Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка потребления аминокислот в культивируемых костных клетках и изолированных костных стержнях

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62995

⸱

13 апреля 2022 г.

 , 
1Department of Internal Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Charles and Jane Pak Center for Mineral Metabolism and Clinical Research, University of Texas Southwestern Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол представляет собой радиоактивный анализ поглощения аминокислот, который полезен для оценки потребления аминокислот либо в первичных клетках, либо в изолированных костях.

Аннотация

Развитие костей и гомеостаза зависит от дифференцировки и активности костеобразующих остеобластов. Дифференцировка остеобластов последовательно характеризуется пролиферацией, за которой следует синтез белка и, в конечном счете, секреция костного матрикса. Пролиферация и синтез белка требуют постоянного поступления аминокислот. Несмотря на это, очень мало известно о потреблении аминокислот в остеобластах. Здесь мы описываем очень чувствительный протокол, который предназначен для измерения потребления аминокислот с использованием радиомаркированных аминокислот. Этот метод оптимизирован для количественной оценки изменений в поглощении аминокислот, которые связаны с пролиферацией или дифференцировкой остеобластов, медикаментозным лечением или лечением фактора роста или различными генетическими манипуляциями. Важно отметить, что этот метод может быть использован взаимозаменяемо для количественной оценки потребления аминокислот в культивируемых клеточных линиях или первичных клетках in vitro или в изолированных костных стволах ex vivo. Наконец, наш метод может быть легко адаптирован для измерения транспорта любой из аминокислот, а также глюкозы и других радиоактивных меток питательных веществ.

Введение

Аминокислоты представляют собой органические соединения, которые содержат амино (-NH2) и карбоксильные (-COOH) функциональные группы с переменной боковой цепью, специфичной для каждой аминокислоты. В целом, аминокислоты хорошо известны как основная составляющая белка. Совсем недавно были выяснены новые применения и функции аминокислот. Например, отдельные аминокислоты могут метаболизироваться с образованием промежуточных метаболитов, которые способствуют биоэнергетике, функционируют как ферментативные кофакторы, регулируют активные формы кислорода или используются для синтеза других аминокислот 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Многие исследования показывают, что метаболизм аминокислот имеет решающее значение для плюрипотентности клеток, пролиферации и дифференцировки в различных контекстах 3,6,11,12,13,14,15,16,17.

Остеобласты являются секреторными клетками, которые производят и секретируют коллаген типа 1, богатый внеклеточным костным матриксом. Чтобы поддерживать высокие темпы синтеза белка во время формирования костей, остеобласты требуют постоянного предложения аминокислот. Чтобы удовлетворить этот спрос, остеобласты должны активно приобретать аминокислоты. В соответствии с этим, недавние исследования показывают важность поглощения аминокислот и метаболизма в активности остеобластов и формировании костей 15,16,17,18,19,20.

Остеобласты приобретают клеточные аминокислоты из трех основных источников: внеклеточной среды, внутриклеточной деградации белка и биосинтеза аминокислот de novo. Этот протокол будет сосредоточен на оценке поглощения аминокислот из внеклеточной среды. Наиболее распространенные методы измерения поглощения аминокислот основаны либо на радиомаркированных (например, 3H или 14C), либо на тяжелых изотопах, меченных (например, 13C) аминокислотах. Тяжелые изотопомерные анализы могут анализировать поглощение и метаболизм аминокислот более тщательно и безопасно, но занимают более много времени, чтобы завершить несколько дней, поскольку требуется день для подготовки и дериватизации образцов и несколько дней для анализа на масс-спектрометре в зависимости от количества образцов21,22. Для сравнения, радиоактивные анализы поглощения аминокислот не информативны о последующем метаболизме, но являются дешевыми и относительно быстрыми, будучи в состоянии быть завершенными в течение 2-3 ч с начала эксперимента23,24. Здесь мы описываем легко модифицируемый базовый протокол, предназначенный для оценки поглощения радиоактивными аминокислотами в культивируемых первичных клетках или клеточных линиях in vitro или отдельных костных стволах ex vivo. Применение этих двух протоколов может быть распространено на другие меченые радиоактивными аминокислотами и другими типами клеток и тканей, связанных с костями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все мышиные процедуры, описанные здесь, были одобрены комитетами по изучению животных в Юго-западном медицинском центре Техасского университета в Далласе. Радиационный протокол был одобрен Консультативным комитетом по радиационной безопасности в Юго-западном медицинском центре Техасского университета в Далласе.

1. Поглощение аминокислот в клетках (Протокол I)

  1. Пластина 5 х 104 клетки ST2 в каждой лунке из 12-луночной тканевой культуральной пластины. Пластинчатые клетки в α-MEM, содержащие 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина и 0,1 мкг/мл стрептомицина (Pen/Strep). Пластинчатые дополнительные колодцы ячеек для количественной оценки количества ячеек на условие для нормализации на этапе 1.12. Инкубировать клетки в инкубаторе увлажненной культуры клеток при 37 °C с 5% CO2.
  2. Культивируйте клетки в течение 2-3 дней до слияния.
  3. В день эксперимента готовят следующие растворы: 1x фосфатный буферизованный физиологический раствор (PBS), pH 7,4 и буфер Krebs Ringers HEPES (KRH), pH 8,0: (120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, NaHCO3, 5 мМ HEPES, 1 мМ D-глюкозы). До температуры до 37 °C.
  4. Аспирировать среду и дважды промыть клетки 1 мл 1x PBS, рН 7,4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол также подходит для быстро делящихся несмеющихся клеток. В этом случае важно нормализовать радиоактивность либо до абсолютного числа клеток, либо до содержания ДНК. Кроме того, рассмотрите возможность увеличения размера культуральной пластины или колбы, чтобы увеличить общее количество клеток и значения cpm. Это важно определить эмпирически на индивидуальной основе.
  5. Аспирировать 1x PBS и промыть клетки один раз с 1 мл KRH.
  6. Получают 4 мкКи/мл L-[3,4-3 H]-глутаминовой рабочей среды путем разбавления 4 мкл [1 мкКи мкл-1] L-[3,4-3 H]-глутаминового запаса на 1 мл КРГ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием радиоактивных материалов, пожалуйста, свяжитесь с Управлением радиационной безопасности в вашем домашнем учреждении для получения разрешений. Все процедуры, связанные с облучением, должны выполняться за щитом из оргстекла.
  7. Инкубировать клетки с 0,5 мл КРГ, содержащим 4 мкКи/мл L-[3,4-3 Ч]-глутаминовой рабочей среды в течение 5 мин.
  8. Соберите радиоактивную среду и раздайте в контейнер для жидких отходов. Промыть клетки три раза ненадолго ледяным КРГ, чтобы прекратить реакцию. Соберите и выбросьте все смывы в контейнер с радиоактивными жидкими отходами.
  9. Добавьте 1 мл 1% SDS в каждую лунку и тритурируйте 10x для лизирования и гомогенизации клеток. Переложите лизаты клеток в пробирки объемом 1,5 мл. Выбросьте пластины для посева клеток, серологические пипетки и наконечники пипеток в контейнер для твердых радиоактивных отходов.
  10. Центрифуга при >10 000 х г в течение 10 мин. Переложите супернатанты на сцинтилляционные флаконы, содержащие 8 мл сцинтилляционного раствора. Энергично перемешайте, энергично встряхнув сцинтилляционные флаконы. Выбросьте трубки и наконечники пипеток в контейнер для твердых радиоактивных отходов.
  11. Считывание радиоактивности в количествах в минуту (cpm) с помощью сцинтилляционного счетчика. Выбросьте сцинтилляционные флаконы в контейнер для отходов сцинтилляционных флаконов.
  12. Трипсинизировать, повторно суспендировать и подсчитать клетки из оставшихся нерадиоактивных пластин клеток (см. шаг 1.1) для оценки количества клеток в лизированных, радиоактивных культурах. Используя гемоцитометр, подсчитайте количество клеток на нерадиоактивную скважину для каждого экспериментального состояния. Нормализуйте cpm от шага 1.11 до расчетного числа клеток из нерадиоактивных пластин.
  13. После завершения эксперимента обеззаражьте капюшон клеточной культуры, скамейку и все инструменты радиоактивным обеззараживающим спреем. Наконец, выполните тесты на протирание, чтобы убедиться, что рабочая зона свободна от радиации.

2. Поглощение аминокислот в свежеизолированных костных тканях (Протокол II)

  1. Догрева КРХ до 37 °C.
  2. Усыплите 3-дневную мышь и удалите кожу на руках. Расчлените плечевую кость от плеча ножницами и рассекните обе плечевые кости. Удалите все экстемпоральные ткани с помощью скальпеля и щипцов. Удалите эпифизы из кости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к плечевой кости, этот протокол может быть адаптирован к неонатальным бедренным, большеберцовым и кальвариям, а также к плечевой кости, бедренной кости и большеберцовой кости, выделенным у 2- и 4-месячных мышей (неопубликованные данные).
  3. Вымывайте костный мозг из кости и взвешивайте костные стержни для нормализации на этапе 2.14.
  4. Вскипятите одну плечевую кость в 1x PBS при 100 °C в течение 10 мин для децеллюляризации кости. Децеллюляризированная кипяченая кость используется в качестве отрицательного контроля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве контроля качества парафин встраивал в кипяченые и некипяченные кости для гистологических пятен, чтобы визуально подтвердить, что кипячение было эффективным в децеллюляризации кости.
  5. Уравновешивают обе плечевые кости в 1 мл КРГ в течение 30 мин в инкубаторе клеточных культур при 37 °C.
  6. Получают рабочий раствор из 4 мкКи/мл L-[2,3,4-3 H]-аргинина в КРГ путем разбавления 4 мкл 1 мкКи/мкл L-[2,3,4-3 H]-запаса аргинина на 1 мл КРГ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол подходит для оценки поглощения любого выбранного радиомаркированного питательного вещества. L-[2,3,4-3 H]-глютамин, L-[14CU]-аланин и L-[2,3-3 H]-пролин были протестированы с аналогичными результатами. Показано, что данные об аргинине подчеркивают полезность этого протокола.
    ВНИМАНИЕ: Все процедуры с использованием радиации должны выполняться за щитом из плексигласа при использовании соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ).
  7. Инкубируют как экспериментальную, так и кипяченую контрольную кость отдельно в КРГ, содержащую 4 мкКи/мл L-[2,3,4-3 H]-аргинина в течение до 90 мин при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно эмпирически определить время инкубации для различных состояний, включая возраст мышей, различные скелетные элементы и типы радиомеченных аминокислот, выполняя временной курс. Насыщение в основном происходит примерно через 3-4 ч. Поглощение должно быть оценено в точке времени в линейной ярости поглощения.
  8. Извлеките радиоактивную среду и выбросьте в контейнер с жидкими радиоактивными отходами. Промыть плечевую кость три раза, используя ледяной холод 1 мл КРГ, чтобы прекратить реакцию. Выбросьте все смывы в контейнер с жидкими радиоактивными отходами.
  9. Переведите каждую кость в трубку объемом 1,5 мл. Добавьте 500 мкл буфера RIPA [150 мМ NaCl; 5 мМ ЭДТА; 50 мМ Tris (рН 8,0); 0,5% NP40 (об/об); 0,5% DOX (мас./об);0,1% SDS (мас./об)]. Выбросьте тарелки для культивирования, серологические пипетки и наконечники пипеток в контейнер с радиоактивными твердыми отходами.
  10. Гомогенизируйте плечевую кость, измельчив ножницами 100 раз в буфере RIPA.
  11. Ультразвук (амплитуда: 35%, импульс 1 с) полученная гомогенизированная кость в течение 10 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также известно, что обработка ультразвуком производит аэрозоли. Этапы обработки ультразвуком могут быть выполнены в шкафу биологической безопасности. Чтобы уменьшить образование аэрозолей, важно не переполнять трубы. Обработка ультразвуком небольших объемов образца может привести к неполной обработке ультразвуком или потере образца из-за вспенивания. Если происходит вспенивание, центрифугируйте образец в течение 5 минут, чтобы он оседал.
  12. Осветлить лизат центрифугированием в течение 10 мин при >10 000 х г при комнатной температуре. Переложить 200 мкл надосадочного вещества на сцинтилляционные флаконы, содержащие 8 мл сцинтилляционного раствора. Энергично перемешайте, энергично встряхнув сцинтилляционные флаконы. Выбросьте все твердые радиоактивные отходы (например, использованные трубки, наконечники пипеток, пластины и т.д.) в контейнер для твердых радиоактивных отходов.
  13. Считывание радиоактивности (cpm) с помощью сцинтилляционного счетчика. Выбросьте использованные сцинтилляционные флаконы в контейнер для радиоактивных отходов, предназначенный для сцинтилляционных флаконов.
  14. Вычтите cpm кипяченой кости (базальное значение) из cpm экспериментальной кости. Нормализуют радиоактивность с костной массой с шага 2.3.
  15. Распылите на вытяжку для культивирования клеток, инструменты и стенд радиоактивным обеззараживающим средством. Проведите тесты салфетки, чтобы убедиться, что рабочая зона не подвержена радиации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Перенос аминокислот регулируется многими мембранно-связанными переносчиками аминокислот, которые были классифицированы в различные транспортные системы на основе многочисленных характеристик, включая специфичность субстрата, кинетику, а также зависимость от ионов и рН25. Например, поглощение глютамина может быть опосредовано Na+-зависимыми транспортными системами A, ASC, γ+L и N или Na+-независимой системой L. Na+-зависимые системы отличаются способностью заменять ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол, описанный в настоящем описании, обеспечивает быстрый и чувствительный подход к оценке поглощения аминокислот в ответ на различные экспериментальные перестановки либо in vitro, либо ex vivo. По сравнению с коммерчески доступными наборами (например, Glutamine и Glutamate Determination Kit), этот метод гораздо более чувствителен, быстр и менее трудоемкий 16,17,25. В нашем протоколе мы оцениваем поглощени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не раскрывают информацию.

Благодарности

Лаборатория Карнера поддерживается грантами Национального института здравоохранения R01 (AR076325 и AR071967) для C.M.K.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% трипсинGibco25200
12-луночный планшетCorning3513
1 мл шприцBD прецизионный309628
30G иглаBD прецизионный305106
аргинина моногидрохлорид L-[2,3,4-3H]-, 1mCiPerkinElmerNET1123001MC
счетчик сцинтилляции Beckman LS6500
Хлорид кальцияSigmaC1016
Холинахлорид SigmaC7077
D-(+)-раствор глюкозыSigmaG8769
ИнструментЩипцы, ножницы, черешки
DPBSGibco14190
Этилендиаминтетрауксусная кислотаSigmaE9884
HEPES(1M)Gibco15630
L-[3,4-3H(N)]-ГлутаминPerkinElmerNET551250UC
Жидкие флаконы для сцинтилированияSigmaZ190535
Раствор хлорида лития, 8MSigmaL7026
Хлорид магнияSigmaM8266
MEMαGibco12561
Микроцентрифужная пробирка, 15млBiotix89511-256
NP-40Сигма492016
хлорид калияSigmaP3911
Бикарбонат натрияSigmaS6014
Хлорид натрияSigmaS9888
Дезоксихолат натрияSigmaD6750
Додецилсульфат натрияSigma436143
УльтразвуковойSonic& МатериалыVCX130
Tris BaseSigma648311
Ultima Gold (Сцинтилляционный раствор)PerkinElmer6013329
α-(Methylamino)изомасляная кислотаSigmaM2383
для вскрытия аппарат

Ссылки

  1. Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
  2. Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).
  3. Karner, C. M., Long, F. Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts. Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).
  4. Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).
  5. Nagano, T., et al. Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species. Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).
  6. Comes, S., et al. L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation. Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).
  7. Fan, J., et al. Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia. Molecular Systems Biology. 9, 712(2013).
  8. Hosios, A. M., et al. Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells. Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).
  9. Welbourne, T. C. Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney. Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).
  10. Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (3), 552-563 (2015).
  11. Nelsen, C. J., et al. Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression. The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).
  12. Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor. Nature Communications. 7, 11457(2016).
  13. Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
  14. Shiraki, N., et al. Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).
  15. Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
  16. Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation. Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).
  17. Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
  18. Hu, G., et al. The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).
  19. Rached, M. T., et al. FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts. Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).
  20. Elefteriou, F., et al. ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae. Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).
  21. Maleknia, S. D., Johnson, R. Mass spectrometry of amino acids and proteins. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).
  22. Rennie, M. J. An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism. The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).
  23. Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone. Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).
  24. Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. Active transport of amino acids into bone cells. Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).
  25. Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Оценка потребления аминокислот в культивируемых костных клетках и изолированных костных стержнях
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.