3D-реконструкция и анализ тонких субклеточных нейронных структур с использованием данных сканирующей электронной микроскопии с помощью пучка сфокусированных ионов

Summary

Гибкий методологический конвейер для идентификации, визуализации и количественного определения тонких субклеточных нейронных процессов в объемах изображений сфокусированного ионного пучка сканирующей электронной микроскопии с использованием удобных для пользователя пакетов программного обеспечения с открытым исходным кодом.

Abstract

Последние достижения в технологиях сканирующего электронного микроскопа теперь позволяют проводить быстрый трехмерный (3D) анализ ультратонких субклеточных процессов. Здесь представлен методологический конвейер для идентификации, визуализации и анализа тонких нейронных процессов, таких как те, которые проецируются в пресинаптические бутоны других нейронов (называемые «шиповыми»). Используя свободно доступные программные пакеты, этот протокол демонстрирует, как использовать дерево решений для идентификации общих нейронных субклеточных структур с использованием морфологических критериев в объемах изображений сфокусированной ионной пучковой сканирующей электронной микроскопии (FIB-SEM), уделяя особое внимание идентификации разнообразия шипиков, выступающих в пресинаптические бутоны. В частности, этот протокол описывает, как проследить спинулы в нейронных синапсах для создания трехмерных реконструкций этих тонких субклеточных проекций, их родительских нейритов и постсинаптических партнеров. Кроме того, протокол включает в себя список свободно доступных программ с открытым исходным кодом для анализа данных FIB-SEM и предлагает советы (например, сглаживание, освещение) по улучшению 3D-реконструкций для визуализации и публикации. Этот адаптируемый протокол предлагает отправную точку для быстрого наноразмерного анализа субклеточных структур в объемах изображений FIB-SEM.

Introduction

Исследования структурно-функциональных отношений субклеточных компонентов нанометрового толщина часто выигрывают от 3D-визуализации и анализа¹. Тем не менее, исследования просвечивающей электронной микроскопии серийных срезов были ограничены во времени и пространстве необходимостью использования алмазного ножа для резки и выравнивания сотен и тысяч серийных ультратонких срезов с длиной волны ≥40 нм. Эти ограничения ограничивают возможность отбора проб и эффективного анализа тонких (<40 нм в диаметре) субклеточных структур, а необходимость стать опытным специалистом в ультратонком серийном срезе затрудняет приме....

Protocol

1. Объем изображения и размер субклеточного объекта: соображения и регистрация

1. Получить качественное изображение объема изображения FIB-SEM области интереса, содержащей субклеточные объекты интереса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются сегменты объема изображения FIB-SEM из первичной зрительной коры хорька позднего подросткового возраста (24,2 x 16,2 x 2,4 мкм, изотропные воксели 4 нм), а также свободно доступный объем FIB-SEM из гиппокампа CA1 взрослой крысы (10,2 x 7,7 x 5,3 мкм; 5 нм изотропных вокселей), предоставленный лабораторией Нотта (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). Крайне важно подготовить....

Results

Количественная оценка процентного соотношения синаптических шипиковых элементов в возбуждающей популяции пресинаптических бутонов в первичной зрительной коре хорька
Хотя шиповидные выступы из нейритов в возбуждающие пресинаптические бутоны наблюдались в течение десятилетий^19,26, их потенциальная важность для синаптической функции оставалась неясной. Эти эксперименты были разработаны для определения доли возбуждающих пресинаптических бутонов, с.......

Discussion

Этот конвейер объемного анализа изображений FIB-SEM может производить надежные 3D-реконструкции и количественные измерения тонких субклеточных структур. В то время как современные полуавтоматические методы с использованием глубоких нейронных сетей и алгоритмов сегментации могут увеличить скорость и эффективность реконструкции клеточных структур, обладающих относительно высоким мембранным контрастом в больших объемах^{изображения33}, многие субклеточные структуры (нап.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Фиджи (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Реконструкция			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender	Blender Foundation		https:/www.blender.org