Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Магнитный пинцет в формате микропланшета

1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62994

⸱

9 февраля 2022 г.

 , 
1Department of Oncology and Metabolism, University of Sheffield

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье мы описываем использование нового анализа на микропланшетах для обеспечения механических манипуляций с биомолекулами при выполнении ансамблевых биохимических анализов. Это достигается с помощью крышки микропланшета, модифицированной с помощью магнитов для создания нескольких статических магнитных пинцетов поперек микропланшета.

Аннотация

Механобиология описывает, как физические силы и механические свойства биологического материала влияют на физиологию и болезни. Как правило, эти подходы представляют собой ограниченные одномолекулярные методы, что ограничивает их доступность. Чтобы удовлетворить эту потребность, был разработан микропланшетный анализ, который позволяет проводить механические манипуляции при выполнении стандартных биохимических анализов. Это достигается с помощью магнитов, встроенных в крышку микропланшета для создания нескольких магнитных пинцетов. В этом формате сила воздействует на биомолекулы, соединенные с парамагнитными шариками, эквивалентными типичному магнитному пинцету. Исследование демонстрирует применение этого инструмента с анализами на основе FRET для мониторинга конформаций белков. Тем не менее, этот подход широко применим к различным биологическим системам, начиная от измерения ферментативной активности и заканчивая активацией сигнальных путей в живых клетках.

Введение

Механобиология фокусируется на понимании того, как распространение физических сил внутри и между клетками регулирует клеточную активность 1,2 и как это коррелирует с организацией и динамикой как белков, так и клеток.

Измерения силы на отдельных молекулах показали, как сила используется в биологических системах, от отдельных белков до целых клеток и тканей 3,4,5,6,7. Эти сложные эксперименты требуют специализированного оборудования и технических знаний. И наоборот, стандартные биохимические анализы могут быть выполнены с более высокой производительностью в легкодоступном коммерческом оборудовании.

В данном исследовании описывается механобиологический анализ, которыйпозволяет проводить манипуляции с помощью магнитных пинцеров и биохимические анализы 8. Магниты размещены на напечатанной на 3D-принтере крышке микропланшета (рис. 1A-D), что позволяет использовать коммерческие считыватели пластин для проведения анализов. Сила прикладывается к исследуемой биомолекуле путем связывания молекулы с парамагнитными частицами. Затем магниты оказывают натяжение на молекулу. Изменение расстояния между частицами и магнитами регулирует силу, приложенную к биомолекуле (рис. 1E).

Мы представляем использование этого анализа с использованием молекулярного мотора на основе актина, миозина VI. Миозин VI регулируется внутримолекулярным обратным сворачиванием9. Было показано, что миозин VI существует в аутоингибированном состоянии, при этом связывание партнерских белков, таких как NDP52, запускает разворачивание миозина VI10,11. Для проведения этих анализов мы будем использовать двойную меченую конструкцию хвостового домена миозина VI с N-концевым GFP и C-концевым RFP, в результате чего обратное сворачивание белка генерирует флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) между GFP и RFP. N-конец также несет метку биотинилирования для иммобилизации белка на поверхности. Мы используем этот анализ в сочетании с измерениями FRET, чтобы показать, как сила может влиять на обратное сворачивание миозина VI.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Образцы белков, необходимые для этого эксперимента, и список реагентов можно найти в Таблице материалов. Эквивалентные белки должны быть получены для того, чтобы система исследования пользователя могла измерить изменения конформации.

1. 3D магнитная крышка с принтом

  1. Спроектируйте крышку микропланшета для размещения магнитов внутри 24-луночного микропланшета. Пример файла САПР можно скачать с GitHub12. Измерения показаны на рисунке 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высота пьедестала может быть изменена, чтобы изменить расстояние между магнитами и поверхностью, чтобы изменить приложенную силу. Кроме того, конечная сила, действующая на частицу, зависит от размера частицы и зазора между парой магнитов. Уравнения для расчета приложенной силы для частиц размером 1 мкм и 2,8 мкм с зазорами 0,5 мм, 1 мм и 2 мм приведены в Dos Santos et al.8. Для описанных здесь экспериментов с частицами размером 2,8 мкм и зазором 2 мм используйте уравнение 1.
    Уравнение 1: figure-protocol-1
  2. 3D-печать крышки микропланшета с использованием полиэтилентерефталатгликоля (PETG) на системе 3D-принтера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте принтер с разрешением слоя 0,02 мм для обеспечения точности и воспроизводимости. Влияние точности принтера обсуждалось в Dos Santos et al.8.
  3. Прикрепите пары 5 мм кубических неодимовых магнитов N42 с помощью клея к пьедесталам так, чтобы магнитные полюса были ориентированы так, чтобы создать поле, направленное к нижней части микропластины.
  4. Оставьте по крайней мере 1 позицию пустой, чтобы она действовала как регулятор без магнита.
  5. Хранить в герметичной упаковке достаточного размера, чтобы можно было легко установить и снять крышку.

2. Модификация поверхности микропланшетов

  1. Возьмите чистый необработанный микропланшет со стеклянным дном на 24 лунки.
  2. Промойте лунки 3 раза 500 мкл промывочного буфера (50 мМ Tris-HCl (pH 7,5) и 50 mM NaCl) при комнатной температуре.
  3. Добавьте 200 мкл биотина-BSA (0,2 мг/мл) в буфер для промывки и оставьте его в покое на 15 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биотин-БСА используется как для пассивации, так и для прикрепления. Можно использовать другие стратегии пассивации и прикрепления поверхности. При первом использовании и оптимизации концентрация биотина-БСА может варьироваться до 1 мг/мл.
  4. Промойте лунки 3 раза 500 μл промывочного буфера.
  5. Добавьте 200 мкл стрептавидина (20 мкг/мл) в буфер для стирки и оставьте в покое на 15 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При первом применении концентрация стрептавидина может варьироваться до 1 мг/мл.
  6. Удалите раствор, а затем промойте лунки 3 раза с помощью промывочного буфера.
  7. Накройте лунки 500 μл промывочного буфера.
  8. Хранить при температуре 4 °C до использования. Тарелки следует использовать в тот же день.

3. Подготовка образца: иммобилизация белка

  1. Дайте микропланшету с модифицированной поверхностью нагреться до комнатной температуры.
  2. Промойте лунки 500 μл промывочного буфера.
  3. Добавьте 100 нМ биотин-eGFP-Myosin VI Tail-mRFP (исходный образец белка) и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре в промывном буфере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот пример белка получен в соответствии с описанием Dos Santos et al.8. Концентрации и время инкубации могут варьироваться в зависимости от белка.
  4. Промойте лунки 3 раза 500 μл промывочного буфера.
  5. Настройте считыватель пластин для записи спектров флуоресценции для GFP (возбуждение 490 нм и излучение 510-600 нм) и RFP (возбуждение 560 нм и излучение 580-650 нм) для подтверждения наличия гибридных белков.
  6. Если наблюдается недостаток белка, увеличьте концентрацию на шаге 3.3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плохое связывание может быть связано с недостаточным связыванием биотина-БСА и/или стрептавидина, и, следовательно, их количество может быть увеличено в 10 раз.
  7. Если возможно, проведите измерение с помощью сканирования лунки, чтобы определить, связан ли гибридный белок с микропланшетом (Рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это измерение будет записывать интенсивность флуоресценции в определенных точках микропланшетной лунки. Он покажет, связан ли белок через лунку.
  8. Убедитесь, что сигнал равномерный (в пределах 5%) в центре лунки, где происходит измерение анализа.

4. Подготовка магнитных шариков

  1. Вихревой флакон из 2,8 мкм парамагнитных шариков с рекомбинантным белком А (Таблица материалов) в течение 30 с для ресуспендирования шариков.
  2. Перенесите объем, соответствующий 1 мг парамагнитных шариков, в пробирку объемом 1,5 мл.
  3. Поместите трубку в магнитный изолятор (Таблица материалов), а затем удалите надосадочную жидкость.
  4. Суспендируйте шарики в 200 мкл PBS, осторожно дозируя раствор вверх и вниз.
  5. Поместите трубку в магнитный изолятор, а затем извлеките надосадочную жидкость.
  6. Повторите шаг стирки 3 раза.
  7. Разведите 10 мкг антитела Anti-RFP в 200 мкл PBS.
  8. Изолируйте шарики в магнитном изоляторе, а затем повторно суспендируйте в растворе антитела.
  9. Вращайтесь со скоростью 20 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре на настольном ротаторе.
  10. Поместите трубку в магнитный изолятор и удалите надосадочную жидкость.
  11. Стирайте 3 раза в PBS.
  12. Ресуспендируйте шарики в 200 μл буфера для стирки.
  13. Чтобы подтвердить иммобилизацию антител на бусинах, инкубируйте бусины, загруженные антителами, с раствором белка-синтеза >1 мкМ RFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуально подтвердите, выделен ли белок с помощью шариков.
  14. В качестве альтернативы можно измерить интенсивность флуоресценции надосадочной жидкости (возбуждение 560 нм и излучение 580-650 нм) для RFP в флуоресцентном спектрометре.

5. Подготовка образца: Крепление борта

  1. Добавьте 10 мкг парамагнитного слияния шариков и антител, разведенных в буфере для промывки (200 мкл), в лунки микропланшетов, связанных с белками.
  2. Не размещайте бусины в одну контрольную лунку, чтобы проверить влияние бусин на флуоресцентный сигнал. Подготовьте контрольный образец без антител, чтобы определить любые неспецифические взаимодействия с шариками.
  3. Инкубируйте микропланшет при комнатной температуре в течение 30 минут.
  4. Промойте лунки 3 раза 500 μл промывочного буфера.
  5. Если это доступно на месте, убедитесь, что шарики привязаны к поверхности на светлопольном микроскопе. Если шариков не хватает, увеличьте концентрацию на шаге 5,1 до 500 мкг/мл.

6. Сбор данных

  1. Поместите микропланшет без крышки в люминесцентный считыватель пластин при температуре 25 °C.
  2. Настройте планшетный ридер для записи спектров флуоресценции для GFP (возбуждение 490 нм и излучение 510-600 нм) и RFP (возбуждение 560 нм и излучение 580-650 нм) для подтверждения наличия гибридных белков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте/запишите спектры флуоресценции через нижнюю часть микропланшета, чтобы поместить крышку сверху. Поэтому следует выбрать подходящий считыватель микропланшетов.
  3. Запишите флуоресцентный спектр FRET (возбуждение 490 нм и излучение 510-650 нм) или контролируйте флуоресценцию на длинах волн 510 нм и 610 нм с возбуждением на длине волны 490 нм. Это настраивается в соответствии с рекомендациями производителя.
  4. Извлеките микропланшет из считывателя и установите магнитную крышку.
  5. Вернитесь к считывателю планшетов и оставьте образец на 2 минуты.
  6. Повторите измерение FRET, как в шаге 6.3.

7. Анализ данных

  1. Экспортируйте данные для импорта в таблицу (например, Excel).
  2. Вручную извлеките данные для донорской GFP на длине волны 510 нм и акцепторной RFP на длине волны 610 нм.
  3. Рассчитайте относительный FRET с помощью уравнения 2 для каждого условия.
    Уравнение 2: figure-protocol-2
    A: интенсивность акцептора (RFP 610 нм), D: интенсивность донора (GFP 510 нм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте рекомбинантный RFP при тех же условиях возбуждения и излучения для контроля фонового возбуждения акцептора.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 2 показан пример измерения с помощью сканирования скважины, в котором интенсивность флуоресценции GFP была зарегистрирована с интервалом в 1 мм по всей лунке микропланшета. Типичные измерения флуоресценции выполняются в центральном положении микропланшетной лунки (положение 8,8 на рис. 2); Поэтому важно, чтобы в этом месте был связанный белок. Как показано на рисунке 2, интенсивность наиболее высока в центре скважины в ра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Такой подход позволяет легко применять измерения на основе силы в микропланшете с помощью считывателей флуоресцентных пластин. Важно отметить, что этот формат анализа предполагает, что существует функциональный белок, когда он связан с поверхностью. Таким образом, прежде чем приступать к этим измерениям, требуются предварительные знания, чтобы убедиться в активности белка. Также полезно убедиться, что связывание молекул с парамагнитными шариками и поверхностью оптимизировано для каждой с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы благодарим Cancer Research UK (A26206), MRC (MR/M020606/1) и Королевское общество (RG150801) за финансирование.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
24-луночный микропланшет со стеклянным дномCellvisP24-1.5H-NДоступны несколько источников. Если в этом нет необходимости, лучше избегать обработанных поверхностей, и мы используем стекло класса Imaging N1.5.
Антитело против RFPAbcamab290Доступны несколько источников, но необходимо обеспечить минимальную реакцию с GFP.
Настольный световой микроскопOptikaIM-3
Настольный вращательCole-Palmer-StuartSB3
Biotin-BSASigma AldrichA8549
CAD программное обеспечение - Sketch Up EducatorSketch UpМожно использовать альтернативные программы САПР. Пользователи должны убедиться, что форматы файлов совместимы с их 3D-принтером.
Dynabeads Protein AFisher Scientific107467132.8 & микро; m парамагнитные шарики с рекомбинантным протеином А
Ударный контактный клейEVO-STIK
Магнитный разделитель MagnaRackМагнитный изолятор ThermoFisher ScientificCS15000
NaClFisher Scientific10316943
Неодим N42 5 мм кубические магнитыSupermagneteW-05-N
Считыватель пластин - ClarioStarBMG LabtechВсе системы считывателей пластин могут использоваться там, где измерения возможны из-под микропланшета. Магнитная крышка исключает стандартные измерения сверху
StreptavidinSigma Aldrich189730
Tris-HClFisher Scientific10142400
Ultimaker PETG FilamentUltimaker Ultimaker
S3 - 3D-принтерUltimaker

Ссылки

  1. Jansen, K. A., et al. A guide to mechanobiology: Where biology and physics meet. Biochimica et Biophysica Acta. 1853, 3043-3052 (2015).
  2. Dos Santos, A., Toseland, C. P. Regulation of nuclear mechanics and the impact on dna damage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3178(2021).
  3. Dos Santos, A., et al. DNA damage alters nuclear mechanics through chromatin reorganization. Nucleic Acids Research. 49 (1), 340-353 (2020).
  4. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171, 1397-1410 (2017).
  5. Lherbette, M., et al. Atomic force microscopy micro-rheology reveals large structural inhomogeneities in single cell-nuclei. Scientific Reports. 7, 8116(2017).
  6. Seo, D., et al. A mechanogenetic toolkit for interrogating cell signaling in space and time. Cell. 165, 1507-1518 (2016).
  7. Yao, M., et al. The mechanical response of talin. Nature Communications. 7, 11966(2016).
  8. Dos Santos, A., Fili, N., Pearson, D. S., Hari-Gupta, Y., Toseland, C. P. High-throughput mechanobiology: Force modulation of ensemble biochemical and cell-based assays. Biophysical Journal. 120, 631-641 (2021).
  9. Fili, N., Toseland, C. P. Unconventional myosins: How regulation meets function. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 67(2019).
  10. Fili, N., et al. Competition between two high- and low-affinity protein-binding sites in myosin VI controls its cellular function. Journal of Biological Chemistry. 295, 337-347 (2020).
  11. Fili, N., et al. NDP52 activates nuclear myosin VI to enhance RNA polymerase II transcription. Nature Communications. 8, 1871(2017).
  12. MagPlate at GitHub. , Available from: https://github.com/cptoseland/MagPlate (2021).
  13. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6, 85-95 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FRET
Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.