Визуализация молекулярной адгезии в клеточной прокатке с помощью анализа адгезионного следа

Scott Minh An; Seong Ho Kim; Vanessa J. White; Adam B. Yasunaga; Kathleen M. McMahon; Yousif Murad; Isaac T. S. Li

doi:10.3791/63013

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Визуализация молекулярной адгезии в клеточной прокатке с помощью анализа адгезионного следа

3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63013

⸱

27 сентября 2021 г.

Scott Minh An^*¹^,² , Seong Ho Kim^*¹ , Vanessa J. White^*¹^,² , Adam B. Yasunaga^*¹^,² , Kathleen M. McMahon² , Yousif Murad¹^,³ , Isaac T. S. Li¹^,²

¹Department of Chemistry, The University of British Columbia, ²Biochemistry and Molecular Biology, The University of British Columbia, ³Faculty of Medicine, The University of British Columbia

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе представлены экспериментальные процедуры для выполнения анализа адгезионного следа для изображения событий адгезии во время быстрой клеточной скользящей адгезии.

Аннотация

Скользящая адгезия, облегчаемая селектин-опосредованными взаимодействиями, представляет собой высокодинамичную, пассивную подвижность при наборе лейкоцитов к месту воспаления. Это явление происходит в посткапиллярных венулах, где кровоток толкает лейкоциты в скользящем движении по эндотелиальным клеткам. Стабильная прокатка требует тонкого баланса между образованием адгезионных связей и их механически управляемой диссоциацией, что позволяет ячейке оставаться прикрепленной к поверхности во время прокатки в направлении потока. В отличие от других процессов адгезии, происходящих в относительно статических средах, адгезия качения очень динамична, поскольку клетки качения перемещаются на тысячи микрон со скоростью десятки микрон в секунду. Следовательно, обычные методы механобиологии, такие как микроскопия силы тяги, непригодны для измерения отдельных событий адгезии и связанных с ними молекулярных сил из-за короткой временной шкалы и требуемой высокой чувствительности. Здесь мы описываем нашу последнюю реализацию анализа адгезионного следа для изображения P-селектина: взаимодействия PSGL-1 в адгезии качения на молекулярном уровне. Этот метод использует необратимые тросы натяжения на основе ДНК для получения постоянной истории событий молекулярной адгезии в виде флуоресцентных дорожек. Эти дорожки могут быть изображены двумя способами: (1) сшивание тысяч изображений с дифракционным ограничением для создания большого поля зрения, что позволяет извлекать адгезионный след каждой скользящей клетки длиной более тысяч микрон, (2) выполнение DNA-PAINT для реконструкции изображений со сверхвысоким разрешением флуоресцентных дорожек в небольшом поле зрения. В этом исследовании анализ адгезионного следа использовался для изучения клеток HL-60, катящихся при различных напряжениях сдвига. При этом мы смогли изобразить пространственное распределение взаимодействия P-селектина: PSGL-1 и получить представление об их молекулярных силах через интенсивность флуоресценции. Таким образом, этот метод обеспечивает основу для количественного исследования различных взаимодействий между клеткой и поверхностью, участвующих в адгезии качения на молекулярном уровне.

Введение

Каскад скользящей адгезии описывает, как циркулирующие клетки привязываются к стенке кровеносного сосуда и катятся вдоль ^нее1. Пассивная прокатка в основном опосредована селектинами, основным классом молекул клеточной адгезии (CAMs)¹. Под сдвиговым потоком крови лейкоциты, экспрессирующие Р-селектин гликопротеин лиганд-1 (PSGL-1), образуют высокопреходящие связи с Р-селектином, которые могут экспрессироваться на поверхности воспаленных эндотелиальных клеток. Этот процесс имеет решающее значение для того, чтобы лейкоциты мигрировали в место ^{воспаления2}. Кроме того, PSGL-1 также является механочувст....