Гибкий методологический конвейер для идентификации, визуализации и количественного определения тонких субклеточных нейронных процессов в объемах изображений сфокусированного ионного пучка сканирующей электронной микроскопии с использованием удобных для пользователя пакетов программного обеспечения с открытым исходным кодом.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
3D-реконструкция и анализ тонких субклеточных нейронных структур с использованием данных сканирующей электронной микроскопии с помощью пучка сфокусированных ионов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Последние достижения в технологиях сканирующего электронного микроскопа теперь позволяют проводить быстрый трехмерный (3D) анализ ультратонких субклеточных процессов. Здесь представлен методологический конвейер для идентификации, визуализации и анализа тонких нейронных процессов, таких как те, которые проецируются в пресинаптические бутоны других нейронов (называемые «шиповыми»). Используя свободно доступные программные пакеты, этот протокол демонстрирует, как использовать дерево решений для идентификации общих нейронных субклеточных структур с использованием морфологических критериев в объемах изображений сфокусированной ионной пучковой сканирующей электронной микроскопии (FIB-SEM), уделяя особое внимание идентификации разнообразия шипиков, выступающих в пресинаптические бутоны. В частности, этот протокол описывает, как проследить спинулы в нейронных синапсах для создания трехмерных реконструкций этих тонких субклеточных проекций, их родительских нейритов и постсинаптических партнеров. Кроме того, протокол включает в себя список свободно доступных программ с открытым исходным кодом для анализа данных FIB-SEM и предлагает советы (например, сглаживание, освещение) по улучшению 3D-реконструкций для визуализации и публикации. Этот адаптируемый протокол предлагает отправную точку для быстрого наноразмерного анализа субклеточных структур в объемах изображений FIB-SEM.
Введение
Исследования структурно-функциональных отношений субклеточных компонентов нанометрового толщина часто выигрывают от 3D-визуализации и анализа1. Тем не менее, исследования просвечивающей электронной микроскопии серийных срезов были ограничены во времени и пространстве необходимостью использования алмазного ножа для резки и выравнивания сотен и тысяч серийных ультратонких срезов с длиной волны ≥40 нм. Эти ограничения ограничивают возможность отбора проб и эффективного анализа тонких (<40 нм в диаметре) субклеточных структур, а необходимость стать опытным специалистом в ультратонком серийном срезе затрудняет приме....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Объем изображения и размер субклеточного объекта: соображения и регистрация
- Получить качественное изображение объема изображения FIB-SEM области интереса, содержащей субклеточные объекты интереса.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются сегменты объема изображения FIB-SEM из первичной зрительной коры хорька позднего подросткового возраста (24,2 x 16,2 x 2,4 мкм, изотропные воксели 4 нм), а также свободно доступный объем FIB-SEM из гиппокампа CA1 взрослой крысы (10,2 x 7,7 x 5,3 мкм; 5 нм изотропных вокселей), предоставленный лабораторией Нотта (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). Крайне важно подготовить....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Количественная оценка процентного соотношения синаптических шипиковых элементов в возбуждающей популяции пресинаптических бутонов в первичной зрительной коре хорька
Хотя шиповидные выступы из нейритов в возбуждающие пресинаптические бутоны наблюдались в течение десятилетий19,26, их потенциальная важность для синаптической функции оставалась неясной. Эти эксперименты были разработаны для определения доли возбуждающих пресинаптических бутонов, с.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот конвейер объемного анализа изображений FIB-SEM может производить надежные 3D-реконструкции и количественные измерения тонких субклеточных структур. В то время как современные полуавтоматические методы с использованием глубоких нейронных сетей и алгоритмов сегментации могут увеличить скорость и эффективность реконструкции клеточных структур, обладающих относительно высоким мембранным контрастом в больших объемахизображения33, многие субклеточные структуры (нап.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
Эта работа была поддержана Фондом моста Вашингтонского университета и Фондом пилотного проекта RRF Университета Вашингтона в Такоме. Большое спасибо доктору Клаудии Лопес и доктору Джессике Ристерер из MMC Орегонского университета здоровья и наук за техническую поддержку FIB-SEM, доктору Грэму Нотту за использование объема изображения CA1 FIB-SEM, а также студентам Вашингтонского университета в Такоме на курсе «Нейрональные реконструкции» (TBIOMD 495) за их терпение и мастерство в работе с этим протоколом.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Фиджи (ImageJ) | https://imagej.net/software/fiji/downloads | ||
| Реконструкция | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | ||
| Blender | Blender Foundation | https:/www.blender.org |
Ссылки
- Holler, S., Kostinger, G., Martin, K. A. C., Schuhknecht, G. F. P., Stratford, K. J. Structure and function of a neocortical synapse. Nature. 591 (7848), 111-116 (2021).
- Xu, C. S., Pang, S., Hayworth, K. J., Hess, H. F. Transforming FIB-SEM. Volume microscopy: Multiscale imaging with photons, electrons, and io....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
