Алгоритм анализа изображений на основе зон для количественной оценки кокультур макрофаг-фибробластов

Summary

Мы представляем метод, который использует обобщающий подход к анализу изображений на основе площади для определения количества клеток. Анализ различных клеточных популяций использовал значительные различия в высоте и структуре клеток между различными типами клеток в рамках адаптивного алгоритма.

Abstract

Количественная оценка клеток необходима для широкого спектра биологических и биохимических исследований. Обычный анализ изображений клеток обычно использует либо подходы к обнаружению флуоресценции, такие как иммунофлуоресцентное окрашивание или трансфекция флуоресцентными белками или методы обнаружения краев, которые часто подвержены ошибкам из-за шума и других неидеальностей на фоне изображения.

Мы разработали новый алгоритм, который может точно подсчитывать и различать макрофаги и фибробласты, клетки разных фенотипов, которые часто колокализуются во время регенерации тканей. MATLAB был использован для реализации алгоритма, который дифференцировал различные типы клеток на основе различий в высоте от фона. Первичный алгоритм был разработан с использованием зонально-ориентированного метода для учета изменений в размере/структуре клеток и условиях посева с высокой плотностью.

Неидеальности в клеточных структурах были учтены с помощью вторичного, итеративного алгоритма, использующего внутренние параметры, такие как покрытие клеток, рассчитанное с использованием экспериментальных данных для данного типа клеток. Наконец, анализ сред кокультуры проводили с использованием алгоритма изоляции, в котором выборочно исключались различные типы клеток на основе оценки относительных перепадов высот внутри изображения. Было обнаружено, что этот подход точно подсчитывает клетки в пределах 5% погрешности для монокультурных клеток и в пределах 10% погрешности для кокутивируемых клеток.

Introduction

Программное обеспечение регулярно внедряется во время методов анализа изображений, чтобы гарантировать, что результаты являются точными, эффективными и непредвзятыми. Для клеточных анализов общей проблемой является неправильная идентификация клеток. Изображения с неправильными фокальными и контрастными настройками могут привести к размытию клеток, при котором границу отдельных клеток становится трудно идентифицировать¹. Наличие посторонних признаков изображения, таких как поры, пузырьки или другие нежелательные объекты, может затруднить процедуры подсчета, замедляя процесс подсчета и приводя к неправильной идентификации. Кроме того, подсчет кле....

Protocol

1. Клеточная культура и получение изображений

1. Культивируйте макрофаги RAW264.7 при 37 °C и 5% CO₂ в модифицированной орлиной среде (DMEM) Dulbecco с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина-стрептомицина, 1,5 г / л бикарбоната натрия и 5 мкМ β-меркаптоэтанола.
   1. Для монокультурной визуализации культивируют клетки RAW264.7 с плотностью 25 000 клеток/^см2 в колбе клеточной культуры объемом 5 мл с 1 мл среды.
2. Культивирование клеток NIH/3T3 при 37 °C и 5% CO₂ в DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина¹¹

Results

Анализ нелюбковых макрофагов RAW264.7 проводили в монокультурных условиях при 25 000 клеток/^см2. Репрезентативные изображения клеточной культуры были взяты и обработаны в MATLAB после преобразования в 8-битный tiff в ImageJ. Выходные данные алгоритма на протяжении всего процесса были записаны и задокументированы на рисунке 2 для репрезентативного изображения. На этом изображении алгоритм насчитал 226 ячеек, и это количество изображений было проверено путем сравнения с ручным подсч.......

Discussion

Мы разработали общую зональную процедуру, которая точно и эффективно подсчитывала клетки на основе высоты клеток, что позволяло проводить количественное определение клеток без окрашивания даже в системах кокультуры. Критические шаги для этой процедуры включали реализацию системы относительной интенсивности, с помощью которой клетки могли быть дифференцированы. Использование анализа относительной высоты служило двум целям: необходимость во внешних параметрах была сделана ненужной, поскольку относительные параметры были по.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer 7 Инвертированный микроскоп	Zeiss	1028290770
&бета;-меркаптоэтанол	Life Technologies	21985023
скребки для клеток	CellTreat	229310
Модифицированный Eagle от Dublecco Medium	Fisher Scientific	12430047
PBS от Dublecco	Fisher Scientific	14190144
Программное обеспечение MATLAB	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Cells	ATCC	ATCC CRL - 1658
Пенициллин– Стрептомицин	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Клетки	ATCC	ATCC TIB - 71
Бикарбонат натрия	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Колба для клеточной культуры	Corning	CLS3814-24EA