3D-реконструкция и анализ тонких субклеточных нейронных структур с использованием данных сканирующей электронной микроскопии с помощью пучка сфокусированных ионов

Summary

Гибкий методологический конвейер для идентификации, визуализации и количественного определения тонких субклеточных нейронных процессов в объемах изображений сфокусированного ионного пучка сканирующей электронной микроскопии с использованием удобных для пользователя пакетов программного обеспечения с открытым исходным кодом.

Abstract

Последние достижения в технологиях сканирующего электронного микроскопа теперь позволяют проводить быстрый трехмерный (3D) анализ ультратонких субклеточных процессов. Здесь представлен методологический конвейер для идентификации, визуализации и анализа тонких нейронных процессов, таких как те, которые проецируются в пресинаптические бутоны других нейронов (называемые «шиповыми»). Используя свободно доступные программные пакеты, этот протокол демонстрирует, как использовать дерево решений для идентификации общих нейронных субклеточных структур с использованием морфологических критериев в объемах изображений сфокусированной ионной пучковой сканирующей электронной микроскопии (FIB-SEM), уделяя особое внимание идентификации разнообразия шипиков, выступающих в пресинаптические бутоны. В частности, этот протокол описывает, как проследить спинулы в нейронных синапсах для создания трехмерных реконструкций этих тонких субклеточных проекций, их родительских нейритов и постсинаптических партнеров. Кроме того, протокол включает в себя список свободно доступных программ с открытым исходным кодом для анализа данных FIB-SEM и предлагает советы (например, сглаживание, освещение) по улучшению 3D-реконструкций для визуализации и публикации. Этот адаптируемый протокол предлагает отправную точку для быстрого наноразмерного анализа субклеточных структур в объемах изображений FIB-SEM.

Introduction

Исследования структурно-функциональных отношений субклеточных компонентов нанометрового толщина часто выигрывают от 3D-визуализации и анализа¹. Тем не менее, исследования просвечивающей электронной микроскопии серийных срезов были ограничены во времени и пространстве необходимостью использования алмазного ножа для резки и выравнивания сотен и тысяч серийных ультратонких срезов с длиной волны ≥40 нм. Эти ограничения ограничивают возможность отбора проб и эффективного анализа тонких (<40 нм в диаметре) субклеточных структур, а необходимость стать опытным специалистом в ультратонком серийном срезе затрудняет применение 3D-структурного анализа ^2,3. Тем не менее, последние достижения в сканирующей электронной микроскопии с сфокусированным ионным пучком (FIB-SEM) произвели революцию в скорости и разрешении получаемых объемов изображений и теперь позволяют проводить количественный анализ тонких субклеточных структур, таких как гладкие эндоплазматические ретикулы ^4,5, нейронные синапсы ^3,6 и синаптические везикулы ^7,8 в масштабе. Кроме того, более широкое использование объемов изображений FIB-SEM ускорило разработку свободно доступных хранилищ объемов изображений FIB-SEM⁹ и программного обеспечения для 3D-анализа (например, Espina¹⁰, IMOD¹¹, Neuromorph¹², Reconstruct¹³, TrakEM¹⁴), которые расширяют возможности этой технологии и теперь позволяют исследовать структуру и функции тонких субклеточных структур.

Одной из таких наноразмерных субклеточных особенностей является нейрональная синаптическая «спинула». Шипиковые отростки тонкие (~0,06-0,15 мкм в ширину, 0,1-1 мкм в длину), пальцеобразные выступы, которые исходят от одного нейрона и инкапсулируются нейритом (например, пресинаптическим бутоном) другого нейрона^15,16. О шиповидных выпячиваниях, встроенных в нейронные процессы, сообщалось в литературе по электронной микроскопии в течение почти 60^лет17, а шиповидные выступы являются консервативным 18,19,20 и повсеместным^21,22 признаком возбуждающих синапсов. Тем не менее, несмотря на распространенность синаптических шиповидных столбиков, их функции остаются неясными, и существует нехватка необходимых данных, чтобы объяснить их численность и структурную сохранность. Это отсутствие экспериментальной характеристики позвоночника в основном связано с трудностями количественного анализа распространенности и размеров позвоночника. Их малые размеры лучше всего подходят для анализа с использованием ранее недостижимого разрешения z (глубина) (т. е. ≤15 нм).

Здесь представлен конвейер анализа FIB-SEM для идентификации, визуализации и анализа тонких (с поперечными сечениями шириной ≤40 нм) субклеточных структур, которые могут служить отправной точкой как для новичков, так и для экспертов FIB-SEM. Этот протокол служит основой для идентификации нейронных субклеточных структур в объеме 3D FIB-SEM изображения, подчеркивая, как использовать конкретные критерии для распознавания и классификации подтипов шипиковых элементов и синапсов. Кроме того, протокол демонстрирует, как импортировать объемы изображений в бесплатную программную платформу для 3D-анализа (Reconstruct), использовать это программное обеспечение для отслеживания шипиковых отложений в возбуждающих нейронных синапсах и производить 3D-реконструкции этих субклеточных проекций, их родительских нейритов и инкапсулирующих пресинаптических бутонов. Наконец, протокол показывает, как использовать бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом для 3D-реконструкций (Blender) для сглаживания «кожи» на 3D-реконструкциях для визуализации и потенциальной публикации, подробно описывая преимущества и потенциальные подводные камни этой техники.

Protocol

1. Объем изображения и размер субклеточного объекта: соображения и регистрация

1. Получить качественное изображение объема изображения FIB-SEM области интереса, содержащей субклеточные объекты интереса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются сегменты объема изображения FIB-SEM из первичной зрительной коры хорька позднего подросткового возраста (24,2 x 16,2 x 2,4 мкм, изотропные воксели 4 нм), а также свободно доступный объем FIB-SEM из гиппокампа CA1 взрослой крысы (10,2 x 7,7 x 5,3 мкм; 5 нм изотропных вокселей), предоставленный лабораторией Нотта (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). Крайне важно подготовить тканевые блоки для FIB-SEM с использованием протокола, который сохраняет ультраструктурные детали и обеспечивает высокий контраст в условиях визуализации FIB-SEM^23,24. Важно отметить, что ткань должна быть визуализирована таким образом, чтобы результирующее воксельное разрешение изображения FIB-SEM составляло <0,5 × размера диаметра наименьшей субклеточной структуры, представляющей интерес. Например, поскольку участки выпячивания позвоночника в пресинаптические бутоны могут быть всего 30 нм в диаметре, размер вокселя в <15 нм был бы подходящим для отбора образцов этих структур выше критерия Найквиста. Кроме того, полезно визуализировать ткань с изотропным (одинаковым по всем размерам) разрешением (например, вокселями 5 x 5 x 5 нм) для визуализации и реконструкции тонких структур, которые имеют одинаковые размеры во всех плоскостях x/y/z.
2. Загрузите и установите дистрибутив ImageJ²⁵ (https://imagej.net/software/fiji/downloads) для Фиджи.
3. Выровняйте объем изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как современные системы FIB-SEM выдают примерно выровненные объемы изображений, регистрация изображения к изображению все еще может страдать от субпиксельного дрейфа.
   1. На Фиджи перейдите в раздел Плагины | Регистрация и выберите Зарегистрировать виртуальные срезы стека. Обратитесь за помощью к Руководству пользователя (https://imagej.net/Register_Virtual_Stack_Slices). Начните с жесткой регистрации, а затем используйте аффинную технику, если это необходимо.
4. Масштабируйте объем изображения.
   1. Откройте выровненный том изображения на Фиджи, нажав на Файл | Импорт | Последовательность изображений и переход к папке с выровненными изображениями.
   2. В диалоговом окне нажмите кнопку Сортировать имена по числам , если изображения названы в порядке чисел. Нажмите « Использовать виртуальный стек для более быстрой работы на Фиджи».
   3. Как только изображение будет открыто, нажмите на Изображение | Свойства и вставка физического размера изображения в пикселях объемных пикселей в микрометрах в полях высоты, ширины и глубины в пикселях. Введите um OR μm в каждом из крайних правых полей. Сохраните этот выровненный том изображения как файл .tiff, нажав Файл | Сохранить как | Тифф.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если изображение было масштабировано, то в верхней части изображения теперь должен быть указан размер изображения в микрометрах (например, 9,82 x 8,65 мкм).

2. Идентификация нейритов и синаптических шишек

1. Прокручивая стек (с помощью клавиш со стрелками или колеса мыши), обратитесь к дереву решений по идентификации нейритов (рисунок 1) и примерам разделенных нейритов (рисунок 2) для поиска и идентификации интересующих объектов.
   1. Определите синаптические шипики как мембранные выступы нейрита, которые полностью покрываются пресинаптическим или постсинаптическим нейритом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Положительная синаптическая идентификация шиповидной оболочки требует визуального доказательства того, что оболочка объекта, выступающая из шиповидной оболочки, инвагинирует в инвертированную мембрану пресинаптической или постсинаптической структуры, а также наличия связанного с мембраной шиповидного слоя, полностью инкапсулированного мембраной пре- или постсинаптической структуры, по крайней мере, на одном изображении.
2. Создание регионов интереса (ROI) на Фиджи
   1. Нажмите на соответствующий инструмент на панели инструментов Фиджи (например, овальный инструмент), а затем щелкните и перетащите изображение, чтобы сформировать ROI. Запишите этот ROI в менеджере ROI, введя букву «T».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь менеджер ROI должен отображаться с координатами изображения в качестве имени по умолчанию.
   2. Переименуйте ROI по своему усмотрению, нажав кнопку «Переименовать » в диспетчере ROI и введя нужное имя в появившемся текстовом поле. Переименовывайте ROI на основе количественных критериев (например,^12-й пресинаптический бутон, который анализируется и имеет два синапса с постсинаптическими шипами, может быть назван B12_s,s).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы связать каждый ROI с одним «срезом» изображения (а не присутствовать во всем стеке изображений) и сделать имена ROI видимыми на отдельных изображениях, нажмите на эти параметры в Менеджере ROI | Подробнее | Опции , а затем установите флажки Показать все и Метки в нижней части Менеджера окупаемости инвестиций. Обратите внимание, что этот шаг имеет решающее значение при сохранении ROI в объеме изображения, поскольку связывание ROI со всем объемом изображения, а не с отдельными изображениями, может привести к двойному учету объектов в объеме.
   3. Чтобы сохранить все показатели ROI, которые в настоящее время находятся в менеджере ROI , в виде файла, сначала нажмите кнопку «Отменить выбор » в менеджере ROI, нажмите кнопку «Еще» и прокрутите вниз до пункта «Сохранить».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот сохраненный файл .zip теперь можно открыть на Фиджи для перезагрузки всех этих ROI в Менеджер ROI.

3. Определение области интереса и передача объема изображения в программное обеспечение для 3D-анализа

1. Определите, желательно ли переносить весь объем изображения в программное обеспечение для 3D-реконструкции и анализа или следует создать меньший сабстек (см. 3.3.2) для анализа меньшего числа изображений и/или интересующей области из исходного стека.
2. Проведите небольшое «пилотное» исследование на относительно небольшой площади, содержащей интересующий объект(ы), чтобы оценить величину эффекта и количество интересующих объектов, необходимых для получения желаемой мощности для статистического сравнения. Используйте консервативную оценку размера объема изображения, необходимого для выборки интересующих объектов, если эти субклеточные объекты неравномерно распределены в объеме изображения.
3. Чтобы использовать часть объема изображения для 3D-анализа, сначала продублируйте объем изображения, нажав на кнопку Изображение | Дубликат.
   1. Чтобы использовать обрезанную часть изображения для анализа, выберите инструмент «Прямоугольник » на панели инструментов «Фиджи» и нарисуйте нужную область интереса; Если этого не хочется, переходите к следующему шагу.
   2. Перейти к изображению | Стеки | Инструменты | Сделайте сабстек. Введите в текстовое поле диапазон изображений, которые будут включены в подстек (например, включите изображения от 1 до 500, введя 1 - 500).
   3. Обратитесь к приведенным выше соображениям по выборке (примечание после 1.1), чтобы определить требуемое z-разрешение на основе размера интересующего объекта(ов). Например, если объем изображения имеет глубину вокселя 5 нм, можно сделать выборку интересующего объекта с интервалом 10 нм в z-измерении, чтобы Фиджи сохранила все остальные изображения в сабстеке. Для этого введите номер n-го изображения после диапазона (например, чтобы включить только каждое второе изображение в диапазоне изображений от 1 до 500, введите 1 - 500 - 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый пакет программного обеспечения для 3D-анализа (см. Таблицу 1) будет иметь свои собственные требования к импорту файлов. Этот протокол предназначен для импорта томов изображений, сохраненных в виде файлов .tiff, в программное обеспечение для обработки томов изображений Reconstruct.

4. 3D реконструкции и анализ тонких субклеточных структур в Reconstruct

ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании Реконструкции очень выгодно использовать мышь, оснащенную колесиком. Кроме того, если большая часть или все трассировки будут выполняться вручную, использование стилуса для рисования контуров на компьютере с сенсорным экраном может значительно повысить эффективность трассировки.

1. Загрузите и установите Reconstruct (https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) для использования на компьютере под управлением Microsoft Windows в собственной или виртуальной среде.
2. Начните новую реконструкцию, создав новую папку для файлов реконструкции, нажав на Серия | New, и сохранение этой реконструкции (.ser файла) с нужным именем файла в папке, которая только что была создана.
3. Импортируйте сохраненный объем изображения .tiff в Reconstruct.
   1. Перейти к сериалам | Импорт | Изображения, нажмите кнопку Выбрать в окне Импорт изображений и найдите файл тома изображения. В окне «Импорт изображений » найдите файлы тома изображений, которые отображаются в виде отдельной строки для каждого изображения в томе.
   2. Важно: Введите правильный размер пикселя в текстовом поле «Размер в пикселях », чтобы он соответствовал размеру пикселя x/y (в мкм) объема изображения. Как только это будет сделано, нажмите кнопку «Импорт » в окне «Импорт изображений ».
      ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как изображения были импортированы, в середине окна " Реконструкция " должно быть изображение, а список "Импорт изображений " должен быть пустым.
   3. Если в середине окна « Реконструкция » есть изображение, а список «Импорт изображений » пуст, нажмите « Выйти » в окне «Импорт изображений ».
   4. Установите толщину сечения (т.е. высоту вокселя или z-размер), нажав на Сечение | Перечислите разделы, выделив все перечисленные разделы, затем нажмите на Изменить | Толщина в меню Список секций и введя толщину секции (в мкм) в текстовое поле (например, 0,005 для секции толщиной 5 нм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Помните, что при работе с сабстеком из большего объема исходного изображения, который включает только каждую n-ю секцию (см. шаг 3.3.3), необходимо учитывать эти "отсутствующие" секции в общей толщине секции. Например, если исходная объемная толщина секции изображения (она же высота вокселя) составляла 0,005 мкм, а сабстек включает только каждую третью секцию (например, 1-500-3), толщина секции этой сабстека равна 0,015 мкм (т. е. 0,005 мкм x 3 секции).
4. Сделайте следы интересующих объектов.
   1. Перейти к серии | Опции | Вкладка «Имена/Цвета», чтобы дать имя новому объекту. Выберите цвет контура и внутренней заливки следов объекта, а затем нажмите кнопку «ОК».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Reconstruct попытается соединить все трассы с одинаковыми именами как один объект. Обратитесь к руководству по реконструкции для соглашений об именовании трассировок (например, не включайте пробелы в имена). Цвета трасс предназначены только для визуализации трасс; цвет 3D-реконструкции этого объекта может быть легко изменен позже.
   2. На панели инструментов выберите инструмент «Рисование от руки », который выглядит как карандаш. Удерживая левую кнопку мыши, перетащите мышь, чтобы обвести мембрану объекта; Отпустите левую кнопку мыши, чтобы автоматически завершить трассировку. Нажмите Page Up / Page Down или используйте колесико мыши для перехода к следующему оптическому участку в объеме изображения и постепенно создавайте трассировки, пока структура не будет завершена.
5. Прослеживание синаптических шипиков
   Примечание: Встроенные шипики в пресинаптических бутонах выглядят как связанные с мембраной прозрачные структуры, иногда с актиноподобным электронно-непрозрачным материалом и/или мембраноподобными складками внутри них.
   1. Продвигайтесь по объему изображения и локализуйте место инвагинации шипикуса в пресинаптический бутон, тщательно дифференцируя шипики от эндоплазматических ретикул, вакуолей, эндосом, аутофагосом и других субклеточных органелл.
      Примечание: В отличие от мембраносвязанных органелл, убедитесь, что синаптические шипиковые отверстия всегда проецируются из нейрита/глии (т.е. вывернутой мембраны) и воспринимаются (т.е. инвертированной мембраной) пре- или постсинаптической структурой. Это визуальное свидетельство инвагинации позвоночника должно иметь место на ≥2 изображениях, а полностью инкапсулированный мембраносвязанный шиповидный столбик должен присутствовать в пре- или постсинаптической структуре на ≥1 изображении. Мелкие колючки могут быть покрыты клатрином. Чтобы дифференцировать события инвагинации позвоночника от эндоцитоза, покрытого клатрином, в пре- или постсинаптический нейрит, убедитесь, что для положительной идентификации покрытых клатрином шипиковых отложений требуется визуальное подтверждение совпадающей отклоняющейся мембраны от родительского объекта шиповидной оболочки, проецирующейся на инвертирующую мембрану пре- или постсинаптической структуры в пределах одного и того же изображения.
   2. Продвигайтесь по объему изображения, чтобы определить место проекции/происхождения позвоночника от его родительского нейрита/глии; обратитесь к рисункам 1 и 2 , чтобы помочь определить эти родительские структуры.
   3. Начните прослеживание позвоночника в месте выпячивания мембраны в принимающую структуру (например, пресинаптический бутон) и продолжайте втягивать позвоночник до тех пор, пока он не будет выглядеть как мембранно-связанная структура внутри инкапсулирующего пре- или постсинаптического неврита.
   4. Продолжайте удерживать левую кнопку мыши (или продолжайте рисовать вдоль оболочки шипика стилусом, если вы используете компьютер с сенсорным экраном), проводя по мембране шипика указателем мыши.
   5. Когда точка начала трассировки будет достигнута, отпустите левую кнопку мыши.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если отпустить левую кнопку мыши слишком рано, трассировка будет автоматически завершена, что часто приводит к нежелательным результатам. В этом случае просто нажмите клавишу «Удалить », пока эта трассировка будет выделена в списке трассировок.
   6. Повторите шаги 4.5.2-4.5.5 для каждого отдела, где появляется шип.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте проследить позвоночник как инкапсулированную мембранную структуру внутри бутона, когда это необходимо. Поскольку Reconstruct не позволяет автоматически вычитать инкапсулированные субклеточные структуры (например, шипиковые структуры, субклеточные органеллы) из объема инкапсулирующей структуры, это может быть выполнено постфактум (например, путем простого вычитания объема шишки из общего объема пресинаптического бутона).
6. Реконструкция объектов в 3D в Reconstruct
   1. Перейти к сериалам | Опции | 3D и убедитесь, что нажат переключатель Трассировки .
   2. Откройте список объектов, нажав кнопку Объекты | Вывод списка объектов.
   3. После того, как имена трассируемых объектов появятся в окне, дважды щелкните по имени объекта(ов) в списке объектов , чтобы просмотреть их в 3D. Подождите, пока не появится окно 3D сцены .
   4. Убедитесь, что начало, конец и количество трассировок в списке объектов для каждого объекта указаны правильно, чтобы значение Count = End - Start. Если для объекта выбран параметр Count ≠ End - Start, то одна или несколько трассировок от этого объекта могли быть по ошибке пропущены.
   5. Поворачивайте 3D-следы объекта(ов), удерживая левую кнопку мыши и перемещая мышь и/или удерживая правую кнопку мыши, перемещая мышь вперед и назад для увеличения и уменьшения. Убедитесь, что трассы объекта выровнены должным образом и что между каждой последующей трассировкой происходит плавный переход.
   6. При необходимости выполните повторную трассировку отдельных трасс, чтобы устранить ошибки, которые приводят к резким краям и/или переходам между трассами.
   7. Нанесите скин тетраэдральной сетки на объект, перейдя в раздел Серия | Объект | 3D и нажатием на переключатель поверхности Буассонна.
   8. В окне 3D сцены нажмите на Сцена | Очистите, затем дважды щелкните имя нужного объекта в списке объектов.
   9. Поворачивайте объекты, чтобы обеспечить плавные переходы между трассами, и при необходимости перерисовывайте трассы.
   10. Чтобы изменить цвета и прозрачность объекта, нажмите на имя объекта в списке объектов, а затем нажмите на Сцена | Цвет/прозрачность... в меню «Список объектов ». Дважды щелкните по имени объекта в Списке объектов , чтобы увидеть это изменение в окне 3D сцены .
       ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет, прозрачность и сглаживание объектов могут быть изменены с большей степенью контроля и специфичности с помощью Blender (см. 5.4-5.6).
7. Количественный анализ 3D объектов
   1. Перейти к сериалам | Опции | Вкладка «Списки» и нажмите на все нужные измерения в разделах «Список объектов » и «Список трассировок » этого окна.
   2. Экспортируйте измерения объекта, открыв список объектов (Object | Перечислите объекты...) и затем кликнув на Список | Сохраните.
   3. Сохраните измерения объекта, отображаемые в списке объектов , в виде файла с разделителями-запятыми (.csv).
   4. Импортируйте файл .csv в выбранное программное обеспечение для анализа данных. Чтобы импортировать в электронную таблицу (например, Microsoft Excel), просто дважды щелкните файл или откройте новую пустую книгу, нажмите « Файл | Импорт | CSV , и следуйте инструкциям.
   5. Чтобы измерить расстояния между объектами в 3D (например, измерить расстояние проекции синаптического шиповидного столбика в пресинаптический бутон), используйте функцию Z-trace в Reconstruct.
   6. Сначала присвойте трассировке новое имя, перейдя к разделу Серия | Опции | Вкладка «Имена/Цвета» и ввод имени для Z-трассировки.
   7. Затем нажмите на инструмент Z-trace на панели инструментов.
   8. Чтобы нарисовать Z-след проекционного расстояния синаптической шипиковой оболочки, щелкните по началу синаптической шипиковой оболочки, щелкнув левой кнопкой мыши, а затем нажимайте кнопки Page Up или Page Down для продвижения по объему изображения, одновременно нажимая на последовательные точки вдоль мембраны синаптической шипиковой оболочки в каждой секции.
   9. Завершите эту Z-трассировку, нажав на правую кнопку мыши.
   10. Экспортируйте измерения Z-trace, нажав на Trace | Список следов... , чтобы открыть список трассировки , а затем нажмите на Список | Сохраните , чтобы сохранить измерения списка трассировок в виде файла .csv.
8. Добавление масштабного куба
   1. Перейдите к одному из первых или последних изображений в стопке
   2. Перейти к серии | Опции | Вкладка Имена/Цвета и введите имя масштабного куба.
   3. На панели инструментов выберите инструмент «Нарисовать прямоугольник » и нарисуйте небольшой квадрат (размер не имеет значения), примыкающий к объектам, но не загораживающий их. Перейти к серии | Опции | Вкладка 3D, нажмите на опцию Коробка в области Создать и укажите размер масштабного куба (в μм), введя его размеры в поля A:, B:, C: в области Размер (например, введите 0,5 для A, B и C, чтобы создать куб размером 0,5 мкм/сторона).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед тем, как пытаться воссоздать масштабный куб в 3D, убедитесь, что желаемые 3D-объекты уже реконструированы в 3D-сцене с помощью опции "Трассы" или "Поверхность Буассонна". Не забудьте изменить опцию Создать обратно на поверхность Буассонна, а размеры A, B и C обратно на -1 после реконструкции масштабного куба (т.е. после шага 4.8.5).
   4. Откройте Список объектов и дважды кликните по названию масштабного куба; дождитесь появления масштабного куба в окне 3D-сцены .
   5. Чтобы переместить масштабный куб относительно других объектов, перейдите в раздел Серия | Опции | 3D и введите количество мкм , на которое необходимо переместить масштабный куб в поля X, Y и/или Z . Нажмите OK , чтобы закрыть окно, а затем дважды щелкните имя масштабного куба в списке объектов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, это можно сделать с помощью Blender (см. ниже).

5. Импорт, перекрашивание, сглаживание и добавление прозрачности к 3D-реконструкциям в Blender

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной помощи в использовании Blender, пожалуйста, обратитесь к руководству Blender и/или множеству видео с инструкциями по использованию каждой функции Blender (просто выполните поиск в Интернете по запросу Blender And Desired Function). Далее следует краткое руководство по перекрашиванию, сглаживанию и добавлению прозрачности в 3D-реконструкции.

1. Загрузите и установите последнюю версию Blender, бесплатного 3D-программного обеспечения с открытым исходным кодом (www.blender.org).
2. В разделе Реконструкция сохраните 3D-реконструкции, открыв нужные объекты в окне 3D-сцены и нажав кнопку Сцена | Экспортировать как | VRML 2.0.
3. В Blender перейдите в Файл | Импорт | X3D Расширяемый 3D (.x3d/.wrl). Нажмите на файл VRML 2.0, который был сохранен из Reconstruct, а затем нажмите кнопку Import X3D/VRML2.
4. Перекрасьте реконструкции.
   1. В окне «Коллекция сцен» в правом верхнем углу нажмите, чтобы снять флажок со значка глаза для объекта Cube по умолчанию, и нажмите на названия отдельных объектов, чтобы выделить каждый объект в сцене. Переименуйте эти объекты соответствующим образом.
   2. Нажмите на имя первого объекта, который нужно перекрасить, в окне «Коллекция сцен».
   3. Нажмите на круговой Контекст. Material в нижней части правой полосы значков, а затем нажмите кнопку Добавить материал. Список вариантов должен появиться ниже. Затем нажмите на полосу рядом с опцией «Базовый цвет » и выберите желаемую яркость и оттенок для объекта.
   4. Чтобы изменить металлический внешний вид, блеск и отражающие свойства объекта, отрегулируйте параметры «Металлический», «Блеск», «Шероховатость» и « Блеск » для получения желаемого эффекта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы определенные параметры появились в сцене (например, прозрачность, блеск), может потребоваться настройка Viewport Shading: Look Dev или Viewport Shading: Rendered . Чтобы перейти к любой из настроек видового экрана, наведите указатель мыши на значки глобуса в правом верхнем углу и нажмите на нужную настройку видового экрана.
   5. Чтобы изменить угол освещения, нажмите на объект «Свет» в окне «Коллекция сцен», нажмите на значок «Показать гизмо» в правом верхнем углу, а затем перетащите свет по сцене, чтобы добиться желаемого светового эффекта. Измените интенсивность света в окне «Данные об объекте», которое отображается под окном «Коллекция сцен» при выборе объекта «Свет».
   6. Чтобы поворачивать объекты по выбранным осям по отдельности, нажмите на имена объектов в окне «Коллекция сцен», нажмите клавишу R , затем нажмите на букву оси вращения (клавиши x, y или z ) и переместите мышь, чтобы произвести желаемое вращение. Чтобы захватывать и перемещать объекты, выберите их в окне «Коллекция сцен», нажмите клавишу G , а затем перемещайте объекты по сцене с помощью мыши.
5. Переделайте сетку (т.е. сгладьте) реконструкции.
   1. Щелкните по названию интересующего объекта в окне «Коллекция сцен», а затем используйте стабилизатор и колесико мыши для центрирования и увеличения объекта.
   2. Щелкните значок гаечного ключа Context.Modifiers на правой полосе значков, нажмите Add Modifier, а затем Remesh (под заголовком Generate). Используйте выпадающее меню, чтобы выбрать Сглаживание, нажмите на кнопку Плавное затенение и измените Глубину и Масштаб октодерева, чтобы добиться желаемой плавности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно находиться в окне Viewport Shading: Wireframe (опция значка глобуса в правом верхнем углу) во время изменения сетки, чтобы просмотреть результаты напрямую. При повторном создании сетки на объекте будут созданы тетраэдральные сетки разного размера. При сглаживании объекта для удаления артефактов секций или трассировки будьте осторожны, чтобы сохранить его исходную форму и контуры. Начните с Глубины окдерева = 7 и Масштаба = 0,95, а затем медленно уменьшайте эти числа, если это необходимо. Обратите особое внимание на маленькие, тонкие объекты, такие как колючки и постсинаптические плотности, так как малый объем этих объектов уменьшает диапазон сглаживания, которое можно сделать без изменения их первоначальной формы.
6. Добавьте прозрачность объектам.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сделать объекты прозрачными важно, когда желательно показать трехмерные отношения одного объекта (например, шиповидных мышей, пресинаптических везикул, митохондрий, эндосом), находящихся внутри другого объекта (например, пресинаптического бутона).
   1. Нажмите на имя нужного объекта в окне «Коллекция сцен ». Прокрутите страницу « Контекст» вниз. Окно материала (нижняя правая иконка в правом списке), откройте раздел Настройки и используйте выпадающее меню, чтобы изменить Режим наложения на Альфа-переход. Затем откройте раздел Поверхность , прокрутите вверх до Альфа и измените число на значение меньше единицы (1 = полностью непрозрачное, 0 = полностью прозрачное).
7. Экспорт снимков 3D-реконструкций.
   1. После того, как будут получены оптимальные цвета, сглаживание и освещение для 3D-реконструкций, сохраните изображение в сцене, щелкнув по заголовку меню «Окно» и выбрав «Сохранить скриншот».
   2. В параметрах «Сохранить скриншот» в левом нижнем углу выберите тип файла, формат цвета и желаемое сжатие.
   3. Введите имя нового снимка экрана в текстовое поле имени файла выше, а затем сохраните снимок экрана в нужном месте.

Results

Количественная оценка процентного соотношения синаптических шипиковых элементов в возбуждающей популяции пресинаптических бутонов в первичной зрительной коре хорька
Хотя шиповидные выступы из нейритов в возбуждающие пресинаптические бутоны наблюдались в течение десятилетий^19,26, их потенциальная важность для синаптической функции оставалась неясной. Эти эксперименты были разработаны для определения доли возбуждающих пресинаптических бутонов, с...

Discussion

Этот конвейер объемного анализа изображений FIB-SEM может производить надежные 3D-реконструкции и количественные измерения тонких субклеточных структур. В то время как современные полуавтоматические методы с использованием глубоких нейронных сетей и алгоритмов сегментации могут увеличить скорость и эффективность реконструкции клеточных структур, обладающих относительно высоким мембранным контрастом в больших объемах^{изображения33}, многие субклеточные структуры (нап...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Фиджи (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Реконструкция			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender	Blender Foundation		https:/www.blender.org