Методическая статья

Обнаружение Indel после мутагенеза CRISPR/Cas9 с использованием анализа расплава высокого разрешения у комаров Aedes aegypti

DOI:

10.3791/63008

⸱

10 сентября 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Agrilife Research, Texas A&M University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье подробно описывается протокол быстрой идентификации инделов, индуцированных CRISPR/Cas9, и выбора мутантных линий у комара Aedes aegypti с использованием анализа расплава с высоким разрешением.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Редактирование генов комаров стало обычным делом в нескольких лабораториях с созданием таких систем, как транскрипционно-активатор-подобные эффекторные нуклеазы (TALENs), нуклеазы цинкового пальца (ZFNs) и самонаводящиеся эндонуклеазы (HEs). Совсем недавно технология кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) / CRISPR-ассоциированного белка 9 (Cas9) предложила более простую и дешевую альтернативу для точной геномной инженерии. После действия нуклеазы пути репарации ДНК будут исправлять сломанные концы ДНК, часто вводя индели. Эти внекадровые мутации затем используются для понимания функции генов в целевых организмах. Недостатком, однако, является то, что мутантные особи не несут доминирующего маркера, что затрудняет идентификацию и отслеживание аллелей мутантов, особенно в масштабах, необходимых для многих экспериментов.

Анализ расплава с высоким разрешением (HRMA) является простым методом выявления вариаций последовательностей нуклеиновых кислот и использует кривые плавления ПЦР для обнаружения таких изменений. Этот метод анализа после ПЦР использует флуоресцентные двухцепочечные ДНК-связывающие красители с приборами, которые имеют возможность сбора данных о контроле температуры и легко масштабируются до форматов пластин с 96 лунками. Здесь описан простой рабочий процесс с использованием HRMA для быстрого обнаружения CRISPR/Cas9-индуцированных инделей и установления мутантных линий у комара Ae. aegypti. Критически важно, что все этапы могут быть выполнены с небольшим количеством ткани ноги и не требуют жертвоприношения организма, позволяя проводить генетические скрещивания или фенотипирование после генотипирования.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как переносчики патогенов, таких как вирусы денге1, Зика2 и чикунгунья3, а также малярийные паразиты4, комары представляют значительную угрозу для здоровья людей. В связи со всеми этими заболеваниями основное внимание уделяется мерам по борьбе с комарами-переносчиками. Изучение генов, важных, например, в отношении вседозволенности к патогенам, приспособленности комаров, выживания, размножения и устойчивости к инсектицидам, является ключом к разработке новых стратегий борьбы с комарами. Для таких целей редактирование генома у комаров становится обычной практикой, особенно с развитием таких технологий, как HEs, ZFN, TALENs и совсем недавно CRISPR с Cas9. Создание генетически отредактированных штаммов обычно включает в себя обратное скрещивание людей, несущих желаемые мутации в течение нескольких поколений, чтобы свести к минимуму нецелевые и фаундокторные (узкие места) эффекты, с последующим скрещиванием гетерозиготных особей для генерации гомозиготных или трансгетерозиготных линий. В отсутствие доминирующего маркера молекулярное генотипирование необходимо в этом процессе, поскольку во многих случаях у гетерозиготных мутантов не может быть обнаружено четких фенотипических признаков.

Хотя секвенирование является золотым стандартом для генотипической характеристики, выполнение этого для сотен или, возможно, тысяч особей сопряжено со значительными затратами, трудом и временем, необходимыми для получения результатов, что особенно важно для организмов с короткой продолжительностью жизни, таких как комары. Обычно используемыми альтернативами являются Surveyor nuclease assay5 (SNA), T7E1 assay6 и анализ расплава с высоким разрешением (HRMA, рассмотрено в 7). И SNA, и T7E1 используют эндонуклеазы, которые расщепляют только несоответствующие основания. Когда мутированная область гетерозиготного мутантного генома амплифицируется, фрагменты ДНК из аллелей мутантного и дикого типа отжигаются, чтобы сделать несоответствующую двухцепочечную ДНК (dsDNA). СНС обнаруживает наличие несоответствий через пищеварение с несоответствующей специфической эндонуклеазой и простым электрофорезом агарозного геля. В качестве альтернативы HRMA использует термодинамические свойства dsDNA, обнаруженные флуоресцентными красителями, связывающими dsDNA, при этом температура диссоциации красителя изменяется в зависимости от наличия и типа мутации. HRMA использовался для обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов (SNP)8, мутантного генотипирования рыб данио9, микробиологических приложений10 и генетических исследований растений11.

В этой статье описывается HRMA, простой метод молекулярного генотипирования для комаров-мутантов, генерируемый технологией CRISPR / Cas9. Преимущества HRMA перед альтернативными методами включают в себя 1) гибкость, поскольку она доказала свою полезность для различных генов, широкий диапазон размеров инделя, а также различие между различными размерами инделя и гетерозиготной, гомозиготной и трансгетерозиговой дифференцировкой12,13,14, 2) стоимость, поскольку она основана на широко используемых реагентах ПЦР, и 3) экономию времени, так как это может быть выполнено всего за несколько часов. Кроме того, протокол использует небольшую часть тела (ногу) в качестве источника ДНК, что позволяет комару выжить в процессе генотипирования, позволяя устанавливать и поддерживать мутантные линии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Сканирование на наличие однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), проектирование праймера HRMA и валидация праймера

  1. Идентификация SNP у комаров лабораторных колоний дикого типа
    1. Выберите целевой экзон, чтобы нарушить правильную трансляцию полипептидов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мишень должна быть близка к исходному кодону или среди ключевых остатков, необходимых для функции белка. Чем короче экзон (например, ≤200 оснований), тем сложнее его нацеливать и анализировать. Избегайте редактирования близко к границам экзона, так как это заставляет один из праймеров HRMA либо пересекать интрон, либо находиться в интроне. Это нежелательно, поскольку ставки SNP, как правило, намного выше в этих регионах.
    2. Конструкция грунтовки
      1. Перейдите на веб-сайт NCBI Blast - Primer Blast15, скопируйте и вставьте выбранный экзон в поле в верхней части страницы | выберите размер продукта ПЦР (убедитесь, что он охватывает большую часть экзона) | выберите организм.
      2. Нажмите на Дополнительные параметры | Выберите (для продукта ПЦР Tm) и добавьте 60 (для оптимальной температуры 60 °C) | Получите грунтовки. Остальные параметры оставить по умолчанию.
    3. Получение геномной ДНК (гДНК) из лабораторной колонии дикого типа. Отложите 10 комаров, обезбольте их CO2 и поместите в чашку Петри на льду, чтобы они оставались неактивными. Установите 10 пробирок, содержащих 0,5 мкл реагента для высвобождения ДНК из ткани и 20 мкл буфера разбавления, которые предусмотрены в наборе для высвобождения ДНК, предложенном в Таблице материалов.
    4. С помощью щипцов удалить одну ногу с помощью щипцов и поместить ее в соответствующую пробирку разбавленного раствора реагента с высвобождением ДНК (из стадии 1.1.3), полностью погружая ножку в раствор. Повторите этот шаг с оставшимися комарами, протерев щипцы 70% этанолом, прежде чем перейти к следующему.
    5. Инкубировать легочный раствор при комнатной температуре в течение 2-5 мин, затем при 98 °С в течение 2 мин, и дать ему остыть при настройке реакции ПЦР.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины, содержащие высвобожденную гДНК, могут храниться при -20 °C, и протокол может быть приостановлен в этот момент.
    6. Подготовьте 10 пробирок, содержащих 10 мкл 2x PCR Master Mix, грунтовки до конечной концентрации 0,5 мкМ и воду молекулярного класса до конечного объема 20 мкл и перенесите 1 мкл разбавленного образца в каждую пробирку. Выполняют ПЦР по следующим параметрам цикла: 98 °C 5 мин, 40 циклов 98 °C в течение 5 с, 60 °C 30 с, 72 °C 20 с на кб; окончательное продление 72 °C в течение 1 мин.
    7. Очистите продукты ПЦР ферментом для разложения остаточных праймеров ПЦР и дефосфорилировать избыточные dNTP или любой комплект для очистки колонны. Приступайте к виртуализации образцов.
    8. Анализируйте каждую электроферограмму на наличие двойных пиков/неоднозначных оснований и корректируйте базовые вызовы вручную в каждой последовательности, используя соответствующий вырожденный базовый код.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен перед выравниванием нескольких последовательностей, так как программное обеспечение, вызывающее базу, обычно выбирает более заметный пик в качестве «истинного» базового вызова, создавая ложное впечатление отсутствия SNP.
    9. Выполните выравнивание нескольких последовательностей с помощью программного обеспечения для выравнивания SeqMan Pro, указанного в Таблице материалов, или другого программного обеспечения с открытым исходным кодом, такого как ClustalW16 или T-Coffee17.
      1. Откройте программное обеспечение выравнивания | нажмите на Добавить последовательности | выберите нужные последовательности и нажмите добавить | как только все последовательности выбраны, нажмите Готово.
      2. Нажмите кнопку Собрать , чтобы выполнить выравнивание. Чтобы открыть выравнивание, нажмите на Contig 1 и проанализируйте выравнивание и определите SNP (рисунок 1).
        ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы этапам 1.1.3-1.1.6 ПЦР может быть выполнена из изолированной геномной ДНК, полученной из объемных образцов (полученных от >10 особей). Секвенированные ампликоны могут быть проанализированы непосредственно на наличие SNP, появляющихся в виде двойных пиков в электроферограмме, хотя редкие SNP будет труднее обнаружить.
    10. Спроектируйте 3-5 одиночных направляющих РНК (sgRNAs), избегая областей, содержащих любой SNP, идентифицированный выше, следуя протоколу, описанному в 18.
  2. Конструкция грунтовки HRMA
    1. Проверьте последовательность экзонов на предмет возможного образования вторичных структур при ПЦР с помощью mFold19.
      1. Перейдите на веб-сервер UNAFold | нажмите на | mFold в выпадающем меню выберите приложения | Форма складывания ДНК.
      2. Введите имя последовательности в поле и вставьте экзон.
      3. Изменить температуру складывания до 60 °C; в ионных условиях измените [Mg++] на 1,5 , а на Units переключитесь на mM; нажмите на Fold DNA.
      4. На выходе в разделе Структура 1 нажмите на pdf , чтобы открыть Графики круговой структуры.
    2. Перейдите в NCBI Blast - Primer Blast15 для проектирования грунтовки.
    3. Скопируйте и вставьте выбранную последовательность экзонов, определенную путем виртуализации на шаге 1.1 (последовательность, содержащая наименьшее количество SNP или отсутствие SNP), в поле в верхней части страницы.
    4. Используйте символ < > для пометки и исключения последовательностей, содержащих SNP, целевой сайт и регионы с возможным формированием вторичной структуры.
    5. Выберите размер продукта ПЦР от 80 до 150 bp и выберите организм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно успешно использовать фрагменты больших размеров (~300 bp). Однако более длинные ампликоны могут снизить чувствительность между последовательностями, отличающимися одной или несколькими парами оснований.
    6. Нажмите на Получить грунтовки. Выберите 2–3 пары праймеров для тестирования (в идеале сайты грунтовки находятся ≥20–50 бит/с от любых целевых сайтов CRISPR).
  3. Проверка грунтовки
    1. Выполните градиентную ПЦР с использованием гДНК от одного человека.
      1. Подготовьте мастер-микс и извлеките один образец для нешаблонного элемента управления (NTC) в отдельной пробирке. Добавьте шаблон к оставшемуся мастер-миксу и аликвоту в 96-луночную пластину.
      2. Соблюдайте параметры цикла: 98 °C 30 с, 34 цикла 98 °C в течение 10 с, 55–65 °C 30 с, 72 °C 15 с; окончательное продление 72 °C в течение 10 мин.
      3. Генерируйте профили термического расплава в соответствии с параметрами: стадия денатурации 95 °C в течение 1 мин, отжиг 60 °C в течение 1 мин, обнаружение кривой расплава между 75 °C и 95 °C с шагом 0,2 °C с временем удержания 10 с при каждой температуре.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Следует использовать только температуры отжига с одним профилем термического расплава.
  4. Приступайте к генерации мутантных линий с помощью инъекций эмбрионов, как описано в 12.

2. Получение геномной ДНК из ног комаров

  1. Разделите комаров G1 по полу на стадии куколки, чтобы они не спаривались перед генотипированием, и убедитесь, что соответствующие возрасту комары дикого типа будут доступны для использования для ссылок и бэккроссов. Разделите их по признаку пола.
  2. Соберите необходимые материалы (рисунок 2А) и подготовьте 96-луночную ПЦР-пластину с 0,5 мкл реагента с высвобождением ДНК и 20 мкл буфера разбавления (из набора высвобождения гДНК) на человека для генотипирования (рисунок 2B) и оставьте его на льду. Зарезервируйте две реакции для NTC.
  3. Пометьте лоток для флаконов комаров (флаконы Drosophila ), чтобы каждый колодец на 96-й пластине соответствовал соответствующему флакону комара в лотке.
  4. Обезболить комаров G1 CO2 и поместить их в стеклянную чашку Петри, чтобы они оставались седативными (рисунок 2C, D). Обезболить и поместить 8 комаров дикого типа во вторую чашку Петри.
  5. Протрите пару пинцетов 70% этанолом и удалите одну из задних лап комаров (рисунок 2E,F).
  6. Погрузите ножку в раствор реагента с высвобождением ДНК, поместите комара в соответствующий флакон и закройте его губкой (рисунок 2G,H).
  7. Снова протрите пинцет 70% этанолом и приступайте к удалению ноги от следующего комара. Повторяйте шаги 2,5-2,7 до тех пор, пока не будет завершена плита из 96 скважин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно протирать пинцет 70% этанолом. Это сводит к минимуму перекрестное загрязнение ДНК.
  8. Запечатайте пластину уплотнением оптической ПЦР-пластины (рисунок 2I) и инкубируйте 96-луночную пластину, содержащую ножки при комнатной температуре (RT) в течение 2-5 мин, а затем при 98 °C в течение 2 мин. Дайте пластине остыть до RT во время приготовления смеси ПЦР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Весь процесс обычно занимает 3-4 часа. Если комары должны содержаться во флаконах в течение более длительного времени, чем ожидается (особенно ≥1 день), поместите небольшой кусочек изюма (или источника сахара и воды) с каждым комаром, чтобы обеспечить выживание комаров во время длительных инкубаций.

3. HRMA

  1. Выполните ПЦР.
    1. Подготовьте мастер-смесь, содержащую следующие компоненты для каждой реакции: 10 мкл 2x буфера (из набора для высвобождения гДНК), 0,5 мкМ каждого праймера, 1 мкл красителя EvaGreen, 0,4 мкл полимеразы (из набора для высвобождения гДНК) и до 19 мкл с водой молекулярного класса.
    2. Используя многоканальный пипетку, переведите 19 мкл мастер-микса в каждую скважину. Перенесите 1 мкл раствора высвобождения ДНК, содержащего ДНК комара, приготовленного в секции 2, на пластину (фиг.3A). Запечатайте пластину оптическим уплотнением ПЦР-пластины.
    3. Выполняют ПЦР по параметрам цикла: 98 °C в течение 5 мин, 39 циклов 98 °C в течение 10 с, выбранная температура отжига (72 °C) в течение 30 с; окончательное удлинение 72 °C в течение 2 мин.
  2. Генерируйте профили термического расплава в соответствии с параметрами: стадия денатурации 95 °C в течение 1 мин, отжиг 60 °C в течение 1 мин, обнаружение кривой расплава между 75 °C и 95 °C с шагом 0,2 °C с временем удержания 10 с при каждой температуре. Смотрите Дополнительные материалы и Дополнительный рисунок S1-S5 для подробного описания настройки программного обеспечения для HRMA, работающего с использованием системы реального времени CFX96.
  3. Изучите профили расплава (рисунок 3B). Назначьте элемент управления подстановочного типа ссылочному кластеру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение (см. Таблицу материалов) автоматически нормализует данные и обозначает кластеры цветами для различных кривых расплава.
  4. Пометьте различные кластеры соответствующими цветами на шаблоне с 96 скважинами (рисунок 3C).
  5. Выберите людей с интересующими кривыми, удалите их из трубок и перекрестите обратно (рисунок 3D). Кормите спаренных самок кровью и собирайте яйца G2 .

4. Проверка последовательности с помощью секвенирования Сэнгера

  1. Очистите продукт ПЦР из колодцев с выбранными комарами (из пластины, приготовленной в разделе 3.1), используя фермент для разложения остаточных праймеров ПЦР, и дефосфорилируйте избыточные дНТП. В качестве альтернативы можно использовать любой комплект для очистки колонн и приступить к виртуализации образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прямое секвенирование может быть более сложным, когда размер продукта ПЦР невелик (≤200 bp). В таких случаях разрабатывают праймеры для амплификации более крупных фрагментов, охватывающих целевой участок (≥250 bp) и амплификации с помощью ПЦР с использованием ДНК в 96-луночной пластине (этап 2.2).
  2. Анализируйте и идентифицируйте indels с помощью программного обеспечения trace viewer (рисунок 4). Кроме того, программное обеспечение Poly Peak Parser20 может помочь обнаружить мутацию у гетерозиготных людей.
    1. Перейдите на веб-сайт Poly Peak Parser, выберите последовательность из числа мутантов в меню Обзор , а затем скопируйте и вставьте эталонную последовательность в поле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выравнивание между альтернативным аллелем и ссылкой автоматически появится в правой части экрана.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Комары, содержащие мутации в генах AaeZIP11 (предполагаемый транспортер железа21) и мио-фем (ген миозина с женским уклоном, связанный с летными мышцами13), были получены с использованием технологии CRISPR/Cas9, генотипированы с использованием HRMA и проверены последовательностью (рисунок 5). На рисунках 5A и 5C показана нормализованная интенсивность флуоресценции из к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ расплава с высоким разрешением предлагает простое и быстрое решение для идентификации инделей, генерируемых технологией CRISPR/Cas9 в комаре-переносчике Ae. aegypti. Он обеспечивает гибкость, позволяя генотипировать комаров, мутировавших для широкого спектра генов от мышц полета до метаболизма железа и более 13,14. HRMA может быть выполнен всего за несколько часов от сбора образцов до окончательного анализа. Дополнительное время требуется для прое...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все фигуры были созданы с Biorender.com по лицензии Техасского университета A&M. Эта работа была поддержана средствами Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (AI137112 и AI115138 до Z.N.A.), Texas A&M AgriLife Research в рамках Программы грантов на переносчики насекомых и Национального института продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США, проект Хэтч 1018401.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
70% этанол70% раствор этанола в воде
96-луночный ПЦР и ПЦР в реальном времениVWR82006-636Для получения геномной ДНК (из комарной лапки)
96-луночные шаблоныпланшетов Домашние печатные, для регистрации генотипа
Bio Rad CFX96Bio RadПЦР машина с градиентом и возможностями
HRMAДиверсифицированные биотехнологические резервуары для реагентовVWR490006-896
Набор для быстрой очистки ПЦР Exo-CIP NewEngland BiolabsE1050S
Стеклянная чашка ПетриVWR89001-246150 мм x 20 мм
Тонкостенные 96-луночные ПЦР-планшеты с жесткой оболочкойBio-radHSP9665Для
многоканального пипеттора HRMA (P10)Integra Biosciences4721
Многоканальный дозатор (P300)Integra Biosciences4723
Nunc Полиолефиновый акрилатный герметизирующий ленец, Thermo ScientificVWR37000-548Для использования с 96-луночным ПЦР-планшеты для получения геномной ДНК
Оптическая герметизирующая лентаBio-rad2239444Для использования с 96-луночными ПЦР-планшетами с юбкой для HRMA
Phire Набор для прямой ПЦР животных тканей (без инструментов для отбора проб)Thermo FisherF140WHДля получения геномной ДНК и проведения ПЦР
Пластиковые делители флаконов для мухGenesee59-128W
Программное обеспечение для прецизионного анализа расплаваBio Rad1845025Используется для генотипирования образцов ДНК комаров и анализа свойств термической денатурации двухцепочечной ДНК (см. протокол шаг 3.3)
SeqMan ProDNAstar Программное обеспечениеДля множественного выравнивания последовательностей
Одноканальный пипетторGilson
Tweezers Dumont #5 11 смWPI14098
Белые поролоновые пробкиVWR60882-189
Широкий флакон с дрозофилами, полистиролGenesee32-117
Широкий лоток для флаконов с мухами, синийGenesee59-164B
Lasergene

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , Report No. 978 160(2009).
  2. WHO. Zika epidemiology update. WHO. , 1-13 (2019).
  3. WHO. Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever. WHO. , (2009).
  4. WHO. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791 (2020).
  5. Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  6. Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).
  7. Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).
  8. Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).
  9. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  10. Tong, S. Y., Giffard, P. M. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).
  11. Simko, I. High-resolution DNA melting analysis in plant research. Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).
  12. Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).
  13. O'Leary, S., Adelman, Z. N. CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971(2020).
  14. Kojin, B. B., et al. Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands. Malaria Journal. 20 (1), 11(2021).
  15. Ye, J., et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134(2012).
  16. Larkin, M. A., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).
  17. Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).
  18. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).
  19. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  20. Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
  21. Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380(2018).
  22. Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316(2017).
  23. Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

96

Похожие статьи