Method Article

Модифицированный простой метод индукции инфаркта миокарда у мышей

DOI:

10.3791/63042

⸱

December 3rd, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, 2Department of Cardiology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Под адекватной анестезией сердце мыши было экстернализовано через межреберное пространство, и инфаркт миокарда был успешно индуцирован путем перевязки левой передней нисходящей артерии (LAD) с использованием материалов, легко доступных в большинстве лабораторий.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инфаркт миокарда (ИМ) является одной из ведущих причин смерти. Модели инфаркта миокарда широко используются для изучения патомеханизмов постинфаркта миокарда и оценки новых терапевтических средств. Для индуцирования инфаркта миокарда использовались различные методы (например, лечение изопротеренолом, криотравма, перевязка коронарных артерий и т. д.). По сравнению с лечением изопротеренолом и криотравмой, перевязка коронарных артерий может лучше отражать ишемический ответ и хроническое ремоделирование после ИМ. Однако традиционные методы перевязки коронарных артерий у мышей технически сложны. В настоящем исследовании описывается простой и эффективный процесс индукции инфаркта миокарда у мышей с помощью легкодоступных материалов. Кожа грудной клетки мыши была вскрыта под стабильным наркозом. Сердце было немедленно экстернализовано через межреберье после тупого разделения большой и малой грудных мышц. Левая передняя нисходящая ветвь (LAD) была перевязана швом 6-0 в 3 мм от ее источника. После перевязки LAD окрашивание 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом (ТТС) указывало на успешную индукцию инфаркта миокарда и временные изменения размера рубцов после ИМ. Между тем, результаты анализа выживаемости показали явную смертность в течение 7 дней после инфаркта миокарда, в основном из-за разрыва сердца. Кроме того, эхокардиографическая оценка после инфаркта миокарда продемонстрировала успешную индукцию сократительной дисфункции и ремоделирования желудочков. После освоения модель ИМ может быть установлена на мышах в течение 2-3 минут с помощью легкодоступных материалов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инфаркт миокарда (ИМ) является одной из основных причин смерти и инвалидности во всем мире 1,2,3,4,5. Несмотря на своевременную реперфузию, в настоящее время не существует эффективных методов лечения ремоделирования сердца после инфаркта миокарда. Соответственно, были предприняты значительные усилия по механистическому исследованию и терапевтической эксплуатации ИМ 6,7,8. Следует отметить, что создание моделей ИМ является необходимым условием для достижения этих целей.

Предложено несколько методов (например, лечение изопротеренолом, криотравма, перевязка коронарных артерий и т.д.) для индуцирования моделей инфаркта миокарда у мелких животных. Лечение изопротеренолом является простым методом индукции инфаркта миокарда, но оно не может индуцировать инфаркт целевой области9. Криоповреждение приводит к некрозу миокарда за счет образования кристаллов льда и разрушения клеточной мембраны, а не к прямой ишемии10. В отличие от этого, перевязка коронарных артерий позволяет точно контролировать место окклюзии и протяженность области инфаркта и точно повторяет реакцию ремоделирования после инфаркта11,12. Перевязка коронарных артерий обычно выполняется после интубации, искусственной вентиляции легких и торакотомии, что технически сложно13,14. Сообщалось о нескольких модифицированных протоколах перевязки коронарных артерий (например, без вентиляции), которые потенцировали индукцию инфаркта миокарда, но подробные визуальные демонстрации отсутствуют15,16,17. Эти проблемы создают значительный финансовый и технический барьер для групп, желающих заниматься исследованиями с использованием моделей ИМ. В данном докладе представлен подход к индукции инфаркта миокарда у мышей. Нынешний метод прост, экономит время и использует хирургические инструменты и оборудование, которые можно найти в большинстве лабораторий.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперименты, связанные с работой с животными, проводятся со всеми необходимыми разрешениями Комитета по этике благополучия лабораторных животных больницы Жэньцзи, Шанхайского университета Цзяотун, Школа медицины (R52021-0506). В исследовании использовались самки и самцы мышей C57BL/6J в возрасте от 8 до 10 недель.

1. Подготовка упрощенного анестезиологического оборудования (ОПЦИОНАЛЬНО)

ПРИМЕЧАНИЕ: Это дополнительная предоперационная установка, которая может быть заменена титруемой анестезией, как указано в разделе 2. Следует проконсультироваться с институциональным комитетом по этике животных и ветеринаром (ветеринарами), прежде чем адаптировать эту систему в процедурах для животных.

  1. Возьмите центрифужную пробирку объемом 15 мл и сделайте надрез перпендикулярно длинной оси пробирки примерно в 3 см от отверстия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что разрез превышает половину окружности просвета трубки, чтобы клапан можно было успешно вставить.
  2. Просверлите отверстия (диаметр 2 мм) на стенке трубки центрифуги между разрезом и отверстием трубы.
  3. Отрежьте подходящий по размеру кусок клапана из пластикового листа и вставьте клапан в вырез на стенке трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клапан можно использовать для контроля скорости высвобождения изофлурана путем изменения глубины введения.
  4. Внутри вытяжного шкафа разрежьте нижнюю часть трубки и подключите ее к подаче кислорода. Поместите ватный тампон к нижнему концу пробирки, добавьте на ватный тампон 0,5 мл изофлурана (как получено, см. Таблицу материалов) и закройте клапан.
  5. Проверьте эффективность анестезии, замаскировав мышей трубками, приготовленными, как описано выше. Контролируйте частоту дыхания и глубину анестезии по реакции на щипки пальцев ног.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Частота дыхания менее 10 раз/10 с указывает на чрезмерную анестезию, и глубина введения клапана должна быть отрегулирована. Для всех процедур, связанных с анестезией, необходимо использовать газовый фильтр, заполненный листами активированного угля (рис. 1A-i), а операцию следует проводить в капюшоне.

2. Оперативная подготовка и анестезия

  1. Подготовьте и простерилизуйте все необходимые инструменты в день операции, включая пару щипцов, микро-москитный гемостат, пару хирургических ножниц, две пары иглодержателей, шелковый хирургический шовный материал 4-0, шелковый хирургический шовный материал 6-0, газовый фильтр и источник света (см. Таблицу материалов) (Рисунок 1A).
  2. Наденьте хирургическую маску и стерильные перчатки.
  3. Нанесите крем для депиляции на грудь мыши и подождите 1 минуту. Аккуратно сотрите крем для депиляции и волосы влажной марлей.
  4. Удерживайте мышь доминирующей рукой после депиляции. Индуцируют анестезию путем вдыхания парообразного изофлурана (4%) с подачей кислорода (1 л/мин) и поддерживают 2-3% изофлурана.
  5. Подтвердите адекватную анестезию отсутствием реакции на щипок пальца ноги.
  6. Нанесите стерильный крем для глаз на оба глаза, чтобы предотвратить сухость роговицы.
  7. Закрепите мышей на операционной платформе в положении лежа на спине. Трижды приложите к груди тампоны с повидон-йодом (см. таблицу материалов) и накройте продезинфицированную грудную клетку стерильной простыней.

3. Индукция инфаркта миокарда

  1. Смените загрязненные перчатки, чтобы обеспечить стерильность.
  2. Сделайте разрез кожи 0,5 см по линии, соединяющей мечевидную мышцу и подмышечную впадину, после локальной блокады лидокаином.
  3. Тупо разделите большую грудную и малую грудные мышцы с помощью щипцов и микро-москитного гемостата, чтобы обнажить четвертое межреберье.
  4. Откройте четвертое межреберье с помощью микро-москитного гемостата.
  5. Экстернализуйте сердце, подталкивая сердце к четвертому межреберью указательным пальцем левой руки.
  6. Левой рукой закрепите сердце, а левую переднюю нисходящую ветвь наложите шов 6-0 на расстоянии 3 мм от его начала.
  7. Быстро поместите сердце обратно в грудную полость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно безопасно экстернализировать сердце менее чем на 30 секунд.
  8. Откачайте воздух из грудной полости легким нажатием на грудную полость вручную.
  9. Закройте мышечный слой над ребрами шелковым швом 6-0.
  10. Закройте кожу шелковым швом 4-0.
  11. Положите мышей на подушечку (37 °C) сразу после операции.
  12. Вводите бупренорфин (0,05-0,1 мг/кг) подкожно каждые 4-6 часов, чтобы уменьшить послеоперационную боль на срок до 72 часов.
  13. Верните прооперированных мышей в клетки после полного выздоровления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши полностью выздоровеют в течение 3-5 минут после операции.
  14. Внимательно следите за мышами и обеспечьте влажный корм на срок до 7 дней.

4. Заготовка тканей

  1. Приносили в жертву мышей в разные моменты времени после установления ИМ при вывихе шейки матки.
  2. Закрепите принесенных в жертву мышей на операционной платформе в положении лежа на спине.
  3. Сделайте вентральный разрез (~3-4 см) в верхней части живота. Отрежьте ребра с обеих сторон грудной полости, и удалите диафрагму.
  4. Перфузии сердца 10 мл холодного фосфатно-буферного физиологического раствора (1x PBS, 4 °C) путем внутрижелудочковой инъекции.
  5. Соберите сердце, отрезав корень аорты, и сразу же храните сердце при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По опыту авторов, окрашивание ТТС можно проводить в течение двух недель после хранения.
  6. Окрасьте сердце 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом (ТТС).
    1. Замороженное сердце нарезать на льду ломтиками толщиной 1 мм с помощью бритвенных лезвий.
    2. Подготовленные сердечные срезы инкубируют в 1% растворе ТТС (растворенном в 1х ПБС) при 37 °С в течение 10-15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После 15-минутной инкубации выбросьте раствор TTC и погрузите окрашенные ломтики сердца в 1x PBS.
  7. Сфотографируйте срезы с помощью цифровой камеры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол эксперимента и некоторые критические этапы показаны на рисунке 1. Упрощенное анестезиологическое оборудование индуцировано анестезией. Как показано на рисунке 2А, индуцированная анестезия была стабильной, что отражалось в регулярной частоте дыхания (варьировалась от 90 до 107 вдохов/мин у испытуемых мышей). После перевязки коронарных артерий анализ окрашивания ТТС показал успешную индукцию инфаркта миокарда и временные изменения размера рубца после инфа...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем отчете был продемонстрирован простой протокол индукции инфаркта миокарда у мышей с легкодоступными материалами, который был модифицирован по сравнению с методом, описанным в Gao16. Мышиные модели инфаркта миокарда незаменимы для механистического исследования и скрининга лекарственных препаратов на постинфарктную дисфункцию и ремоделирование12. Среди существующих методов индукции инфаркта миокарда наиболее часто практикуется перевязка коронарных артерий. Перевязк...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (81930007, 81625002, 81800307, 81470389, 81500221, 81770238), Шанхайской программы выдающихся академических лидеров (18XD1402400), Комиссии по науке и технологиям муниципалитета Шанхая (201409005200), Шанхайской программы талантов Пуцзяна (2020PJD030) и Китайского фонда постдокторантуры (2020M671161, BX20190216).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,3,5-трифенилтетразолия хлоридSIGMAT8877-25GTTC окрашивание
4-0 шелковый шовYUANKANG4-0Хирургический инструмент
автоклавHIRAYAMAHVE-50Стерилизация твердого
бупренорфинаQinghai Pharmaceutical FACTORY Co., Ltd.H10940181уменьшения послеоперационной боли
Центрифужная трубкаBiological Hope1850-K15ML
Крем для депиляцииZIKER BIOTECHNOLOGYZK-L2701Средство для депиляции лабораторных животных
ЩипцыRWDF12028Хирургический инструмент
Газовый фильтрZHAOXINSA-493Защита оператора
ИзофлуранRWD20071302Используется для анестезии
Источник светаBeijing PDVLG-150BОперационная лампа
Микро-москитный гемостатFST13011-12Хирургический инструмент
ИглаBINXIONG42180104Хирургический инструмент
Игла и шелковый шов 6-0JIAHESC086Хирургический инструмент
ИглодержательShangHaiJZJ32030Хирургический инструмент
ИглодержательShangHaiJZJ32010Хирургический инструмент
Повидон-йодные тампоныSingleLadyGB26368-2010Ножницы для дезинфекции кожи
CNSTRONGJYJ1030Хирургический инструмент
Стерильный крем для глазShenyang Xingqi Pharmaceutical Co., Ltd.H10940177предотвращения сухости роговицы
Ультразвуковая система ультразвуковой визуализации сверхвысокого разрешения для мелких животныхVisualSonicsVevo 2100Эхокардиографический анализ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y., et al. A simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice. Journal of Visualized Experiments. (134), e57074(2018).
  2. Pell, S., Fayerweather, W. E. Trends in the incidence of myocardial infarction and in associated mortality and morbidity in a large employed population. The New England Journal of Medicine. 312 (16), 1005-1011 (1985).
  3. Ramunddal, T., Gizurarson, S., Lorentzon, M., Omerovic, E. Antiarrhythmic effects of growth hormone--in vivo evidence from small-animal models of acute myocardial infarction and invasive electrophysiology. Journal of Electrocardiology. 41 (2), 144-151 (2008).
  4. Tabrizchi, R. β-blocker therapy after acute myocardial infarction. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 11 (3), 293-296 (2013).
  5. Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139(2020).
  6. Cahill, T. J., Choudhury, R. P., Riley, P. R. Heart regeneration and repair after myocardial infarction: Translational opportunities for novel therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 699-717 (2017).
  7. Froese, N., et al. Anti-androgenic therapy with finasteride improves cardiac function, attenuates remodeling and reverts pathologic gene-expression after myocardial infarction in mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 122, 114-124 (2018).
  8. Wang, W., et al. Defective branched chain amino acid catabolism contributes to cardiac dysfunction and remodeling following myocardial infarction. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (5), 1160-1169 (2016).
  9. Acikel, M., et al. Protective effects of dantrolene against myocardial injury induced by isoproterenol in rats: Biochemical and histological findings. International Journal of Cardiology. 98 (3), 389-394 (2005).
  10. vanden Bos, E. J., Mees, B. M. E., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: A comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
  11. Guo, Y., et al. Demonstration of an early and a late phase of ischemic preconditioning in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 275 (4), 1375-1387 (1998).
  12. Kumar, M., et al. Animal models of myocardial infarction: Mainstay in clinical translation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 76, 221-230 (2016).
  13. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
  14. Johns, T. N., Olson, B. J. Experimental myocardial infarction. I. A method of coronary occlusion in small animals. Annals of Surgery. 140 (5), 675-682 (1954).
  15. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
  16. Gao, E., Koch, W. J. A novel and efficient model of coronary artery ligation in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1037, 299-311 (2013).
  17. Most, P., et al. Cardiac S100A1 protein levels determine contractile performance and propensity toward heart failure after myocardial infarction. Circulation. 114 (12), 1258-1268 (2006).
  18. Christia, P., et al. Systematic characterization of myocardial inflammation, repair, and remodeling in a mouse model of reperfused myocardial infarction. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 61 (8), 555-570 (2013).
  19. Frantz, S., Bauersachs, J., Ertl, G. Post-infarct remodelling: Contribution of wound healing and inflammation. Cardiovascular Research. 81 (3), 474-481 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Myocardial InfarctionCoronary Artery LigationMouse MI ModelVentricular RemodelingTTC StainingPost MI RemodelingContractile DysfunctionEchocardiographic AssessmentCardiac RuptureIntramyocardial Injection

Related Articles