Методическая статья

Определение концентрации общего белка и биологически активного белка в молозиве крупного рогатого скота

2.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63001

⸱

10 декабря 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Çanakkale Onsekiz Mart University, 2Uluova Dairy Farm, 3Department of Nutrition, University of Nevada, Reno, 4Department of Food Science and Technology, University of Nebraska, Lincoln, 5Evolve BioSystems Inc.

В этой статье

Краткое содержание

Бычье молозиво является как основным источником питательных веществ, так и иммунологической поддержкой для новорожденного теленка. Понимание уровня терапевтических белков (лактоферрина и IgG) важно для дозирования бычьего молозива и стандартизации для потребления человеком.

Аннотация

Молозиво – это сложная биологическая жидкость, вырабатываемая млекопитающими сразу после родов. Он удовлетворяет все потребности новорожденных в питательных веществах как хороший источник макро- и микроэлементов, биоактивных пептидов и факторов роста. Бычье молозиво также является потенциальным источником питательных веществ и биологически активным из-за богатого содержания белка, который включает иммуноглобулин G (IgG) и лактоферрин. Однако уровень лактоферрина и IgG в коровьем молозиве заметно меняется в период лактации. Поэтому контроль концентрации IgG и лактоферрина для использования бычьего молозива в качестве источника белка является важным вопросом для изучения. Методы, описанные в данной статье, описывают, как определить содержание белка, а также удельные концентрации лактоферрина и IgG. Эти методы включают в себя следующие этапы: выделение белков молозива крупного рогатого скота, определение концентрации белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA), визуализация белков с помощью SDS-PAGE, определение лактоферрина и концентрации IgG с помощью анализа ELISA.

Введение

Молозиво – это начальная секреция молочной железы, вырабатываемая млекопитающими вскоре после родов. Молозиво богато макро- и микроэлементами, антимикробными пептидами и факторами роста 1,2,3,4. Состав постепенно меняется с течением времени при переходе на зрелое молоко 5,6,7, но наиболее значительно в течение 24 ч после родов8. На состав молозива также влияют материнские факторы, включая возраст, паритет, породу, здоровье и состояние питания, а также внешние факторы, включая сезон, преждевременные роды, преждевременную лактацию, факторы обработки молозива (скопление молозива и температура хранения) и индукцию родов 9,10,11. По сравнению со зрелым молоком, молозиво содержит меньше лактозы и больше жира, белка, пептидов, небелкового азота, золы, гормонов, факторов роста, цитокинов, нуклеотидов, витаминов и минералов12. Бычье молозиво содержит широкий спектр белков, включая иммуноглобулины, лактоферрин, α-лактальбумин (α-LA), β-лактоглобулин (β-Lg), лактопероксидазу и несколько факторов роста13. Общая концентрация белка в коровьем молозиве колеблется от 11,26 мг/мл до 169,55 мг/мл14. Содержание белка состоит из сыворотки и казеина в средней концентрации 124,00 мг/мл и 26,00 мг/мл соответственно15. Сывороточная часть содержит три основных типа иммуноглобулинов (Igs): IgG (85%-90%), IgM (7%) и IgA (5%)16. Основным Ig в коровьем молозиве является IgG, который обеспечивает пассивный иммунитет и модулирует адаптивную и врожденную иммунную системы у теленка17. Исходная концентрация Ig в молозиве крупного рогатого скота первого раза может колебаться от 20 до 200 мг/мл и снижаться примерно до 0,4-1,0 мг/мл18. Средняя концентрация IgG составляет примерно 60 мг/мл и неуклонно снижается до уровня ниже 1 мг/мл на протяжении всего перехода к зреломумолоку19.

Другим важным биологически активным белком в молозиве является лактоферрин, железосвязывающий гликопротеин с концентрацией 1,5-5 мг/мл. К свойствам лактоферрина относятся повышение абсорбции железа, а также обладание антимикробной активностью20,21, связывание липополисахаридов, иммуномодуляция, стимуляция роста эпителиальных клеток кишечника и фибробластов22. Бычье молозиво также содержит α-лактальбумин и β-лактоглобулин. Эти белки являются источниками незаменимых аминокислот, а также обладают бактерицидной активностью 23,24,25. Средние концентрации α-LA и β-Lg в молозиве составляют в среднем 2,77 мг/мл2 и 11,5 мг/мл26 соответственно. В дальнейшем эти концентрации снижаются до 1-1,5 мг/мл27 и 4,8 мг/мл26 в зрелом молоке. Молозиво также содержит значительное количество лактопероксидазы (в среднем 22,8 мкг/мл) и лизоцима (в среднем 0,40 мкг/мл)26. Лактопероксидаза представляет собой гликопротеин, обладающий антимикробной активностью в отношении грамположительных и отрицательных бактерий28 путем продуцирования активных форм кислорода. Лизоцим действует как антимикробное средство, расщепляя пептидогликановый компонент клеточных стенок бактерий, тем самым приводя к гибели клеток29,30.

Благодаря своим свойствам, IgG и лактоферрин перерабатываются в различные пищевые продукты для обогащения детских смесей, пищевые добавки, высокобелковые препараты для выздоравливающих и спортсменов, а также в фармакологии и косметологии 31,32,33. Бычье молозиво является важным источником IgG и лактоферрина. Однако состав этих биологически активных белков в коровьем молозиве заметно меняется в период лактации. Поэтому мониторинг изменений концентрации этих биологически активных белков в образцах молозива, используемых для исследований и обработки пищевых продуктов, имеет решающее значение. Целью данного исследования является описание методов мониторинга концентрации и состава общего белка, лактоферрина и IgG в коровьем молозиве в течение 6 дней после отела.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Образцы молозива были собраны в течение 6 дней после отела в полдень в период с июля по август у 28 молочных коров голштинской породы из компании Uluova Milk Trading Company в Чанаккале, Турция, и были глубоко заморожены. Образцы, собранные в один и тот же день, были объединены в соответствии с днем каждого образца и проанализированы на общую концентрацию белка, лактоферрина и IgG. Все образцы были проанализированы в двух экземплярах.

1. Подготовка образцов

  1. Смешайте 200 μL бычьего молозива с 400 μL dH2O для получения разбавленного образца для анализа. Разбавьте все образцы соответствующим образом.
  2. Центрифугируйте разбавленные и неразбавленные образцы при 4 °C, 1000 x g в течение 30 мин.
  3. Отделите среднюю фазу в новую пробирку с соответствующей маркировкой. Повторите шаг 1.2. для получения четкой средней фазы. Храните всю среднюю фазу и разбавленные образцы при температуре -20 °C, если не использовать сразу.
  4. Используйте среднюю фазу, полученную из разбавленных образцов, для анализов BCA, SDS-PAGE и лактоферрина. Соберите среднюю фазу из неразбавленных образцов для анализа на IgG.
  5. Подготовьте разведение образца для каждого образца, чтобы убедиться, что показания находятся в пределах стандартного диапазона кривой. Разбавьте каждую среднюю фазу, полученную из разведенных образцов, до 1:300 для анализа BCA и 1:30 000 для анализа на лактоферрин, а также разбавьте каждую среднюю фазу, полученную из неразбавленных образцов, до 1:400 000 для анализа IgG.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициенты разбавления определяются на основе значения поглощения и стандартной кривой.

2. Определите концентрацию белка с помощью набора для анализа белка ВСА

  1. Подготовка стандартов и реагентов
    1. Используйте реагенты, входящие в коммерчески доступный набор (см. Таблицу материалов), которые будут использоваться для анализа: реагент ВСА А, содержащий карбонат натрия, бикарбонат натрия, бицинхониновую кислоту и тартрат натрия в 0,1 М гидроксиде натрия. Реагент ВСА В содержит 4% сульфата меди. Стандарт альбумина (БСА) содержит бычий сывороточный альбумин в концентрации 2,0 мг/мл в 0,9% физиологическом растворе и 0,05% азиде натрия.
    2. Уравновесьте все образцы и стандарты белка до комнатной температуры (RT).
    3. Приготовьте достаточные объемы рабочего реагента (WR) путем смешивания реагента А:В в соотношении 50:1. На каждый образец и стандарт требуется 200 мкл WR.
    4. Приготовьте стандарты разбавленного альбумина (БСА) в соответствии со следующей схемой разбавления (Таблица 1), которая представляет рабочий диапазон от 20 до 2000 мкг/мл конечной концентрации БСА. Используйте dH2O в качестве разбавителя.

Таблица 1: Схема разбавления стандартов BSA.

ФлаконОбъем разбавителя (μл)Объем и источник BSA (μл)Конечная концентрация БСА (мкг/мл)
A0300 μл запаса2000
B125375 μл запаса1500
C325325 μл запаса1000
D175175 флакона разбавления B750
E325325 флакона С в разведении500
F325325 флаконов в разведении Е250
G325325 флаконов в разведении F125
H400100 флаконов в разведении G25
Я40000 = Пусто
  1. Процедура анализа BCA
    1. Перелейте по 25 мкл каждого стандарта BCA или образца в 96-луночный планшет. Добавьте 200 μL WR в каждую лунку, содержащую стандарт или образец. Тщательно перемешайте тарелку в шейкере в течение 30 с.
    2. Накройте тарелку герметиком для планшетов и выдерживайте при температуре 37 °C в течение 30 минут. После инкубации дайте реакциям сбалансироваться до RT в течение примерно 10 минут. Считывайте каждую пластину с длиной волны 562 нм с помощью считывателя микропластин с соответствующим программным обеспечением.
  2. Построение стандартной кривой и определение результатов
    1. Запишите значения поглощения для стандартов и образцов. Ряды данных о разрежении см. в таблице 1 . Вычтите значения поглощения стандартной заготовки из каждого значения поглощения стандартов и образца. Усредните повторяющиеся показания для каждого стандарта и образца, чтобы оценить общую концентрацию белка.
    2. Постройте стандартную кривую, построив скорректированное среднее поглощение для каждого стандарта по оси x и концентрацию по оси y. Нарисуйте линейную кривую с помощью соответствующего программного обеспечения, способного подгонять кривую по четырем параметрам.
    3. Используйте стандартную кривую для определения концентрации каждого образца путем интерполяции его реакции на концентрацию. Умножьте на коэффициент разбавления (шаг 1,5), чтобы получить фактическую концентрацию пробы.

3. Визуализация белка с помощью анализа SDS-PAGE

  1. Подготовка образца и растворов
    1. Готовьте исходные растворы
      1. Приготовьте 10% (w/v) SDS, 1,5 М Tris-HCl pH 8,3, 0,5 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w/v) раствор персульфата аммония (APS) (приготовьте свежий).
      2. (б/в) SDS: Взвесьте 1 г SDS и добавьте 10 мл dH2O.
      3. M Tris-HCl pH 8,8: Взвесьте 18,15 г Tris и растворите ~60 мл dH2O. Отрегулируйте до pH 8,8 с помощью HCl. Добавьте dH2O, чтобы довести объем до 100 мл.
      4. M Tris-HCl pH 6,8: Взвесьте 6,00 г Tris и растворите ~60 мл dH2O. Отрегулируйте до pH 6,8 с помощью HCl. Добавьте dH2O, чтобы довести объем до 100 мл.
      5. APS: Взвесьте 15 мг APS и добавьте 150 μL dH2O.
        ВНИМАНИЕ: Акриламид и паспорт безопасности токсичны и вредны. Надевайте защитные перчатки и работайте под капюшоном.
    2. Подготовьте буфер для проб, добавив 50 мкл β-меркаптоэтанола в 950 мкл 2x буфера для образцов SDS-PAGE.
      ВНИМАНИЕ: β-меркаптоэтанол токсичен при вдыхании. Надевайте защитные перчатки и работайте под капюшоном.
    3. Приготовьте рабочий буфер, смешав 100 мл 10x трис-глицина SDS Running Buffer с 900 мл dH2O.
    4. Приготовьте раствор для окрашивания (45% dH2O, 45% метанол, 10% ледяная уксусная кислота, 2 г Coomassie Brilliant Blue R).
    5. Приготовьте раствор для удаления (50% dH2O, 40% метанол, 10% ледяная уксусная кислота).
  2. Приготовление геля
    1. Подготовьте оборудование установки для электрофореза, включая гелевую кассету, блоки питания, электроды и кабели для проведения анализа. Очистите стеклянные пластины этанолом и соберите бутерброд. Убедитесь, что нижние края стеклянных пластин и распорок хорошо выровнены.
    2. Приготовьте разделительную гелевую смесь, содержащую 3,5 мл dH2O, 2,4 мл 40% акриламида/метилен-биса акриламида, 2 мл 1,5M Tris-HCl, 100 мкл 10% (мас./об.) SDS, 80 мкл 10% APS, 8 μл N,N,N',N'-ТЕТРАМЕТИЛЭТИЛЕНДИАМИНА (TEMED).
      ВНИМАНИЕ: TEMED токсичен и/или раздражает. Надевайте защитные перчатки и работайте под капюшоном.
    3. Вылейте разделительную гелевую смесь в гелевые пластины до уровня примерно на 1-1,5 см ниже верха более короткой пластины.
    4. Покройте верхнюю часть разделительного геля изопропанолом, чтобы удалить пузырьки в верхней части геля и предотвратить высыхание полимеризованного геля.
    5. Налейте изопропанол поверх разделительного геля после того, как разделительный гель полимеризуется в течение не менее 15 минут.
    6. Приготовьте стекирующую гелевую смесь, содержащую 1,92 мл dH2O, 300 мкл 40% акриламида/метиленбиса акриламида, 750 мкл 0,5M Tris-HCl, 100 мкл 10% (по мас.) SDS, 30 мкл 10% APS и 3 мкл TEMED.
    7. Налейте раствор укладывающего геля поверх разделительного геля, чтобы гелевые пластины были заполнены. Вставьте расческу в верхнюю часть распорок.
    8. Дайте укладывающему гелю полимеризоваться при комнатной температуре в течение примерно 15 минут.
  3. Запуск геля
    1. Присоедините гель к электроду в сборе. Добавьте свежеприготовленный 1x Tris-glycine SDS Running Buffer в обе камеры аппарата.
    2. Снимите расческу.
    3. Загрузите в лунки геля 5 мкл лестницы (10-250 кДа) и 8 мкл средней фазы разбавленных образцов. Запустите гель при напряжении 80 В, пока краситель не мигрирует в разделительный гель, и увеличивайте до 120 В, пока краситель не достигнет дна геля. Выключите подаваемую мощность после того, как краситель достигнет дна геля.
  4. Окрашивание и задержание геля
    1. После завершения прогона удалите гель из аппарата и снимите распорки и стеклянные пластины. Поместите гель в небольшую ванночку.
    2. Окрашивайте гель добавлением раствора для окрашивания (шаг 3.1.4) в течение 30 минут с легким встряхиванием при 55 оборотах в минуту.
    3. Слейте красящий раствор с геля. Смойте гель небольшим количеством растворителя и выбросьте краситель.
    4. Добавьте достаточный объем раствора, чтобы покрыть гель, и удалите пятна с помощью легкого встряхивания в течение ~1 часа, пока полосы не станут видимыми.

4. Концентрирование лактоферрина с помощью ИФА на основе бычьего лактоферрина

  1. Подготовка стандартов и реагентов
    1. Для этого анализа используйте коммерчески доступный набор ИФА для ИФА крупного рогатого скота.
    2. Уравновесьте все образцы и стандарты по RT.
    3. Приготовьте достаточные объемы детектирующего реагента А и В Рабочего раствора, которые отвечают за связывание с захваченным антигеном.
    4. Разбавляют детектирующие реагенты А и В до соотношения 1:100 с использованием разбавителей анализа А и В соответственно.
    5. Приготовьте рабочий буфер для промывки, разбавив концентрат буфера для промывки 30x с dH2O.
    6. Поместите достаточное количество субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) в стерильную микропробирку.
    7. Ресуспендировать одну пробирку лиофилизированного стандарта (100 нг/мл) с 0,5 мл разбавителя образца и инкубировать при ОТ в течение 10 мин при осторожном перемешивании. Вращайте флакон, чтобы убедиться, что весь лиофилизированный санпл собран на дне.
    8. Приготовьте стандартный ряд разведения по следующей схеме разведения (табл. 2).

Таблица 2: Схема разведения норм бычьего лактоферрина.

ФлаконОбъем разбавителя (μл)Объем и источник Lf (μL)Конечная концентрация Lf (нг/мл)
Д10500 μл запаса100
Д2250250 флаконов в разведении D150
Д3250250 флаконов в разведении D225
Д4250250 флаконов в разведении D312.5
Д5250250 флаконов в разведении D46.25
Д6250250 флаконов в разведении D53,125
Д7250250 флаконов в разведении D61,563
Д825000 = Пусто
  1. Измерение концентрации бычьего лактоферрина
    1. Пипетируйте 100 мкл каждого стандарта или образца лактоферрина в 96-луночный полосковый планшет с покрытием. Накройте пластину герметиком для пластин, чтобы избежать испарения. Выдерживать при 37 °C в течение 1 ч.
    2. Аспирируйте жидкость из каждой лунки. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл рабочего раствора реагента А. Накройте пластинчатым запайщиком и аккуратно перемешайте, чтобы обеспечить тщательное перемешивание. Выдерживать при 37 °C в течение 1 ч.
    3. Промойте три раза, добавив примерно 350 мкл 1x промывочного буфера после откачки жидкости из каждой лунки. Дайте каждой стирке постоять 1-2 минуты, прежде чем полностью аспирировать. После последней стирки отсасывайте, чтобы удалить остатки буфера для стирки, затем переверните пластину и постучите по чистой впитывающей бумаге.
    4. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл рабочего раствора реагента Б для детектирования. Накройте новым герметиком для пластин. Выдерживать при 37 °C в течение 30 минут. Отасуньте жидкость из каждой лунки и промойте ее пять раз, как описано в пункте 4.2.3. Налейте по 90 μл раствора субстрата TMB в каждую лунку и накройте новым герметиком.
    5. Инкубировать при температуре 37 °C в течение 10-20 минут вдали от света. Проверяйте оптимальный цвет путем периодического контроля. Обратите внимание, что интенсивный синий цвет в лунке содержит высокий концентрат лактоферрина.
    6. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл раствора остановки. Цвет изменится с синего на желтый. Немедленно измерьте поглощение каждой лунки с длиной волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов с соответствующим программным обеспечением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно постучите по пластине, чтобы обеспечить тщательное перемешивание до равномерного изменения цвета.
  2. Построение стандартной кривой и определение результатов
    1. Выполните шаг 2.3.1 для получения данных для оценки концентрации лактоферрина.
    2. Постройте стандартную кривую, построив скорректированное среднее поглощение для каждого стандарта, как описано в шаге 2.3.2, но начертав полиномиальную кривую с помощью соответствующего программного обеспечения, способного аппроксимировать четырехпараметрическую кривую.
    3. Рассчитайте содержание лактоферрина в каждом образце путем интерполяции значения поглощения на сгенерированное уравнение, как описано в шаге 2.3.3.

5. Определение концентрации IgG в образцах с помощью ИФА IgG крупного рогатого скота

  1. Подготовка стандартов и реагентов
    1. Используйте необходимые элементы из тех, которые входят в набор ИФА IgG для крупного рогатого скота.
    2. Уравновесьте все образцы и стандарты по RT.
    3. Приготовьте достаточное количество рабочего раствора конъюгата фермент-антитело, разбавив 10 мкл концентрата пероксидазы хрена (HRP)-авидина (100x) 990 мкл конъюгированного фермента-антитела.
    4. Приготовьте достаточное количество 1x промывочного буфера, разбавив 20x концентрат промывочного буфера dH2O.
    5. Приготовьте достаточное количество раствора разбавителя 1x, разбавив концентрат разбавителя 20x с dH2O.
    6. Добавьте 1,0 мл dH2O в калибратор IgG для крупного рогатого скота и аккуратно перемешайте до полного растворения. Конечная концентрация калибратора составляет 123 000 нг/мл.
    7. Готовьте стандартные серии разбавлений в соответствии со схемой разведения, описанной в таблице 3.

Таблица 3: Схема разбавления норм IgG крупного рогатого скота.

ФлаконОбъем разбавителя (μл)Объем и источник IgG (μл)Конечная концентрация IgG (нг/мл)
Д1900100 μл запаса12300
Д2900100 флаконов в разведении D11230
Д3178122 флакона в разведении D2500
Д415050 флаконов в разведении D3250
Д5150150 флаконов в разведении D4125
Д6100100 флаконов разведения D562.5
Д7100100 флаконов разведения D631.25
Д8100100 флаконов разведения D715,625
Д9100100 флаконов разведения D87,813
Д1010000 = Пусто
  1. Процедура иммуноферментного анализа на IgG крупного рогатого скота
    1. Пипетируйте по 100 мкл каждого стандарта или образца IgG в 96-луночный полосковый планшет с покрытием. Накройте тарелку запечатывателем для планшетов и выдерживайте при RT в течение 30 минут. Отсасывайте жидкость из каждой лунки.
    2. Промойте четыре раза, заполнив лунки 1x буфером для промывки, и аспирируйте. После последней стирки отсадите, чтобы удалить остатки буфера для стирки, затем переверните пластину и постучите по чистой впитывающей бумаге. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл правильно разбавленного конъюгата фермент-антитело. Накройте пластинчатым запайщиком и аккуратно перемешайте, чтобы обеспечить тщательное перемешивание.
    3. Инкубировать при RT в течение 10 минут. Промойте и удалите остатки буфера промывки из лунок, как описано в шаге 5.2.2. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл субстрата TMB; Накройте новым запайщиком пластин.
    4. Инкубируйте при RT ровно 10 минут вдали от света. Остановите реакцию, добавив по 100 мкл раствора остановки в каждую лунку. Считывайте данные с каждой пластины на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропластин с соответствующим программным обеспечением.
  2. Построение стандартной кривой и определение результатов
    1. Выполните шаг 2.3.1 для редактирования данных для оценки концентрации IgG.
    2. Постройте стандартную кривую, построив концентрацию по оси x и скорректированное среднее поглощение для каждого стандарта по оси y. Нарисуйте полиномиальную кривую с помощью соответствующего программного обеспечения, способного подгонять кривую по четырем параметрам.
    3. Рассчитайте содержание IgG в каждом образце путем интерполяции значения поглощения на сгенерированное уравнение, как описано в шаге 2.3.3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В соответствии с протоколом образцы коровьего молозива были проанализированы для определения концентрации белка, лактоферрина и IgG. Результаты анализа белка, лактоферрина и IgG коровьего молозива представлены в таблице 4.

Таблица 4: Концентрация белка, лактоферрина и IgG в коровьем молозиве.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Это исследование дает информацию о значительных изменениях концентраций белка, лактоферрина и IgG в молозиве на протяжении всего перехода к зрелому молоку. Определение изменений концентрации лактоферрина и IgG проводили с помощью сэндвич-ИФА, а концентрацию общего белка анализировали с помощью анализа БЦА. Результаты показывают, что раннее молозиво имеет самую высокую концентрацию белка, лактоферрина и IgG, которая впоследствии снижалась в течение следующих 3 дней. Точные измерения этих ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Данное исследование проводится при поддержке компании Uluova Süt Ticaret A.Ş. (Uluova Milk Trading Co.). RMD и BMH являются сотрудниками Evolve BioSystems, компании, занимающейся восстановлением микробиома младенцев.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10X Бегущий буфер (Трис-Глицин-SDS)ClearBandTGS10SDS-Page анализ
2-меркаптоэтанолGIBCO31350-010SDS-Page анализ
Уксусная кислота GLACIALIsolab901,013,2500SDS-Page анализ
Бычий IgG ИФА НаборAviva Systems БиологияOKIA00005определение концентрации IgG
Бычий LF / LTF / Лактоферрин ИФА НаборLSBio Lifespan BiosciencesLS-F4884Определение концентрации лактоферрина
Coomassie Brillant Blue R 250amresco0472-25GSDS-Page анализ
Соляная кислота дымка 37%Isolab932,103,2501SDS-Page анализ
ИзопропанолIsolab961,023,2500SDS-Page анализ
Laemmli Sample Буфер (2X)ClearBandLSB-2xSDS-Page анализ
МетанолIsolab947,046,2500SDS-Page анализ
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder 10 to 250Thermo Scientific26619SDS-Page анализ
Pierce BCA Набор для анализа белкаThermo Scientific23225Определение концентрации белка
Додецилсульфат натрия (SDS)BioShopSDS001.500SDS-Page анализ
SureCast Раствор акриламида 40% (w/v)InvitrogenHC2040SDS-Page анализ
SureCast персульфат аммония (APS)Thermo Scientific17874SDS-Page анализ
SureCast Тетраметилэтилендиамин (TEMED)InvitrogenHC2006SDS-Page анализ
TECAN Infinite M200 Планшетный ридер TECAN Infinite M200Tecan30035094Измерение абсорбции
Tris baseBioShopTRS001.1SDS-Page анализ

Ссылки

  1. Kehoe, S. I., Jayarao, B. M., Heinrichs, A. J. A survey of bovine colostrum composition and colostrum management practices on Pennsylvania dairy farms. Journal of Dairy Science. 90 (9), 4108-4116 (2007).
  2. Levieux, D., Ollier, A. Bovine immunoglobulin G, β-lactoglobulin, α-lactalbumin and serum albumin in colostrum and milk during the early post partum period. Journal of Dairy Research. 66 (3), 421-430 (1999).
  3. Elfstrand, L., Lindmark-Månsson, H., Paulsson, M., Nyberg, L., Åkesson, B. Immunoglobulins, growth factors and growth hormone in bovine colostrum and the effects of processing. International Dairy Journal. 12 (11), 879-887 (2002).
  4. Strekozov, N. I., Motova, E. N., Fedorov, Y. N. Evaluation of the chemical composition and immunological properties of colostrum of cows' first milk yield. Russian Agricultural Sciences. 34 (4), 259-260 (2008).
  5. Playford, R. J., Weiser, M. J. Bovine colostrum: Its constituents and uses. Nutrients. 13 (1), 265(2021).
  6. Godhia, M., Patel, N. Colostrum - Its composition, benefits as a nutraceutical: A review. Current Research in Nutrition and Food Science Journal. 1 (1), 37-47 (2013).
  7. Nakamura, T., et al. Concentrations of sialyloligosaccharides in bovine colostrum and milk during the prepartum and early lactation. Journal of Dairy Science. 86 (4), 1315-1320 (2003).
  8. Arain, H. H., Khaskheli, M., Arain, M. A., Soomro, A. H., Nizamani, A. H. Heat stability and quality characteristics of postpartum buffalo milk. Pakistan Journal of Nutrition. 7 (2), 303-307 (2008).
  9. Maunsell, F. P., et al. Effects of mastitis on the volume and composition of colostrum produced by Holstein cows. Journal of Dairy Science. 81 (5), 1291-1299 (1998).
  10. Tittle, D. J. Factors affecting colostrum quality. Cattle Practice. 10 (2), 131-136 (2002).
  11. Zarcula, S., et al. Influence of breed, parity and food intake on chemical composition of first colostrum in cow. Animal Science and Biotechnology. 43 (1), 43(2010).
  12. McGrath, B. A., Fox, P. F., McSweeney, P. L. H., Kelly, A. L. Composition and properties of bovine colostrum: a review. Dairy Science and Technology. 96 (2), 133-158 (2016).
  13. Bastian, S. E. P., Dunbar, A. J., Priebe, I. K., Owens, P. C., Goddard, C. Measurement of betacellulin levels in bovine serum, colostrum and milk. Journal of Endocrinology. 168 (1), 203-212 (2001).
  14. Zhang, L., et al. Bovine milk proteome in the first 9 days: Protein interactions in maturation of the immune and digestive system of the newborn. PloS One. 10 (2), 0116710(2015).
  15. Godden, S. Colostrum management for dairy calves. The Veterinary clinics of North America. Food Animal Practice. 24 (1), 19-39 (2008).
  16. Larson, B. L., Heary, H. L., Devery, J. E. Immunoglobulin production and transport by the mammary gland. Journal of Dairy Science. 63 (4), 665-671 (1980).
  17. Ulfman, L. H., Leusen, J. H. W., Savelkoul, H. F. J., Warner, J. O., van Neerven, R. J. J. Effects of bovine immunoglobulins on immune function, allergy, and infection. Frontiers in Nutrition. 5, 52(2018).
  18. El-Loly, M. M. Bovine milk immunoglobulins in relation to human health. International Journal of Dairy Science. 2 (3), 183-195 (2007).
  19. Korhonen, H., Marnila, P., Gill, H. S. Milk immunoglobulins and complement factors. British Journal of Nutrition. 84 (1), 75-80 (2000).
  20. Arnold, R. R., Brewer, M., Gauthier, J. J. Bactericidal activity of human lactoferrin: Sensitivity of a variety of microorganisms. Infection and Immunity. 28 (3), 893-898 (1980).
  21. Aisen, P., Listowsky, I. Iron transport and storage proteins. Annual Review of Biochemistry. 49 (1), 357-393 (1980).
  22. Zhao, X., et al. The in vitro protective role of bovine lactoferrin on intestinal epithelial barrier. Molecules. 24 (1), 148(2019).
  23. Chatterton, D. E. W., Smithers, G., Roupas, P., Brodkorb, A. Bioactivity of β-lactoglobulin and α-lactalbumin-Technological implications for processing. International Dairy Journal. 16 (11), 1229-1240 (2006).
  24. Pellegrini, A., Dettling, C., Thomas, U., Hunziker, P. Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine β-lactoglobulin. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1526 (2), 131-140 (2001).
  25. Brück, W. M., et al. rRNA probes used to quantify the effects of glycomacropeptide and α-lactalbumin supplementation on the predominant groups of intestinal bacteria of infant rhesus monkeys challenged with enteropathogenic Escherichia coli. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 37 (3), 273-280 (2003).
  26. Indyk, H. E., Hart, S., Meerkerk, T., Gill, B. D., Woollard, D. C. The β-lactoglobulin content of bovine milk: Development and application of a biosensor immunoassay. International Dairy Journal. 73, 68-73 (2017).
  27. Swaisgood, H. E. Protein and amino acid composition of bovine milk. Handbook of Milk Composition. , 464-468 (1995).
  28. Seifu, E., Buys, E. M., Donkin, E. F. Significance of the lactoperoxidase system in the dairy industry and its potential applications: A review. Trends in Food Science and Technology. 16 (4), 137-154 (2005).
  29. Wheeler, T. T., Hodgkinson, A. J., Prosser, C. G., Davis, S. R. Immune components of colostrum and milk-A historical perspective. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 12 (4), 237-247 (2007).
  30. Clare, D., Catignani, G., Swaisgood, H. Biodefense properties of milk: The role of antimicrobial proteins and peptides. Current Pharmaceutical Design. 9 (16), 1239-1255 (2003).
  31. Mehra, R., Marnila, P., Korhonen, H. Milk immunoglobulins for health promotion. International Dairy Journal. 16 (11), 1262-1271 (2006).
  32. Gapper, L. W., Copestake, D. E. J., Otter, D. E., Indyk, H. E. Analysis of bovine immunoglobulin G in milk, colostrum and dietary supplements: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (1), 93-109 (2007).
  33. Mettler, A. E. Utilization of whey by-products for infant feeding. International Journal of Dairy Technology. 33 (2), 67-72 (1980).
  34. Zenker, H. E., Raupbach, J., Boeren, S., Wichers, H. J., Hettinga, K. A. The effect of low vs. high temperature dry heating on solubility and digestibility of cow's milk protein. Food Hydrocolloids. 109, 106098(2020).
  35. Costa, F. F., et al. Microfluidic chip electrophoresis investigation of major milk proteins: Study of buffer effects and quantitative approaching. Analytical Methods. 6 (6), 1666-1673 (2014).
  36. Lönnerdal, B., Du, X., Jiang, R. Biological activities of commercial bovine lactoferrin sources. Biochemistry and Cell Biology. 99 (1), 35-46 (2021).
  37. Belanger, L., Sylvestre, C., Dufour, D. Enzyme-linked immunoassay for alpha-fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta. 48 (1), 15-18 (1973).
  38. Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
  39. Engvall, E. The ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay. Clinical Chemistry. 56 (2), 319-320 (2010).
  40. Kohl, T. O., Ascoli, C. A. Immunometric double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (6), (2017).
  41. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77 (7), 98-101 (2016).
  42. Abd El-Fattah, A. M., Abd Rabo, F. H. R., EL-Dieb, S. M., El-Kashef, H. A. Changes in composition of colostrum of Egyptian buffaloes and Holstein cows. BMC Veterinary Research. 8 (1), 19(2012).
  43. Newby, T. J., Stokes, C. R., Bourne, F. J. Immunological activities of milk. Veterinary Immunology and Immunopathology. 3 (1-2), 67-94 (1982).
  44. Chigerwe, M., et al. Comparison of four methods to assess colostral IgG concentration in dairy cows. Journal of the American Veterinary Medical Association. 233 (5), 761-766 (2008).
  45. Foley, J. A., Otterby, D. E. Availability, storage, treatment, composition, and feeding value of surplus colostrum: A review. Journal of Dairy Science. 61 (8), 1033-1060 (1978).
  46. Mechor, G. D., Gröhn, Y. T., McDowell, L. R., Van Saun, R. J. Specific gravity of bovine colostrum immunoglobulins as affected by temperature and colostrum components. Journal of Dairy Science. 75 (11), 3131-3135 (1992).
  47. Pritchett, L. C., Gay, C. C., Besser, T. E., Hancock, D. D. Management and production factors influencing immunoglobulin G1 concentration in colostrum from Holstein cows. Journal of Dairy Science. 74 (7), 2336-2341 (1991).
  48. Quigley, J. D., Martin, K. R., Dowlen, H. H. Concentrations of trypsin inhibitor and immunoglobulins in colostrum of Jersey cows. Journal of Dairy Science. 78 (7), 1573-1577 (1995).
  49. Bielmann, V., et al. An evaluation of Brix refractometry instruments for measurement of colostrum quality in dairy cattle. Journal of Dairy Science. 93 (8), 3713-3721 (2010).
  50. A Ayar, A., Sıçramaz, H., Çetin, I. The effect of bovine colostrum on the lactic flora of yogurt and kefir. JSM Biotechnology and Biomedical Engineering. 3, 3-8 (2016).
  51. Sobaih, A., Zaki, D. A. Production of novel functional yoghurt fortified with bovine colostrum and date syrup for children. Alexandria Science Exchange Journal. 39, 651-662 (2018).
  52. Saalfeld, M. H., et al. Colostro: a redescoberta de um alimento saudável, nutritivo e com potencial probiótico. Agroecologia e Desenvolvimento Rural Sustentável. 5 (2), 18-24 (2012).
  53. Mouton, E., Aryana, K. J. Influence of colostrum on the characteristics of ice cream. Food and Nutrition Sciences. 06 (05), 480-484 (2015).
  54. Nazir, T., Pal, M. A., Manzoor, A. Effect of admixing varying levels of whole milk to the colostrum on the sensory quality of fermented colostrum product. International Journal of Advanced Research in Science, Engineering and Technology. 7 (4), 156-161 (2018).
  55. Korhonen, H. J. Bioactive milk proteins, peptides and lipids and other functional components derived from milk and bovine colostrum. Functional Foods. , 471-511 (2011).
  56. Cortés-Ríos, J., et al. Protein quantification by bicinchoninic acid (BCA) assay follows complex kinetics and can be performed at short incubation times. Analytical Biochemistry. 608, 113904(2020).
  57. Johnson, M. Protein quantitation. Materials and Methods. 2, 115(2012).
  58. Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-15 (2009).
  59. Wang, R., et al. Sensitive immunoassays based on specific monoclonal IgG for determination of bovine lactoferrin in cow milk samples. Food Chemistry. 338, 127820(2021).
  60. Kazemi, M. G., Feizy, J. Overview of the important of ELISA technique and application in food industry. Analyzing Microbes. 4 (4), 19-25 (2020).
  61. Verma, J., Saxena, S., Babu, S. G. ELISA-based identification and detection of microbes. Analyzing Microbes. , 169-186 (2013).
  62. Minic, R., Zivkovic, I. Optimization, validation and standardization of ELISA. Norovirus. , (2020).
  63. Drijvers, J. M., Awan, I. M., Perugino, C. A., Rosenberg, I. M., Pillai, S. The enzyme-linked immunosorbent assay. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 119-133 (2017).
  64. Walker, A. Breast milk as the gold standard for protective nutrients. The Journal of Pediatrics. 156 (2), 3-7 (2010).
  65. Patel, K., Rana, R. Pedimune in recurrent respiratory infection and diarrhoea-The Indian experience-The PRIDE study. The Indian Journal of Pediatrics. 73 (7), 585-591 (2006).
  66. Saad, K., et al. Effects of bovine colostrum on recurrent respiratory tract infections and diarrhea in children. Medicine. 95 (37), 4560(2016).
  67. Buckley, J. D., Brinkworth, G. D., Abbott, M. J. Effect of bovine colostrum on anaerobic exercise performance and plasma insulin-like growth factor I. Journal of Sports Sciences. 21 (7), 577-588 (2003).
  68. Kotsis, Y., et al. A low-dose, 6-week bovine colostrum supplementation maintains performance and attenuates inflammatory indices following a Loughborough Intermittent Shuttle Test in soccer players. European Journal of Nutrition. 57 (3), 1181-1195 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GBCASDS PAGE
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи