Method Article

Метод недеградативной экстракции для определения молекулярной структуры частиц бактериального гликогена

DOI:

10.3791/63016

⸱

February 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioinformatics, School of Medical Informatics and Engineering, Xuzhou Medical University, 2Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 3Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 4Department of Biological Sciences, School of Life Sciences, Xuzhou Medical University, 5School of Chemistry and Molecular Biosciences, The University of Queensland, 6Centre for Nutrition and Food Sciences, Queensland Alliance for Agriculture and Food Innovation, The University of Queensland, 7Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, College of Agriculture, Yangzhou University, 8State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicines, Macau University of Science and Technology

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы экстракции сильно влияют на структуру бактериального гликогена, что может привести к молекулярной деградации и/или смещению выборки. Важно разработать методы, позволяющие свести эти проблемы к минимуму. Здесь были сравнены четыре метода экстракции с использованием распределения по размерам и распределения длины цепи в качестве ключевых критериев для минимизации артефактов экстракции.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящее время существует множество методов экстракции гликогена, которые либо повреждают пространственную структуру гликогена, либо лишь частично экстрагируют гликоген, что приводит к смещенной характеристике тонкомолекулярной структуры гликогена. Чтобы понять динамические изменения структуры гликогена и универсальные функции частиц гликогена у бактерий, необходимо изолировать гликоген с минимальной деградацией. В этом исследовании продемонстрирован метод мягкого выделения гликогена с использованием осаждения холодной водой (CW) с помощью ультрацентрифугирования с градиентом плотности сахара (SDGU-CW). Для сравнения также были проведены традиционный метод трихлоруксусной кислоты (ТСА) и метод гидроксида калия (КОН). Широко используемый лабораторный штамм, Escherichia coli BL21(DE3), был использован в качестве модельного организма в этом исследовании в демонстрационных целях. После экстракции частиц гликогена с помощью различных методов их структуры были проанализированы и сравнены с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) для распределения частиц по размерам и флуорофорного капиллярного электрофореза (FACE) для линейного распределения длины цепи. Анализ подтвердил, что гликоген, экстрагированный с помощью SDGU-CW, имеет минимальную деградацию.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гликоген представляет собой сильно разветвленный полисахарид, состоящий из глюкозильных остатков, а также небольшого, но значительного количества белков, в котором все глюкозильные остатки связаны между собой α-1,4-гликозидными связями в линейных цепях и α-1,6-гликозидными связями в точках ветвления1. Структура частиц гликогена обычно делится на три иерархии: 1) короткоцепочечные олигомеры, 2) сферические β частицы (~20 нм в диаметре) и 3) крупные розеткообразные α частицы, агрегированные вместе β частицами, диаметр которых колеблется примерно до 300 нм. В последнее время было установлено, что частицы гликогена α имеют у эукариот два структурных состояния: хрупкое состояние и стабильное состояние. В данном случае хрупкость означает диссоциацию более крупных α частиц на более мелкие β частицы в присутствии хаотропного агента, такого как ДМСО2. Дальнейшие анализы показали, что частицы гликогена α в диабетической печени постояннохрупкие3, а хрупкие частицы α разлагаются гораздо быстрее, чем стабильные частицы α4. Таким образом, структурная хрупкость гликогена может усугубить гипергликемические состояния при диабете 2,4, что делает хрупкие α-частицы потенциальным патологическим биомаркером диабета на молекулярном уровне. Тем не менее, о существовании частиц гликогена α у прокариотсообщается лишь эпизодически5, и нет никаких сообщений о двух различных структурных состояниях частиц гликогена α у бактерий.

Для того чтобы понять физиологические функции частиц бактериального гликогена, необходимо определить тонкую структуру молекул гликогена, что требует выделения гликогена с максимальным выходом и минимальной деградацией. До сих пор были разработаны различные методы экстракции гликогеном, включая, помимо прочего, экстракцию горячей водой, экстракцию трихлоруксусной кислотой (ТСА) и экстракцию горячей щелочью (гидроксид калия, KOH)6. Кроме того, сообщалось о другом методе, который обычно используется для выделения эукариотического гликогена, методе ультрацентрифугирования с градиентом плотности сахара (SDGU), для выделения бактериального гликогена у Selenomonas ruminantium и Fibrobacter succinogenes 7,8. Несмотря на то, что плюсы и минусы этих методов широко обсуждались в исследованиях эукариот 9,10, редко проводятся сравнительные исследования тонких структур гликогена, выделенных различными методами экстракции у бактерий с точки зрения структур гликогеновых частиц.

В данном исследовании этот вопрос был решен с использованием Escherichia coli BL21 (DE3) в качестве модельного организма. В общей сложности сравнивались четыре метода экстракции гликогеном, а именно: экстракция горячей водой с осаждением ТСА (TCA-HW), экстракция холодной водой с осаждением TCA (TCA-CW), экстракция горячим 30% раствором KOH (KOH-HW) и экстракция холодной водой с использованием ультрацентрифугирования с градиентом плотности сахарозы (SDGU-CW). Распределение частиц гликогена по размерам затем измеряли с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC), а распределение длины цепи определяли с помощью флуорофорного электрофореза углеводов (FACE), оба из которых использовались для оценки качества методов экстракции. Кроме того, стабильность и хрупкость частиц бактериального гликогена α также сравнивались между различными методами экстракции путем сравнения распределения частиц по размерам до и после обработки широко используемым хаотропным агентом, диметилсульфоксидом (ДМСО). Подробные процедуры экстракции гликогена и определения структурных характеристик представлены ниже. Таким образом, метод SDGU-CW имеет наилучший общий эффект с точки зрения структурной целостности гликогена и, следовательно, рекомендуется для экстракции бактериального гликогена в будущих соответствующих исследованиях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культивирование и сбор бактерий

  1. Реанимируйте E. coli BL21(DE3) из бактериального глицеринового сырья (-80 °C) путем инокуляции стерильной агаровой пластины LB (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl и 15 г/л агара). Поместите планшет в стандартный инкубатор и выращивайте в течение ночи при температуре 37 °C.
  2. Соберите одну колонию и введите ее в стерильную жидкую среду объемом 10 мл (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 10 г/л NaCl). Хорошо перемешайте с помощью вортексинга и культуры в течение ночи при 37 °C с встряхиванием при 220 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если не указано иное, все условия жидкого культивирования составляли 37 °C со скоростью встряхивания 220 об/мин.
  3. Перенесите 1 мл культуры кишечной палочки на ночь в 100 мл стерильной жидкой среды LB и закваливайте культуру на 5 ч. Переведите 50 мл в 1 л 1x M9 минимальной среды (3 г/л KH2PO4, 0,5 г/л NaCl, 6,78 г/л Na2HPO4 и 1 г/л NH4Cl), содержащей 0,8% D-(+)-глюкозы. Хорошо перемешиваем, и заквашиваем в течение 20 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 1x M9 минимальная среда и глюкоза были стерилизованы отдельно, а затем перемешаны при асептическом охлаждении до комнатной температуры.
  4. После культивирования в течение 20 ч центрифугирует бактериальный раствор при 6 000 x g в течение 15 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость. Храните гранулы в ячейках при температуре -80 °C в течение ночи, а затем сублимационно высушите гранулы.
  5. Закройте и храните лиофилизированный бактериальный порошок в холодильнике (-20 °C) для последующего использования.

2. Экстракция гликогена

  1. Экстракция горячей водой с осаждением трихлоруксусной кислоты (TCA-HW)
    1. Точно взвесьте 500 мг лиофилизированного порошка E. coli BL21 (DE3) и ресуспендируйте его в 20 мл ледяного 0,05 М триэтаноламина. Используйте ультразвуковую клеточную дробилку (энергия 25%, 4 °C) для разрушения бактериальных клеток в течение 3 минут (рабочие циклы 30 с и интервалы 2 с). Следите за тем, чтобы в растворе не было явных гранул.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разрушение клеток проводилось на льду. Отрегулируйте pH буфера TEA до pH 7 путем добавления HCl и храните при комнатной температуре.
    2. Переложите весь бактериальный гомогенат в две ультрацентрифужные пробирки объемом 10,4 мл (10 мл/пробирка). Наполните пробирки деионизированной водой доверху и центрифугируйте при давлении 104 000 x g в ультрацентрифуге при температуре 4 °C в течение 90 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
    3. Добавьте 2 мл деионизированной воды, чтобы повторно суспендировать гранулу в каждой пробирке. Перенесите суспензию в центрифужную пробирку объемом 50 мл и добавьте деионизированную воду до конечного объема 20 мл. Нагрейте и варите 5 минут, чтобы денатурировать все белки.
    4. Центрифугируйте суспензию в течение 10 мин при давлении 18 000 x g и удерживайте надосадочную жидкость (S1). Обрабатывайте осадок так же, как и в пункте 2.1.3. Объедините новую надосадочную жидкость (S2) с S1.
    5. Добавьте 50% ТСА (0,1 объема) в надосадочную жидкость (S1+S2) и поместите смесь на лед на 10 минут для осаждения макромолекул, таких как ДНК, РНК, белки и т. д. Центрифугируйте смесь при давлении 18 000 x g в течение 10 мин и смешайте надосадочную жидкость с 1,5 объемом абсолютного этанола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация ТСА составляет 50% v/v. Для хранения держите его вдали от света.
    6. Осаждать гликоген на льду в течение 20 минут и центрифугировать при давлении 18 000 x g в течение 10 минут. Вылейте надосадочную жидкость.
    7. Растворите гранулу в 5 мл ddH2O, а затем добавьте 5 мл ледяного абсолютного этанола. Инкубируйте раствор в течение ночи при 4 °C и центрифугируйте при 18 000 x g в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и оставьте гранулы.
    8. Повторите шаги «промывка и осаждение», как в пункте 2.1.7, еще два раза.
    9. Наконец, растворите осажденный гликоген в 400 мкл ddH2O в пробирке объемом 2 мл, предварительно заморозьте при -80 °C и обсушите для получения сухого порошка гликогена.
  2. Экстракция холодной водой с осаждением трихлоруксусной кислоты (TCA-CW)
    Примечание: Метод TCA-CW аналогичен методу TCA-HW, за исключением того, что после удаления надосадочной жидкости обрабатывают гранулу без кипячения (см. шаг 2.1.3) и повторно суспендируют ее в 20 мл ddH2O, содержащем коктейль ингибиторов протеазы 1 мг/мл.
    1. Для приготовления коктейля ингибитора протеазы 1 мг/мл растворить 50 мг коктейля ингибитора протеазы в 1 мл деионизированной воды и развести в соотношении 50:1 (раствор коктейля деионизированная вода: ингибитор протеазы).
  3. Экстракция холодной водой с использованием ультрацентрифугирования с градиентом плотности сахарозы (SDGU-CW)
    1. Растворите и гомогенизируйте 1 г лиофилизированного порошка кишечной палочки в 4 мл буфера для экстракции гликогена (GEB) с коктейлем ингибиторов протеазы 1 мг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: GEB состоит из 50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 50 мМ NaF и 5 мМ пирофосфата натрия. GEB необходимо отрегулировать до pH 8 с помощью HCl.
    2. Используйте ультразвуковую клеточную дробилку (энергия 25%, 4 °C) для разрушения бактериальных клеток в течение 3 минут (рабочие циклы 8 с и интервалы 9 с). Следите за тем, чтобы весь процесс проводился на льду. После сонификации перенесите бактериальный гомогенат в центрифужную пробирку, заполните ее GEB до конечного объема 10 мл и перемешайте пробирку для перемешивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не гомогенизируйте слишком долго, так как выделяемое тепло может привести к ухудшению гликогена.
    3. Центрифуга при 6 000 x g в течение 10 мин при 4 °C. Перенесите надосадочную жидкость в ультрацентрифужную пробирку объемом 10,4 мл, заполните пробирку доверху GEB, а затем центрифугируйте при 360 000 x g в течение 2 ч при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что трубка заполнена и в ней нет пузырьков воздуха.
    4. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте осадок с 2 мл деионизированной воды.
    5. В новую ультрацентрифужную пробирку медленно нанесите 4 мл 75% раствора сахарозы с 4 мл 37,5% раствора сахарозы. Затем сверху раствор сахарозы насыпьте полученную на шаге 2.3.4 суспензию, а затем долейте деионизированную воду (см. рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация сахарозы составляет 75% [v/v] и 37,5% [v/v]. Будьте осторожны при создании градиента плотности сахарозы и убедитесь, что между двумя растворами сахарозы есть заметное наслоение. Также следите за тем, чтобы в ультрацентрифужной пробирке не было пузырьков воздуха.
    6. Центрифугируйте при 360 000 x g в течение 2,5 ч при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Растворите гранулу в 200 μл деионизированной воды. Добавьте 800 мкл абсолютного этанола для осаждения гликогена.
    7. Осадите гликоген до -20 °C в течение ночи. Центрифугируйте при давлении 4 000 x g в течение 10 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
    8. Растворите полученную гранулу в 400 мкл ddH2O в пробирке объемом 2 мл, предварительно заморозьте при -80 °C и обсушите для получения сухого порошка гликогена. Сухой порошок гликогена хранить при температуре 4 °C для структурного анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная процедура показана на рисунке 1.
  4. Экстракция горячим 30% раствором гидроксида калия (KOH-HW)
    1. Кипятить лиофилизированный порошок кишечной палочки (50 мг) в 1 мл 30% [w/v] KOH в течение 1 ч.
    2. Добавьте 67% [v/v] этанола, содержащего 15 мМ LiCl, для осаждения при температуре -20 °C в течение не менее 1 ч. Центрифугируйте образцы при давлении 16 000 x g при 4 °C в течение 20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 67% [v/v] этанола с 15 мМ LiCl содержит 0,6358 г LiCl, 67 мл абсолютного этанола и 33 мл деионизированной воды.
    3. Растворите гранулы в 1 мл ddH2O и нагревайте в течение 10 минут при температуре 95 °C с прерывистым перемешиванием.
    4. Повторите этап осаждения этанола еще три раза, как описано в пункте 2.4.2. Растворите конечную гранулу в 400 мкл ddH2O в пробирке объемом 2 мл, предварительно заморозьте при -80 °C и обсушите для получения сухого порошка гликогена.

3. Определение структуры гликогена

  1. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
    1. Ресуспендируйте порошок гликогена в 50 мМ трис-буферизованном физрастворе (pH 7) с конечной концентрацией 1 мг/мл.
    2. Сделайте 10-кратное разбавление суспензии и нанесите разведенную суспензию на тлеющую медную сетку 400 меш.
    3. Через 2 минуты снимите лишний образец с сетки с помощью фильтровальной бумаги и окрасьте сетку 2-3 каплями 1% уранилацетата.
    4. Используйте просвечивающий электронный микроскоп, работающий на напряжении 75 кВ, для исследования препаратов.
  2. Эксклюзионная хроматография (SEC)
    1. Приготовление подвижной фазы: в деионизированной воде готовят 0,02% (масс./масса) растворы азида натрия и 50 мМ нитрата натрия и фильтруют через фильтрующую мембрану толщиной 0,45 мкм. Используйте ультразвуковую осциллирующую водяную баню для ультразвуковой обработки раствора в течение более 15 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха.
    2. Подготовка образца: Используйте подвижную фазу для растворения порошка гликогена так, чтобы конечная концентрация составила 1 мг/мл. Инкубируйте раствор при температуре 80 °C в течение ночи в термомиксере. Центрифугируйте растворенный образец при давлении 6 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре и перенесите надосадочную жидкость в стандартный флакон SEC.
    3. Подготовка образцов гликогена, обработанных ДМСО
      1. Растворите 1 мг порошка гликогена в 300 мкл ДМСО и инкубируйте при 80 °C в течение ночи в термомиксере. Добавьте 4-кратный объем этанола для осаждения гликогена и центрифугируйте раствор при 6000 x г.
      2. Дважды промойте гранулу с этанолом, растворите гранулу в ddH2O и лиофилизируйте.
      3. Проанализируйте лиофилизированный порошок гликогена с помощью SEC, подготовив образцы, как описано выше.
    4. Используйте систему SEC с предколонками, а также 1000 и 10000 колонок для анализа распределения частиц гликогена по размерам. Поддерживайте температуру в колоннах при температуре 80 °C и скорость потока 0,3 мл/мин.
  3. Флуорофор-ассистированный углеводный электрофорез (FACE)
    1. Удаление гликогена
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании FACE для определения распределения длины цепи (CLD) все исследуемые образцы должны пройти предварительную обработку от ветвления.
      1. Добавьте в пробирку 0,5 мг порошка гликогена, 90 мкл горячей воды (90 °C), 1,5 мкл раствора NaN3 , 3,5 мкл изоамилазы (200 Ед/мл) и 8 мкл буфера уксусной кислоты и ацетата натрия (pH 3,5).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Изоамилаза добавляется для того, чтобы специально разрезать разветвленную цепь исследуемого образца. Изоамилаза является ферментом, разрушающим ветвление, который может специфически разрушать связь α-(1-6) без разрушения связи α-(1-4), поэтому он может специфически расщеплять боковую цепь гликогена, не разрушая структуру основной цепи.
      2. Выдержать смесь при температуре 37 °C в течение 3 ч в термомиксере. После получения нейтрального pH с 8 мкл 0,1 М раствора NaOH инкубируйте смесь при 80 °C в течение 1 ч в термомиксере.
      3. Добавьте в смесь в 4 раза больше абсолютного этанола, чтобы осадить гликоген. Затем центрифугируйте при 6 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре. Дважды промойте гранулу этанолом, растворите гранулу в ddH2O и лиофилизируйте.
    2. Приготовление флуоресцентного раствора
      1. Центрифугируйте флакон с реагентом APTS (8-аминопирен-1,3,6-трисульфоновая кислота тринатриевая соль) (каждый флакон содержит 5 мг APTS) при 4 000 x g в течение 2 минут. Добавьте 50 μL 15% раствора уксусной кислоты для растворения порошка, хорошо перемешайте и центрифугируйте при 4000 x g в течение 2 минут при комнатной температуре до получения 0,2 М раствора уксусной кислоты APTS.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить раствор APTS в холодильнике при температуре -20 °C.It необходимо полностью использовать в течение двух недель после открытия. В противном случае он будет деактивирован. APTS — это обычно используемый отрицательно заряженный краситель, который связывается с восстанавливающим концом гликогеновой цепи. Поскольку все цепи с разной степенью полимеризации (DP) несут только один отрицательный заряд, FACE может разделить их на основе их разного соотношения массы к заряду. Таким образом, флуоресцентный детектор обнаруживает сигналы различных значений DP.
    3. Перенесите очищенный гликоген в пробирку и добавьте 1,5 мкл раствора APTS и 1,5 мкл раствора цианоборогидрида натрия. Инкубировать при температуре 60 °C в течение 1,5 ч в темноте. Добавьте 80 μL деионизированной воды, центрифугируйте при 4 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре и держите надосадочную жидкость.
    4. Введите образец в систему капиллярного электрофореза путем инжекции в течение 3 с при давлении 0,5 фунта на квадратный дюйм (на 3,4 кПа выше атмосферного давления).
      Примечание: Флуоресцентно меченые линейные глюканы разделяли с помощью приложенного напряжения 30 кВ и приблизительного тока 14 мА при 25 °C. Участки вершин давали относительные количества глюканов с разной массой (степень полимеризации (ДП) глюканов в соседних пиках отличалась на 1 ДП). Температуру образца поддерживали на уровне 18 °C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Распределение частиц гликогена по размерам
Ряд исследований показал, что частицы гликогена α печени при диабете хрупкие и легко расщепляются в разрушителе водородных связей ДМСО 11,12,13,14. В настоящем исследовании проверялось, как изменяются размер частиц и структурная стабильность бактериального гликогена, экстрагированного четырьмя различными методами. Все образцы гликог...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гликоген является важным энергетическим резервом, который был идентифицирован у многих бактерий16. Чтобы проанализировать физиологические функции частиц гликогена, важно лучше понимать тонкую структуру молекул гликогена. На сегодняшний день разработано множество методов извлечения гликогена из бактериальной культуры. Тем не менее, при разных методах экстракции наблюдалось различное распределение частиц гликогена по размерам, что предполагает повреждение структуры ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы очень благодарны профессору Роберту Г. Гилберту из Университета Квинсленда и Университета Янчжоу, который поделился своими знаниями и опытом, которые в значительной степени помогли завершить это исследование. Мы выражаем признательность за финансовую поддержку Национальному фонду естественных наук Китая (No 31900022, No 32171281), Фонду естественных наук провинции Цзянсу (No . BK20180997), Молодежная команда по инновациям в области науки и техники Медицинского университета Сюйчжоу (No. TD202001) и проект Цзянсу Цинлань (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Agilent 1260 infinity SEC системаAgilent1260 infinity IIРаспределение частиц по размерам
Аналитическая колонкаPSS10-1000-Центрифуга
Eppendorf5420-Фильтрующая
мембранаCambioKm-0220-
Флуоресцентная система капиллярного электрофорезаBeckman Coulter-Chainс распределением длины
Сублимационная сушилкаXinzhiSCIENTZ-10NЛиофилизация бактерий и гликогена
Морозильная камераThermo FisherForma 900Защитная
колоннаPSSSUPPERMA-инкубатор
Thermo FisherPR505750R-CN-
Низкоскоростная центрифуга большой емкостиHexiHR/T20MMЦентрифуга образцов
Multiskan FC считыватель микропланшетовThermo Fisher
1410101-Optima XPN ультрацентрифугаBeckmanXPN-100/90/80для гликогенового
генератораXinbaoSHZ-82-PA-800
Plus системаBeckman CoulterA66528-pH-метр
Mettler ToledoFE28-TRIS-Детектор
показателя преломленияWyattOptilab T-rEX-Холодильник
HaierBCD-406WDPD-Термомиксер
Shanghai JingxinJXH-100Инкубация образцов
Пропускающий электронный микроскопHitachi CorporationH-7000Морфология гликогеновых частиц
Ультрацентрифужная трубкаBeckman355651-Ультразвуковая
клеточная дробилкаNingbo XinzhiScientz-IID  Разрушитель бактерий
Ультразвуковая осциллирующая водяная баняJietuoJT-1027HTD-Вихревой
смесительTiangenOSE-VX-01-Водная
системаMerck MilliporeH2O-MM-UV-TДеионизированная вода
Материал
8-Аминопирен-1,3,6-Трисульфоновая кислота Тринатриевая сольSigma-Aldrich196504-57-1-Абсолютный
этанолGuoyao10009228-Агаровый
порошокSolarbioA1890-Альфа-амилаза
MegazymeE-BLAAM-40ML-Амилоглюкозидаза
MegazymeE-AMGDF-40ML-cOmplete
MiniRoche4693159001-D
- (+)Набор для анализа глюкозыSigma-AldrichG8270-1KG-D-глюкозы
(формат GOPOD)MegazymeK-GLUCQuantification Glycogen
DimethylsulfoxideVicmedVic147Хаотропный агент
E. coli BL21(DE3)TiangenCB105-02-Этилендиамин
тетрауксусная кислотаVicmedVic1488-
Ледяная уксусная кислотаGuoyao
10000218-глицеринGuoyao10010618Хранение бактерий
Соляная кислотаGuoyao
10011008-гидроксиметиламинометанSigma-AldrichV900483-500г-изоамилаза
MegaZyme9067-73-6Удаление гликогена
Хлорид литияSigma-Aldrich62476-100G-M9
, минимальное количество солей, 5&раз;Sigma-AldrichM6030-1kgБактериальная культура
Гидроксид калияGuoyao10017008-Pullulan
стандартныйPSS-
-Тригидрат ацетата натрияGuoyao10018718-Азид
натрияSigma-Aldrich26628-22-8-Хлорид
натрияGuoyao10019318Бактериальный
культура цианоборогидрид натрияHuaweiruikehws001297-Дифосфат
натрияSigma-Aldrich71515-250г-Фторид
натрия MacklinS817988-250г-Гидроксид
натрияGuoyao10019762-Нитрат
натрияGuoyao
10019928-пирофосфат натрияСигма-ОлдричV900195-500г-сахароза
Guoyao
10021463-трихлоруксусная кислотаGuoyao
40091961-триптоноксоидLP0042бактериальная культура
дрожжевой экстрактоксоидLP0021бактериальная культура
для хранения образцов

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in Escherichia coli. Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
  2. Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
  3. Hu, Z., et al. Diurnal changes of glycogen molecular structure in healthy and diabetic mice. Carbohydrate Polymers. 185, 145-152 (2018).
  4. Nawaz, A., Zhang, P., Li, E., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. The importance of glycogen molecular structure for blood glucose control. iScience. 24 (1), 101953(2021).
  5. Rashid, A. M., et al. Assembly of α-glucan by GlgE and GlgB in mycobacteria and streptomycetes. Biochemistry. 55 (23), 3270-3284 (2016).
  6. Wang, L., et al. Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14(2020).
  7. Kamio, Y., Terawaki, Y., Nakajima, T., Matsuda, K. Structure of glycogen produced by Selenomonas ruminantium. Agricultural and Biological Chemistry. 45 (1), 209-216 (1981).
  8. Gong, J., Forsberg, C. W. Separation of outer and cytoplasmic membranes of Fibrobacter succinogenes and membrane and glycogen granule locations of glycanases and cellobiase. Journal of Bacteriology. 175 (21), 6810-6821 (1993).
  9. Mojibi, N. Comparison of methods to assay liver glycogen fractions: the effects of starvation. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (3), (2017).
  10. Orrell, S. A., Bueding, E. A comparison of products obtained by various procedures used for the extraction of glycogen. The Journal of Biological Chemistry. 239, 4021-4026 (1964).
  11. Tan, X., et al. Proteomic investigation of the binding agent between liver glycogen beta particles. ACS Omega. 3 (4), 3640-3645 (2018).
  12. Hu, Z., et al. Diurnal changes of glycogen molecular structure in healthy and diabetic mice. Carbohydrate Polymers. 185, 145-152 (2018).
  13. Sullivan, M. A., Harcourt, B. E., Xu, P., Forbes, J. M., Gilbert, R. G. Impairment of liver glycogen storage in the db/db animal model of type 2 diabetes: a potential target for future therapeutics. Current Drug Targets. 16 (10), 1088-1093 (2015).
  14. Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
  15. Sullivan, M. A., et al. Molecular structural differences between type-2-diabetic and healthy glycogen. Biomacromolecules. 12 (6), 1983-1986 (2011).
  16. Wang, L., et al. Systematic analysis of metabolic pathway distributions of bacterial energy reserves. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (8), 2489-2496 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Glycogen ExtractionBacterial GlycogenMolecular Structure CharacterizationCold Water PrecipitationSugar Density GradientUltracentrifugationEscherichia ColiSize Exclusion ChromatographyCapillary ElectrophoresisGlycogen Particle Isolation
Video Coming Soon

Related Articles