Этот протокол представляет собой радиоактивный анализ поглощения аминокислот, который полезен для оценки потребления аминокислот либо в первичных клетках, либо в изолированных костях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оценка потребления аминокислот в культивируемых костных клетках и изолированных костных стержнях
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Развитие костей и гомеостаза зависит от дифференцировки и активности костеобразующих остеобластов. Дифференцировка остеобластов последовательно характеризуется пролиферацией, за которой следует синтез белка и, в конечном счете, секреция костного матрикса. Пролиферация и синтез белка требуют постоянного поступления аминокислот. Несмотря на это, очень мало известно о потреблении аминокислот в остеобластах. Здесь мы описываем очень чувствительный протокол, который предназначен для измерения потребления аминокислот с использованием радиомаркированных аминокислот. Этот метод оптимизирован для количественной оценки изменений в поглощении аминокислот, которые связаны с пролиферацией или дифференцировкой остеобластов, медикаментозным лечением или лечением фактора роста или различными генетическими манипуляциями. Важно отметить, что этот метод может быть использован взаимозаменяемо для количественной оценки потребления аминокислот в культивируемых клеточных линиях или первичных клетках in vitro или в изолированных костных стволах ex vivo. Наконец, наш метод может быть легко адаптирован для измерения транспорта любой из аминокислот, а также глюкозы и других радиоактивных меток питательных веществ.
Введение
Аминокислоты представляют собой органические соединения, которые содержат амино (-NH2) и карбоксильные (-COOH) функциональные группы с переменной боковой цепью, специфичной для каждой аминокислоты. В целом, аминокислоты хорошо известны как основная составляющая белка. Совсем недавно были выяснены новые применения и функции аминокислот. Например, отдельные аминокислоты могут метаболизироваться с образованием промежуточных метаболитов, которые способствуют биоэнергетике, функционируют как ферментативные кофакторы, регулируют активные формы кислорода или используются для синтеза других аминокислот 1,2,....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все мышиные процедуры, описанные здесь, были одобрены комитетами по изучению животных в Юго-западном медицинском центре Техасского университета в Далласе. Радиационный протокол был одобрен Консультативным комитетом по радиационной безопасности в Юго-западном медицинском центре Техасского университета в Далласе.
1. Поглощение аминокислот в клетках (Протокол I)
- Пластина 5 х 104 клетки ST2 в каждой лунке из 12-луночной тканевой культуральной пластины. Пластинчатые клетки в α-MEM, содержащие 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина и 0,1 мкг/мл стрептомицина (Pen/Strep). Пластинчатые дополнительные колодцы ячеек для ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Перенос аминокислот регулируется многими мембранно-связанными переносчиками аминокислот, которые были классифицированы в различные транспортные системы на основе многочисленных характеристик, включая специфичность субстрата, кинетику, а также зависимость от ионов и рН25. Например, поглощение глютамина может быть опосредовано Na+-зависимыми транспортными системами A, ASC, γ+L и N или Na+-независимой системой L. Na+-зависимые системы отличаются способностью заменять .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, описанный в настоящем описании, обеспечивает быстрый и чувствительный подход к оценке поглощения аминокислот в ответ на различные экспериментальные перестановки либо in vitro, либо ex vivo. По сравнению с коммерчески доступными наборами (например, Glutamine и Glutamate Determination Kit), этот метод гораздо более чувствителен, быстр и менее трудоемкий 16,17,25. В нашем протоколе мы оцениваем поглощени.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не раскрывают информацию.
Благодарности
Лаборатория Карнера поддерживается грантами Национального института здравоохранения R01 (AR076325 и AR071967) для C.M.K.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,25% трипсин | Gibco | 25200 | |
| 12-луночный планшет | Corning | 3513 | |
| 1 мл шприц | BD прецизионный | 309628 | |
| 30G игла | BD прецизионный | 305106 | |
| аргинина моногидрохлорид L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| счетчик сцинтилляции Beckman LS6500 | |||
| Хлорид кальция | Sigma | C1016 | |
| Холина | хлорид Sigma | C7077 | |
| D-(+)-раствор глюкозы | Sigma | G8769 | |
| Инструмент | Щипцы, ножницы, черешки | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Глутамин | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Жидкие флаконы для сцинтилирования | Sigma | Z190535 | |
| Раствор хлорида лития, 8M | Sigma | L7026 | |
| Хлорид магния | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Микроцентрифужная пробирка, 15мл | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Сигма | 492016 | |
| хлорид калия | Sigma | P3911 | |
| Бикарбонат натрия | Sigma | S6014 | |
| Хлорид натрия | Sigma | S9888 | |
| Дезоксихолат натрия | Sigma | D6750 | |
| Додецилсульфат натрия | Sigma | 436143 | |
| Ультразвуковой | Sonic& Материалы | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Сцинтилляционный раствор) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)изомасляная кислота | Sigma | M2383 |
Ссылки
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
