм) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Этиловый спирт 200 градусов | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Пипетка Gilson Pipetman P200 Пипетка | Gilson | P200 | |
| Ледяная уксусная кислота | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Jewelers щипцы, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Метанол | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Лак для ногтей | Амазонка (Салли Хансен) | B08148YH9M | |
| Нил красный (липид) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Бумажные полотенца/салфетки | ULINE | S-7128 | |
| Пластина Петри (для изготовления шпаклевочной пластины) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Наконечники для пипеток | Gilson | Tips E200ST | |
| Пластиковая трансферная пипетка | Fisher Научные | S304671 | |
| первичные антитела (например, Crb, Rab11) | Исследования развития Банк гибридом (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) или Rabbit anti-Rab11 | |
| Вторичные антитела с флуоресцентными метками (например, Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Силиконовая смола и отвердитель для шпатлевочной пластины | Dow Chemicals - Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Slides, матовые с одного конца для маркировки | VWR 20 X 50 мм | 48393-195 | |
| Агглютинин зародышей пшеницы | ThermoFisher Scientific | W834 |
Ссылки
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020).
- Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
- Adolfi, A., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
