Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Безметочная модель ксенотрансплантата для исследования поведения сфероидов стволовых клеток человека в эмбрионах цыплят

1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63067

⸱

15 октября 2021 г.

 , 
1Morphological Sciences Program, Biomedical Sciences Institute, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье мы описываем метод трансплантации и идентификации сфероидов из клеток человека в эмбрионы цыплят. Эта модель ксенотрансплантата использует эмбриональное микроокружение в качестве источника инструктивных сигналов для анализа миграции, дифференцировки и тропизма клеток и особенно подходит для изучения первичных и/или гетерогенных клеточных популяций.

Аннотация

Ксенотрансплантаты являются ценным методом исследования поведения клеток человека in vivo. В частности, эмбриональная среда дает сигналы для миграции клеток, дифференцировки и морфогенеза, с уникальными поучительными сигналами и идентичностью зародышевого слоя, которые часто отсутствуют в моделях взрослых ксенотрансплантатов. Кроме того, эмбриональные модели не могут различать собственные и чужие ткани, устраняя риск отторжения трансплантата и необходимость иммунного подавления хозяина. В данной работе представлена методика трансплантации сфероидов клеток человека в куриные эмбрионы, которые доступны, поддаются манипуляциям и развиваются при 37 °С.

Сфероиды позволяют выбрать определенную область эмбриона для трансплантации. После пересадки клетки интегрируются в ткань хозяина, что позволяет отслеживать их миграцию, рост и дифференцировку. Эта модель достаточно гибкая, чтобы позволить использовать различные адгезивные популяции, включая гетерогенные первичные клеточные популяции и раковые клетки. Чтобы обойти необходимость предварительного мечения клеток, также описан протокол идентификации донорских клеток путем гибридизации специфических для человека зондов Alu , что особенно важно при исследовании гетерогенных клеточных популяций. Кроме того, зонды ДНК могут быть легко адаптированы для идентификации других видов доноров. В этом протоколе будут описаны общие методы получения сфероидов, прививки куриным эмбрионам, фиксации и обработки тканей для парафинового среза и, наконец, идентификации клеток человека с помощью гибридизации ДНК in situ . В дополнение к ограничениям этого метода будут обсуждаться предлагаемые элементы управления, примеры интерпретации результатов и различные типы поведения клеток, которые могут быть проанализированы.

Введение

Ксенотрансплантаты являются полезными инструментами для исследования поведения клеток человека in vivo. Эти модели предоставили бесценную информацию для широкого круга научных тем, таких как биология стволовых клеток человека1, наблюдение за клеточными событиями вреальном времени 2 и исследование ангиогенеза и метастазирования опухолей3. Кроме того, были изучены некоторые аспекты биологии рака, в том числе онкогенез ксенотрансплантатов, специфичных для пациента 4,5. Каждая из этих моделей ксенотрансплантатов имеет свои преимущества и недостатки, и, таким образом, каждая из них лучше подходит для конкретных научных вопросов. Куриные эмбрионы являются популярной моделью биологии развития, поскольку они представляют собой доступную модель амниоты, которая поддается хирургическим манипуляциям. Гетерологичные трансплантаты позволили исследователям создать точные карты судьбы6 или изучить, является ли признак клеточной автономией или управляется окружающей средой 7,8. Аналогичное обоснование позволяет использовать куриный эмбрион в качестве модели ксенотрансплантата для изучения поведения клеток человека.

Эмбриональная среда активно управляет морфогенезом тканей с помощью сигналов миграции и дифференцировки, а также межклеточных взаимодействий. Таким образом, по сравнению с моделями взрослого ксенотрансплантата, эмбрион обеспечивает более информативную среду для анализа поведения трансплантированных клеток, например, имитируя сигналы, присутствующие в нишах взрослых стволовых клеток (например, BMPs, WNTs, NOTCH и SHH9). Кроме того, отсутствие адаптивной иммунной системы на ранних стадиях развития позволяет проводить ксенотрансплантаты без риска иммунного ответа или отторжения донорской ткани10. В предыдущих исследованиях изучались ксенотрансплантаты человеческих клеток в куриные эмбрионы с этой целью. Нейрогенный потенциал стволовых клеток человека был оценен после инъекции в нервную трубку или кровеносные сосуды11 в дополнение к интеграции эмбриональных стволовых клеток12 и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток13 в эмбрион. Клетки меланомы человека также были изучены с использованием эмбриональной среды цыпленка, что выявило связь между их опухолегенезом и поведением клеток нервного гребня14, а также перепрограммированием опухолевых клеток с помощью информации от эмбриона15. В данной статье описывается протокол, который особенно подходит для изучения поведения первичных и гетерогенных клеточных популяций человека.

В последние десятилетия стромальный компонент различных тканей изучался в качестве аутологичного источника клеток-предшественников/стволовых клеток, а также в силу его проангиогенных и иммунорегуляторных свойств, ранее известных как «мезенхимальные стволовые клетки»16,17,18. Первой из этих клеточных популяций, которую нужно было охарактеризовать, была популяция стромальных/стволовых клеток костного мозга (BMSC), обладающих остео-, жировым и, в меньшей степени, хондрогенным потенциалом in vivo19,20. Стромальные клетки, полученные из жировой ткани (ADSC), представляют собой гетерогенную популяцию, полученную путем ферментативного расщепления образцов липоаспирата или дермолипектомии с последующим выделением стромально-васкулярной фракции (SVF) и, наконец, расширением в культуре21. В культуре эти клетки фенотипически характеризуются маркерами, общими с другими мезенхимальными популяциями, такими как CD90, CD73, CD105 и CD44, уникальными маркерами, такими как CD36, и отсутствием гемопоэтических (CD45) или эндотелиальных (CD31) маркеров22. Кроме того, ADSC обладают остео-, адипо- и хондрогенным потенциалом in vitro, а количество стволовых/прогениторных клеток в этой популяции может быть определено с помощью анализа фибробластоидной колониеобразующей единицы (КОЕ-F)22. Сообщалось, что in vivo клетки с фенотипом ADSC существуют в стромальном23 и/или периваскулярном24 компартментах. Становится все более очевидным, что, несмотря на общие маркеры после культивирования in vitro, стромальный компартмент различных тканей отражает внутренние характеристики данного органа, и эти клеточные популяции имеют различные свойства в зависимости от их источника 17,25,26,27. Кроме того, поскольку эти клетки выделяют на основе их адгезии к чашке для клеточной культуры, они могут состоять из клеток из различных зародышевых слоев28. Таким образом, использование метода ксенотрансплантата для изучения потенциала дифференцировки и тропизма стромальных клеток непредвзятым образом может предоставить ценную информацию об этих клеточных популяциях, которая будет направлять разработку будущих клеточных терапий.

Описанный здесь протокол (Рисунок 1) представляет собой метод ксенотрансплантата, который использует преимущества низкой стоимости и простоты манипуляций с эмбрионами цыплят. Ранее он использовался для изучения поведения ADSC29 человека, фибробластов кожи29, стромальных клеток менструальной крови30 и клеток глиобластомы31. Этот метод будет включать в себя трансплантацию клеток в виде сфероидов32, которые могут быть получены из любой популяции адгезивных клеток (рисунок 2). Также будут описаны хирургические процедуры и подготовка специальных хирургических материалов – микроскальпелей и стеклянных капилляров (Рисунок 3). Человеческие клетки обнаруживаются в гистологических срезах путем гибридизации специфичных для человека зондов Alu (рис. 4), что устраняет необходимость в предварительной маркировке трансплантированных клеток. Репрезентативные результаты описывают поведение ADSC человека, привитого как в сомитной области на уровне зачатка крыла (рис. 5, рис. 6 и рис. 7), так и первой глоточной дуги (рис. 8), а также первичных сфероидов глиобластомы человека, привитых в прозенцефалоне (рис. 8). Будет описана миграция клеток, дифференцировка и взаимодействие с эмбриональными тканями цыплят, а также предложены анализы для дальнейшего изучения клеточного поведения с использованием совместного окрашивания или окрашивания смежных участков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры in vivo , использованные в этом исследовании, соответствовали всем соответствующим экспериментальным рекомендациям по испытаниям и исследованиям на животных в соответствии с бразильскими рекомендациями по использованию экспериментальных животных (L11794). Все протоколы, используемые для работы с куриными эмбрионами, были одобрены Комитетом по этике использования животных в научных экспериментах (Центр медицинских наук Федерального университета Рио-де-Жанейро). Использование человеческих клеток было одобрено Этическим комитетом университетской клиники Клементино Фрага Фильо (номера 043/09 и 088/04). Использовали специфические безпатогенные (SPF) яйца белой леггорнской курицы (Gallus gallus).

1. Получение клеточных сфероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные сфероиды могут быть получены с использованием широкого спектра типов клеток, если они адгезивы. Для этого протокола были выделены стромальные клетки (ADSC), полученные из жировой ткани человека, как описано ранее. Клетки получали путем расщепления фрагментов жировой ткани или липоаспиратов коллагеназой IA в течение 1 ч при 37 °С при перемешивании с последующим осаждением при 1−2 × 104 кл/см2 и ночной инкубацией. Неадгезивные клетки отбрасывали, а адгезивные клетки расширяли на 3-6 пассажей. ADSC были однородны по экспрессии поверхностных антигенов CD105, CD90, CD13 и CD44 и отрицательны по гемопоэтическим антигенам CD45, CD14, CD34, CD3 и CD1927. В то время как описанный здесь метод может быть легко выполнен с минимальным количеством материалов, чем то, что обычно используется для культивирования клеток, оптимальное время агрегации и необходимость частичной диссоциации должны быть определены эмпирически. Могут быть использованы альтернативные способы получения клеточных сфероидов, такие как метод33 с подвесными каплями или лунки34 с агарозным покрытием; Подробнее см. в обсуждении. Все процедуры должны выполняться на чистом стенде с использованием асептических методов.

  1. Перед манипуляцией с клетками прогрейте стерильный PBS (фосфатно-солевой буфер), питательную среду и раствор трипсина до 37 °C.
  2. Культивирование ADSCs в DMEM с низким содержанием глюкозы с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Используйте совпадающую колбу 25 см2 АДСК для приготовления двух пластин сфероидов. Выбросьте питательную среду и трижды промойте чашку для культивирования соответствующим количеством стерильного PBS (5 мл PBS на каждое мытье, если используется колба для клеточных культур размером 25см2 ).
  3. Добавьте достаточное количество раствора трипсина (содержащего 0,78 мМ ЭДТА), чтобы покрыть клетки (1 мл раствора трипсина, если используется колба для клеточных культур размером 25см2 ) и оставьте колбу для культуры на 5 минут при комнатной температуре.
  4. Аккуратно пипетируйте клетки вверх и вниз, чтобы диссоциировать их. Добавьте такое же количество питательной среды, содержащей FBS, чтобы инактивировать трипсин, и перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл.
  5. Центрифуга в течение 10 мин при 180 × г. Выбросьте надосадочную жидкость и постучите по трубке, чтобы ослабить гранулу.
  6. Ресуспендируйте клетки в 500 мкл-2 мл питательной среды, соответствующей типу клеток (см. шаг 1.2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальная концентрация составляет 5 × 105 клеток/мл для адгезивных клеток, таких как ADSC и фибробласты. Совпадающую колбу 25 см2 с ADSC следует ресуспендировать в 2 мл среды и залить в 2 чашки Петри, используя по 1 мл каждая. Менее адгезивные клетки, такие как глия, могут выиграть от осаждения при концентрации ~2 × 106 клеток/мл в меньшем объеме.
  7. Осторожно перенесите клеточную суспензию на одну сторону стерильной чашки Петри диаметром 60 мм (без покрытия и без обработки, например, те, которые используются для приготовления агаровых пластин). Постарайтесь ограничить питательную среду до минимально возможной площади (рисунок 1B), подперев чашку на кусок сложенной чистой марли, чтобы она оставалась под наклоном в инкубаторе.
  8. Инкубируйте клеточную суспензию при 37 °C, 5%CO2, до образования клеточных агрегатов (через 6-8 ч после нанесения ADSC).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время агрегации сфероидов может варьироваться в зависимости от типа клетки.
  9. При необходимости (см. обсуждение) частично диссоциируйте крупные клеточные агрегаты путем осторожного пипетирования вверх и вниз с помощью наконечников объемом 1000 мкл. Диссоциацию сфероидов ADSC через 6-8 ч после нанесения покрытия.
  10. Поместите планшет в инкубатор до тех пор, пока сфероиды не будут готовы к пересадке: круглые с четкими краями и не легко рассеивающиеся (рис. 1C,D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сфероиды ADSC готовы через 2 дня после частичной диссоциации.

2. Трансплантация сфероидов в эмбрионы цыплят

  1. Подготовка
    1. Подготовить куриные яйца путем инкубации 15-30 яиц во влажном инкубаторе при температуре 37,5 °C до достижения желаемой стадии по шкале Гамбургера-Гамильтона (HH)35: 40-45 ч для прививок в сомитах на уровне почек конечностей (HH11-12 или 13-19 сомитов) или 29-33 ч для прививок в области головы (HH8-9 или 5-8 сомитов). Расположите яйца горизонтально и нарисуйте линию карандашом на верхней части яиц перед инкубацией (Рисунок 3D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может незначительно варьироваться в зависимости от конкретного инкубатора. Проведение линии гарантирует, что верхняя часть яйца, где находится эмбрион, будет легко идентифицирована, если повернуть яйцо перед экспериментом.
    2. Подготовьте острые иглы («микроскальпели»), прикрепив швейную иглу к металлическому иглодержателю (рисунок 3Б). Используя смазанный маслом точильный камень, заточите иглу так, чтобы она стала похожа на маленький скальпель с тонким краем (рисунок 3C). В качестве альтернативы можно подготовить острую вольфрамовую иглу методом электролиза36.
    3. Подготовьте стеклянные капилляры с помощью пламени горелки Бунзена, чтобы кратковременно расплавить тонкую часть стеклянной пипетки Пастера. Снимите расплавленную часть с пламени и растяните ее, чтобы образовался тонкий капилляр. Аккуратно разделите капилляр на две части, разбив его микрощипцами. Подготовьте тонкий капилляр для инъекции индийских чернил и толстый капилляр для переноса сфероидов (рис. 3B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изменяя силу натяжения, можно создавать различные капиллярные датчики. Капилляры должны быть подготовлены непосредственно перед операцией.
    4. Подготовьте рабочую поверхность и другие материалы для манипуляций с яйцом (рисунок 3А). Стерилизуйте все хирургические материалы в духовке при температуре 100 °C в течение ночи или с использованием 70% этанола непосредственно перед использованием. Нагрейте стерильный PBS до 37 °C. Прикрепите наконечник объемом 200 мкл (с барьером) к узлу трубки аспиратора для впрыска индийских чернил и переноса сфероидов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наконечники с барьерами при переносе сфероидов клеток человека.
    5. Непосредственно перед экспериментом добавьте 2 капли исходного раствора индийских чернил в чашку Петри диаметром 30 мм и смешайте его с 1 мл стерильного PBS. Извлеките сфероидальную пластину из инкубатора и поместите ее над холодильником до конца эксперимента.
  2. Подготовка каждого яйца
    1. Достаньте одно яйцо из инкубатора и поместите его над держателем для яиц. Сделайте небольшое отверстие в остром конце яйца (рисунок 2D) и отасуньте 1,5 мл белка с помощью шприца и иглы. Вставьте иглу перпендикулярно яйцу, чтобы не повредить яичный желток. Заклейте отверстие с помощью скотча. При желании повторите этот шаг для всех яиц перед экспериментом и повторно инкубируйте оставшиеся яйца.
    2. Аккуратно разрежьте ножницами окошко в верхней части яйца (Рисунок 3D). С помощью пипетки добавьте 1-2 капли PBS на желток. При необходимости удалите крупные пузырьки белка (например, те, что видны на рисунке 3F) с помощью пипетки.
    3. Присоедините тонкий капилляр к узлу трубки аспиратора. Частично заполните стеклянный капилляр раствором индийских чернил методом аспирации. Введите достаточное количество индийских чернил в желток под эмбрионом, пока не станут видны эмбриональные структуры (Рисунок 3E, F).
    4. С помощью стереомикроскопа подсчитайте количество сомитов (рисунок 4А). Самостоятельно пронумеруйте яйца с помощью карандаша (рисунок 4В).
  3. Трансплантация сфероидов
    1. Определите область трансплантата: параксиальная мезодерма на уровне зачатка крыла (пресомитная мезодерма предполагаемого15-го и20-го сомитов37) (рисунок 3G и рисунок 5A) или предполагаемая область первой дуги глотки (между эктодермой и энтодермой латерально к заднему мезенцефалону/первому ромбомеру38) (рисунок 8A).
    2. Разрежьте мембрану vitelline над целевой областью с помощью микроскальпеля.
    3. С помощью пары микроскальпелей сделайте неглубокий разрез в области, где будет имплантирован сфероид (рисунок 3H).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повреждения подлежащей энтодермы; В противном случае желток будет вытекать (если это произошло, выбросьте яйцо).
    4. Удалите тонкий капилляр из аспиратора и замените его толстым капилляром. Понаблюдайте за сфероидами под стереомикроскопом и выберите сфероид примерно такого же размера, как сомит (рисунок 2D). Вдохните этот сфероид в капилляр.
    5. Аккуратно поместите сфероид рядом с областью среза (Рисунок 3H). С помощью острых игл протолкните сфероид в область разреза (рис. 3I,J).
    6. Добавьте 1-2 капли PBS на эмбрион с помощью пипетки, чтобы убедиться, что сфероид надежно вставлен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если трансплантат смещен, следует пересадить новый сфероид (шаги 2.3.4 и 2.3.5).
    7. Очистите скорлупу от альбумина с помощью папиросной бумаги, чтобы убедиться, что яйцо может быть полностью запечатано, избегая загрязнения. Заклейте окошко в яйце с помощью скотча.
    8. Обратите внимание на привитую область (Рисунок 4А). Осторожно верните яйцо во влажный инкубатор при температуре 37,5 °C, чтобы избежать смещения вставленного сфероида.
    9. Инкубируйте яйцо до нужной стадии.
      Примечание: Когда ксенотрансплантат вводится в сомиты на уровне зачатков конечностей, миграция и гибель клеток были успешно проанализированы у 3,5-дневных эмбрионов (HH21), а дифференцировка и тропизм клеток наблюдались у 6-дневных эмбрионов (HH29) (Рисунок 5A). Интеграция в ткани хозяина также была выполнена у 8-дневных эмбрионов (HH33). Донорские клетки, привитые на территорию дуги глотки, были изучены на 4,5-дневных эмбрионах (HH25) (рис. 8А).

3. Диссекция тканей, фиксация, обработка и препарирование гистологических срезов

  1. Диссекция и фиксация
    1. Приготовьте фиксатор (не менее 1 мл/эмбрион): этанол 100% формальдегид 37% - ледяная уксусная кислота в соотношении 6:3:1. Очистите рабочую поверхность с помощью микрощипцов, хирургических ножниц или ножниц для радужной оболочки глаза, а также шумовки. Наполните стеклянную чашку Петри диаметром 60 мм холодной PBS и поместите ее под стереомикроскоп.
    2. Откройте яйцо, вырезав из него скотч.
    3. Разрежьте оболочки вокруг эмбриона и удалите его с помощью шумовки.
    4. Перенесите эмбрион в чашку Петри. Если эмбриону 5 дней (HH26) или больше, немедленно обезглавьте его перед любыми манипуляциями ex ovo.
    5. Удалите остатки мембран с помощью микрощипцов и ножниц. Аккуратно перемешайте образец в PBS, чтобы смыть оставшиеся капли желтка.
    6. Если ксенотрансплантат проводился на уровне крыла, выбросьте голову. Если клетки были пересажены в головную область, разрежьте и выбросьте нижнюю половину тела, убедившись, что сердечная область останется нетронутой.
    7. Перенесите каждый образец в отдельную пробирку объемом 2,0 мл, содержащую 1 мл фиксатора. Определите трубки по отдельности, как и ранее (рисунок 4B). Инкубируйте их в течение ночи при температуре 4 °C с перемешиванием.
    8. Используйте гранулу клеток или сфероидов (рисунок 4F) в качестве положительного контроля. Для этого центрифугируют клеточную суспензию (шаг 1.5) или сфероиды клеток (шаг 1.10) в дозе 180 × г в течение 10 мин в пробирке объемом 1,5 мл, отбраковывают питательную среду и добавляют 1 мл фиксатора, не нарушая гранулу. Инкубируйте пробирку в течение ночи при температуре 4 °C без перемешивания и действуйте так же, как и для образцов цыплят.
  2. Обезвоживание и встраивание
    1. Обезвоживайте эмбрионы путем последовательных промываний по 1 мл 70%, 80%, 90% и 100% этанола в 1x PBS в течение не менее 1 ч каждый с перемешиванием.
    2. Образцы инкубировать в течение ночи в 1 мл 100% этанола при комнатной температуре с перемешиванием.
    3. Инкубируйте образцы в 1 мл 100% ксилола в течение 1 ч в вытяжном шкафу. Повторите еще два раза.
    4. Перенесите содержимое тюбика в блок для окрашивания и выбросьте ксилол. Добавьте достаточно расплавленного парафина, чтобы покрыть зародыш, и накройте красящий блок стеклянной крышкой. Выдерживать в течение ночи в духовке при температуре 65 °C.
    5. Подготовьте теплую тарелку и форму для парафиновых блоков для закладки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пара растянутых скрепок полезна для позиционирования эмбриона.
    6. Заполните форму расплавленным парафином и перенесите в нее зародыш. Расположите эмбрион так, чтобы получить поперечный срез туловища (рисунок 5А) или корональный срез головы (рисунок 8А).
    7. Вставьте бумажную бирку с именем в парафин напротив поверхности, которую нужно разрезать, чтобы помочь разрезать эмбрион в правильной ориентации (Рисунок 4C).
    8. Если вы используете, поместите закладную кассету над образцом. Дайте блоку полностью остыть, прежде чем вынимать его из формы. В качестве альтернативы прикрепите затвердевший парафиновый блок к кассете или другому держателю блока с помощью расплавленного парафина и дайте ему снова остыть.
  3. Секционирование
    1. Подготовьте материалы для разделки. Разогрейте конфорку до 42 °C и накройте картонную или пенопластовую плиту чистой алюминиевой фольгой размером примерно 30 см х 20 см. Перед использованием очистите все поверхности.
      Примечание: Используйте перчатки, чтобы избежать контаминации нуклеазами, особенно если некоторые участки будут использоваться для гибридизации РНК in situ . Избегайте использования гистологической ванны для растяжения парафиновых срезов по той же причине, если вода и поверхности не могут быть предварительно тщательно очищены.
    2. Излишки парафина обрежьте лезвием микротома. Создайте скос с обеих сторон трапециевидной формы для легкого разделения каждой секции с помощью скальпельного лезвия на более позднем этапе (рис. 3A).
    3. Прикрепите блок к микротому. Расположите блок осторожно, чтобы левая и правая стороны были параллельны друг другу. Выполните более тонкую настройку, разрезав несколько участков образца и рассмотрев их под микроскопом.
    4. Когда целевая область будет достигнута (либо зачаток конечности, либо первая дуга глотки), отрежьте срезы 7 мкм и поместите парафиновые ленты поверх пластины, покрытой алюминиевой фольгой. Разделите всю целевую область (рисунок 4C).
    5. Для приготовления серийных срезов накройте достаточное количество стекол каплями стерильной деионизированной воды. Переносите отдельные разделы на слайды последовательно, используя кисти и скальпель. Перенос смежных разделов на разные слайды для создания серийных разделов (рис. 4D). Подготовьте серию из 3 слайдов для 3,5-дневных эмбрионов, 4 слайдов для 4,5-дневных эмбрионов и 5 слайдов для 6-дневных эмбрионов. Окрашивайте соседние срезы различными зондами, антителами или классическими гистологическими красителями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одна и та же серия может содержать несколько смежных слайдов, если большая часть эмбриона разделена. На каждую горку можно перенести несколько секций, сохраняя некоторое пространство между секциями, чтобы они могли растягиваться. Пока не ставьте горку на теплую тарелку.
    6. После того, как все секции были перенесены на горки, добавляйте еще воды, пока все секции не будут плавать над одной каплей воды. Поместите горку на теплую тарелку и дайте секциям растянуться. Снимите предметное стекло с теплой пластины и удалите воду, осторожно наклонив стекло к папиросной бумаге.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте секциям непосредственно касаться предметного стекла, прежде чем они растянутся.
    7. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение ночи в инкубаторе при температуре 37 °C.

4. Синтез меченых дигоксигенином зондов Alu методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

  1. Приготовьте стоковый раствор следующих специфичных для человека праймеров39: AluFw: 5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATC AGG T-3' и AluRev: 5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'.
  2. Приготовьте 50 мкл следующей ПЦР-реакции40: 1x ПЦР-буфер, 2,0 мМ MgCl2, 0,1 мМ dCTP, 0,1 мМ dGTP, 0,1 мМ dATP, 0,065 мМ dTTP, 0,035 мМ dig-11-dUTP, 0,4 мкМ праймеров AluFw, 0,4 мкМ праймеров AluRev, 0,05 ед/мкл Taq-полимеразы и 1 нг/мкл геномной ДНК человека.
  3. Запустите ПЦР в следующих условиях: начальная денатурация при 94 °C в течение 4 мин, затем 40 циклов при 94 °C в течение 20 с, 60 °C в течение 20 с и 72 °C в течение 20 с, а затем окончательная денатурация при 72 °C в течение 5 мин.
  4. Измерьте концентрацию зонда с помощью спектрофотометра. Храните щупы при температуре -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Препарат ПЦР должен иметь длину 200-300.о. после электрофореза в 2% агарозном геле29.

5. Секционная гибридизация in situ с помощью алюминических зондов

  1. День 1: Пермеабилизация и гибридизация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизованную стеклянную банку следует использовать для всех этапов, выполняемых в день 1.
    1. Разогрейте одну стирку PBT (0,1% Tween 20 in PBS) на водяной бане при температуре 37 °C и приготовьте влажную камеру с 50% формамида/50% деионизированной воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте объем всех промывок, исходя из размера стеклянной банки. Если не указано иное, все промывки выполняются путем погружения предметных стекол в раствор.
    2. Удалите парафин тремя последовательными стирками в ксилоле, по 5 мин каждая, в вытяжном шкафу.
    3. Регидратируйте серию двумя промывками в 100% этаноле в течение 5 минут каждая, а затем промывкой 90/70/30% этанола в PBS в течение 2 минут каждая.
    4. Стирать в PBT (0,1% Tween 20 in PBS) три раза по 5 минут каждый.
    5. Для пермеабилизации добавьте 2 мкг/мл протеиназы К в предварительно нагретый ПБТ, погрузите стекла в раствор и инкубируйте их в течение 14 мин на водяной бане при температуре 37 °C.
    6. Закрепите срезы погружением в 4% параформальдегид/PBS на 20 мин при комнатной температуре.
    7. Промыть с PBS в течение 5 минут.
    8. После удаления избытка PBS с каждого предметного стекла накройте срезы 300 μл гибридизационного буфера (50% деионизированного формамида, 4x SSC pH 5,0, 1x раствор Денхардта, 5% сульфат декстрана, 100 мкг/мл ДНК спермы лосося) (Таблица 1). Инкубировать в течение 1 ч при 42 °C в формамидной камере.
    9. Приготовьте раствор зонда Alu 0,2 нг/мл в буфере для гибридизации. Наклоните предметное стекло, чтобы удалить буфер для гибридизации, и добавьте 120 мкл раствора зонда Alu на срезы. Накройте стеклянной покровной крышкой, стараясь не допустить образования пузырей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе не следует использовать парапленку для покрытия предметных стекол, так как она будет плавиться при температуре выше 70 °C.
    10. Нагрейте предметные стекла на горячей плите до 95 °C в течение 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не вдыхайте пары формамида.
    11. Инкубируйте предметные стекла при температуре 42 °C в формамидной камере на ночь.
  2. День 2: Строгие промывания и иммуногистохимия
    1. Приготовьте 20x буфер SSC (3 М NaCl, 0,3 М цитрата натрия, pH 7,5) (Таблица 1). Нагрейте две полоски 0,1x солевого цитрата натрия (SSC) буфера, pH 7,5, до 42 °C.
    2. Наполните стеклянную банку 2x буфером SSC, pH 7,5. Аккуратно поместите слайды в раствор и подождите, пока покровные стекла отсоединятся самостоятельно. Снимите покровные стекла с помощью клещей и выдержите предметные стекла в буфере 2x SSC в течение 5 минут при комнатной температуре.
    3. Повторно промойте предметные стекла с 2x буфером SSC, pH 7,5, в течение 5 минут при комнатной температуре.
    4. Промойте предметные стекла два раза с 0,1x буфером SSC, pH 7,5, при 42 °C в течение 5 минут каждый.
    5. Промойте предметные стекла два раза MABT (буфер малеиновой кислоты с Tween; 0,1 М малеиновой кислоты, 0,15 М натрия хлорида, 0,1% Tween 20, pH 7,5) (Таблица 1) в течение 30 минут каждый при комнатной температуре.
    6. Сотрите излишки буфера с каждого предметного стекла и налейте на срезы 400 мкл блокирующего раствора (10% инактивированной обычной козьей сыворотки, 2% блокирующий реагент в MABT). Выдерживать в течение 2 ч во влажной камере (приготовленной из деионизированной воды) при комнатной температуре.
    7. Наклоните предметные стекла, чтобы удалить жидкость, и добавьте 150 мкл фрагментов Fab anti-DIG, конъюгированных с щелочной фосфатазой в соотношении 1:2000 в блокирующем растворе. Накрыть стеклянной покровной крышкой или парапленкой и выдерживать во влажной камере при температуре 4 °C в течение 16 часов.
  3. День 3: Разработка цвета
    1. Аккуратно снимите покровные стекла или парапленку внутри банки с MABT (как в шаге 5.2.2) и выдержите предметные стекла в MABT в течение 30 минут при комнатной температуре.
    2. Промыть MABT еще три раза по 30 мин каждый.
    3. Промыть с MAB (буфер малеиновой кислоты; 0,1 М малеиновой кислоты, 0,15 М хлорида натрия, pH 7,5) (Таблица 1) в течение 30 минут.
    4. Промыть два раза NTM (буфер NaCl-Tris-MgCl2 ; 100 мМ Tris-HCl pH 9,5, 100 мМ хлорид натрия, 50 мМ хлорид магния) (Таблица 1) в течение 10 мин каждый.
    5. Добавьте раствор для окрашивания (0,45 мкл/мл 4-нитро синего тетразолия хлорида, 3,5 мкл/мл 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата-толуидина в NTM) (Таблица 1) в банку для окрашивания и погрузите предметные стекла в раствор. Накройте банку алюминиевой фольгой и дайте цвету проявиться в течение ночи при температуре 37 °C.
  4. День 4: Противоокрашивание и монтаж
    1. Вымойте слайды трижды PBS при комнатной температуре по 10 мин каждая.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что раствор для окрашивания правильно утилизирован как галогенные отходы.
    2. Установите направляющие в исходном виде, добавив капли водного монтажного носителя и накрыв секции стеклянным покровным стеклом. В качестве альтернативы можно приступать к ядерному быстрому красному или алкийскому синему окрашиванию.
    3. Сотрите излишки PBS и добавьте 500 μл ядерного противоокрашивающего раствора 0,1% ядерного быстрого красного41 (Таблица 1) на срезы и инкубируйте предметные стекла во влажной камере в течение 10 минут. Советчик быстро удалить излишки ядра красного цвета и приступить к обезвоживанию (шаг 5.4.5).
    4. Погрузить срезы в 0,5% раствор алкийского синего (противохрящевое пятно)42 на 10 мин; Промойте в дистиллированной воде и выиграйте в 1% фосфомолибдоновой кислоте в течение 10 мин. Еще раз смойте водой и приступайте к обезвоживанию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если пропустить промывку фосфомолибдовой кислотой, альцианский синий становится ядерным противопятном.
    5. Обезвоживайте в 70/95/100/100% этаноле в течение 5 минут каждый.
    6. Стирать с ксилолом три раза по 5 минут каждый раз в вытяжном шкафу.
    7. Крепление с помощью монтажного носителя на основе ксилола и стеклянных покровных стекол.
    8. Дайте предметным стеклам высохнуть не менее 16 часов в вытяжном шкафу.

6. Получение изображения

  1. После того, как смонтированные предметные стекла будут тщательно высушены, исследуйте все срезы на наличие привитых клеток человека с помощью вертикального светлопольного микроскопа (рисунок 4E). Найдите сине-фиолетовые Alu-положительные клетки (Рисунок 4F, G) и отметьте участки, содержащие Алю-положительные клетки, с помощью маркера (Рисунок 4E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Маркировка участков Alu-положительными ячейками облегчит их поиск при фотографировании и сравнении соседних слайдов, окрашенных с другими маркерами.
  2. Позаботьтесь о том, чтобы сфотографировать срезы, содержащие ксенотрансплантат, в том же порядке, в котором они размещены на предметном стекле (в передне-заднем направлении). Назовите каждую фотографию со всей необходимой информацией, такой как [дата ксенотрансплантата]_[тип клетки]_[возраст эмбриона]_[тип зонда]_[номер секции]_001. Включите файлы метаданных, чтобы добавить масштабную линейку позже.
  3. Если другие слайды из той же серии окрашены другим маркером, например, гибридизацией РНК in situ или иммуногистохимией, сфотографируйте и назовите соседние участки (рис. 6) таким же образом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Идентификация Alu-положительных ADSC в гистологических срезах
Последовательности Alu представляют собой повторяющиеся элементы, которые составляют ~10% генома человека и, таким образом, являются отличными мишенями для идентификации клеток человека видоспецифичнымспособом. Гибридизация in situ с ДНК-зондами может быть использована для идентификации геномных элементов на гистологических срезах, включая первичные клетки...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный здесь протокол (рис. 1) представляет собой возможный вариант скрининга поведения первичных популяций клеток человека in vivo с использованием эмбрионов цыплят в качестве модели. В данной статье описывается формирование сфероидов клеток (Рисунок 2), трансплантация сфероида в эмбрион цыпленка (Рисунок 3), обработка образцов и гибридизация in situ (Рисун...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана Федеральным университетом Рио-де-Жанейро (UFRJ for J.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq for J.B.) и Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ for J.B.). Благодарим Т. Джаффредо (CNRS, Париж, Франция) за зонд Runx2 (Cbfa1). Антитело HNK1 было получено из Банка гибридом, разработанного под эгидой NICHD и поддерживаемого Университетом Айовы, Департамент биологических наук, Айова-Сити, IA 52242 США. Мы благодарим В. Моура-Нето за предоставленный доступ к микротому и Р. Лента за предоставление доступа к микроскопу. Благодарим Э. Штека за помощь в синтезе зондов Alu .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Animals
Gallus gallus яйцаGranja TolomeiSPF-free Белыйлеггорн курица
Reagents
Alcian Blue 8GXSigma-aldrichA5268
AluFw праймерыSigma-aldrichOLIGO5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG АГГ Т-3'
Грунтовки AluRevSigma-aldrichOLIGO5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'
Сульфат алюминияSigma-aldrich368458Для ядерного быстрого приготовления красного раствора
Антидигоксигенин-AP, Fab фрагментыRoche11093274910Реестр антител: AB_514497
Антитела против человека Natural Killer 1 антитела (HNK1, CD57)Исследования развития Гибридома Банк3H5Реестр антител: AB_2314644
Антимышь, козы IgM-HRPСанта-Круз Биотехнологияsc-2973Идентификатор реестра антител: AB_650513
Антитела против мыши, козы IgG (H+L)-HRPNovexG-21040Идентификатор реестра антител: AB_2536527
Антитела против гладкой мускулатуры Actin/ACTA2DakoM085129Идентификатор реестра антител: AB_2811108
AquatexMerck1085620050Водный монтажный агент
5-бромо-4-хлор-3-индолилфосфат -толуидиновая соль (BCIP)Sigma-aldrichB8503-100MG
Блокирующий реагентRoche11096176001
Лимонная кислотаVETEC238Для получения буфера SSC
Коллагеназа типа IASigma-aldrichSCR103
dCTP, dGTP, dATP, dTTP наборRoche11969064001
раствор Денхардта 50XИнвитроген750018Для гибридизационного буферного препарата
Декстрана сульфат натрия сольThermo Scientific15885118Для гибридизационного буферного препарата
DIG RNA Меченая смесьRoche11277073910содержит DIG-11-dUTP
DMEM с низким содержанием глюкозыSigma-aldrichD5523
3,3′-диаминобензидина тетрагидрохлорид (DAB)Sigma-aldrichD5905-50TAB
N,N-Диметилформамид (DMF)Sigma-aldrich227056Для приготовления раствора NBT и BCIP
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Sigma-aldrichE6758Для приготовления раствора трипсина
Entellan newMerck107961Неводная монтажная среда
EthanolProquí miosN/A
Фетальная бычья сывороткаThermoFisher12657029Инактивировать при 56 ° C перед применением
Формальдегид 37% растворProquí miosN/A
FormamideVetecV900064
ледяная уксусная кислотаProquí miosN/A
Индийские чернилаPelikan221143
раствор L-глутамина (200 мМ)Gibco25030-149
Хлорид магнияMerck8147330100Для буферного препарата NTM
Малеиновая кислотаSigma-aldrichM0375-500GДля буферного препарата MAB
MethanolProquí mios
Нормальная козья сывороткаSigma-aldrichNS02LИнактивировать при 56 ° C перед применением
4-нитросиний тетразолия хлорид (NBT)Roche11585029001
Nuclear fast redSigma-aldrich60700
Paraplast PlusSigma-aldrichP3558
Пенициллин G Натриевая сольSigma-aldrichP3032
Фосфатный буферный раствор (PBS)Sigma-aldrichP3813
Фосфомолибдоновая кислотаMerck100532
протеиназа KGibco BRL25530-015
ДНК спермы лососяInvitrogen15632011Для гибридизационного буферного препарата
Sodium chlorideSigma-aldrichS9888Для SSC, MAB и NTM буферный препарат
Streptomycin SulfateSigma-aldrichS6501
Набор Taq PolymeraseCenbiot EnzimasN/A
Sigma-aldrichT5941
ТрипсинSigma-aldrichT4799
Tween 20Sigma-aldrichP1379
XyleneProquí miosN/A
Microscope and equipment
Axioplan вертикальный микроскопCarl Zeiss МикроскопияN/A
Axiovision программное обеспечениеCarl Zeiss МикроскопияN/A
Cell инкубаторThermoForma3110
Инкубатор для яиц - 50 яицGP
Лампа на гусиной шееBiocamN/AДля манипуляций с яйцеклетками
Фиджи программное обеспечение; Плагин для счетчика клетокImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Ламинарный проточный колпакTROX1385
Nanodrop LiteThermo ScientificND-LITE-PR
Ротарный микротомLeica BiosystemsRM2125 RTSДля среза
СтереомикроскопLabomedLuxeo 4DДля манипуляций
с яйцеклеткамиСтерилизационный шкафREALIS7261690Для стерилизации хирургических материалов
<сильно>Расходные материалы
0,2 мл (ПЦР) полипропиленовые центрифужные пробиркиEppendorf30124707
15 мл полипропиленовые конические центрифужные пробиркиCorningCLS430791
1,5 мл полипропиленовые центрифужные пробиркиAxygenMCT-150-C
мл полипропиленовые центрифужные пробиркиAxygenMCT-200-C
50 мл полипропиленовые конические центрифужные пробиркиCorningCLS430829
Barrier (Filter) Tips, 200 μ Размер LInvitrogenAM12655Для манипуляций с яйцом
Выкопанный стеклянный блок (Staining Block) с покровным стекломHecht Karl42020010
Встраиваемые кассетыSimportM480Используется в качестве держателя парафинового блока
Стеклянные покровные стекла, 24 x 40 ммKasviK5-2440
Стеклянные пипетки Пастера 230 ммNORMAX5426023Для приготовления стеклянных капилляров
Микротомные лезвияLeica BiosystemsHIGH-PROFILE-DISPOSABLE-BLADES-818Для секционирования
Парапленка MПарапленкаP7793
Пластиковая чашка Петри, 30 ммKasviK13-0035Для манипуляций с яйцеклетками
Пластиковая чашка Петри, 60 ммProlab0303-8Для приготовления сфероидов клеток. Не следует проводить лечение клеточной адгезии.
Предметные стекла из силанизированного стекла (Starfrost)Knittel Glass198Для секционирования
Шприц 1 мл , Иглы 26 г (0,45 x 13 мм)Descarpack32972Для манипуляций с яйцеклетками (аспирация белка)
Хирургические инструменты
Аспираторная трубкаDrummond2-000-000Для манипуляций с яйцеклетками
Ножницы для препарированияFine Science Tools14061-11Для манипуляций с яйцами
Микрощипцы (пинцет)Fine Science Tools00108-11Для манипуляций с яйцеклетками и подготовки стеклянных капилляров
Иглодержатель (регулируемый патрон для рассечения иглы)Fisherbrand8955Для манипуляций с яйцеклеткой
Масло точильный камень, зернистость 10.000н/д Н/дДля заточки игл
Пара маленьких кисти для рисованиян/д н/дДля работы с парафиновыми срезами. Можно использовать любую марку.
Иглышвейные н/д н/дДля заточки в микроскальпели. Можно использовать любую марку.
Скальпель одноразовый стерильный No23Swann-Norton110Для секционирования
Рукоятка хирургического скальпеляSwann-Norton914Для секционирования
Wecker Ирис ножницы, острые/острыеSurtexSS-641-11Для манипуляций с яйцеклеткой
Tris-HCl 2

Ссылки

  1. Herbert, K. E., Lévesque, J. P., Haylock, D. N., Prince, M. The use of experimental murine models to assess novel agents of hematopoietic stem and progenitor cell mobilization. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 14 (6), 603-621 (2008).
  2. Parada-Kusz, M., et al. Generation of mouse-zebrafish hematopoietic tissue chimeric embryos for hematopoiesis and host-pathogen interaction studies. DMM Disease Models and Mechanisms. 11 (11), (2018).
  3. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  4. Jung, J. Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development. Toxicological Research. 30 (1), 1-5 (2014).
  5. Ben-David, U., et al. Patient-derived xenografts undergo mouse-specific tumor evolution. Nature Genetics. 49 (11), 1567-1575 (2017).
  6. le Douarin, N., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. Cambridge. (1999).
  7. Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219(2018).
  8. Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
  9. Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
  10. Douarin, N., et al. le et al. Evidence for a thymus-dependent form of tolerance that is not based on elimination or anergy of reactive T cells. Immunological Reviews. 149 (1), 35-53 (1996).
  11. Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), e2071(2010).
  12. Goldstein, R. S. Transplantation of human embryonic stem cells and derivatives to the chick embryo. Methods in Molecular Biology. 584, 367-385 (2010).
  13. Akhlaghpour, A., et al. Chicken interspecies chimerism unveils human pluripotency. Stem Cell Reports. 16 (1), 39-55 (2021).
  14. Kulesa, P. M., Morrison, J. A., Bailey, C. M. The neural crest and cancer: A developmental spin on melanoma. Cells Tissues Organs. 198 (1), 12-21 (2013).
  15. Hendrix, M. J. C., et al. Reprogramming metastatic tumour cells with embryonic microenvironments. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 246-255 (2007).
  16. Singer, N. G., Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells: Mechanisms of inflammation. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 6, 457-478 (2011).
  17. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal stem cells: Revisiting history, concepts, and assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
  18. Griffin, M. D., et al. Concise review: Adult mesenchymal stromal cell therapy for inflammatory diseases: How well are we joining the dots. Stem Cells. 31 (10), 2033-2041 (2013).
  19. Owen, M., Friedenstein, A. J. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Foundation Symposium. 136, 42-60 (1988).
  20. Bianco, P., Robey, P. G., Saggio, I., Riminucci, M. "Mesenchymal" stem cells in human bone marrow (skeletal stem cells): A critical discussion of their nature, identity, and significance in incurable skeletal disease. Human Gene Therapy. 21 (9), 1057-1066 (2010).
  21. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  22. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  23. Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: Localization, morphology and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
  24. Zannettino, A. C. W., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214 (2), 413-421 (2008).
  25. Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (9), 2806-2812 (2012).
  26. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  27. Baptista, L. S., et al. marrow and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: How close are they. Journal of Stem Cells. , 73-90 (2007).
  28. Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS ONE. 8 (12), 84206(2013).
  29. Cordeiro, I. R., et al. Chick embryo xenograft model reveals a novel perineural niche for human adipose-derived stromal cells. Biology Open. 4 (9), 1180-1193 (2015).
  30. Santos, R. deA., et al. Intrinsic angiogenic potential and migration capacity of human mesenchymal stromal cells derived from menstrual blood and bone marrow. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 1-23 (2020).
  31. Menezes, A., et al. Live cell imaging supports a key role for histone deacetylase as a molecular target during glioblastoma malignancy downgrade through tumor competence modulation. Journal of Oncology. 2019, 9043675(2019).
  32. Brito, J. M., Teillet, M. A., le Douarin, N. M. Induction of mirror-image supernumerary jaws in chicken mandibular mesenchyme by Sonic Hedgehog-producing cells. Development. 135 (13), 2311-2319 (2008).
  33. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments JoVE. (51), e2720(2011).
  34. de Barros, A. P. D. N., et al. Osteoblasts and bone marrow mesenchymal stromal cells control hematopoietic stem cell migration and proliferation in 3D in vitro model. PLoS One. 5 (2), 9093(2010).
  35. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1951).
  36. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  37. Tickle, C. How the embryo makes a limb: Determination, polarity and identity. Journal of Anatomy. 227 (4), 418-430 (2015).
  38. Couly, G., Grapin-Botton, A., Coltey, P., le Douarin, N. M. The regeneration of the cephalic neural crest, a problem revisited: The regenerating cells originate from the contralateral or from the anterior and posterior neural fold. Development. 122 (11), 3393-3407 (1996).
  39. Walker, J. A., et al. Human DNA quantitation using Alu element-based polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 315 (1), 122-128 (2003).
  40. Steck, E., Burkhardt, M., Ehrlich, H., Richter, W. Discrimination between cells of murine and human origin in xenotransplants by species specific genomic in situ hybridization. Xenotransplantation. 17 (2), 153-159 (2010).
  41. Sams, A., Davies, F. M. R. Commercial varieties of nuclear fast red. Stain Technology. 42 (6), 269-276 (1967).
  42. Lison, L. Alcian blue 8 g with chlorantine fast red 5 B. A technic for selective staining of mucopolysaccharides. Biotechnic and Histochemistry. 29 (3), 131-138 (1954).
  43. Cordaux, R., Batzer, M. A. The impact of retrotransposons on human genome evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 691-703 (2009).
  44. Brüstle, O., et al. Chimeric brains generated by intraventricular transplantation of fetal human brain cells into embryonic rats. Nature Biotechnology. 16 (11), 1040-1044 (1998).
  45. Warncke, B., Valtink, M., Weichel, J., Engelmann, K., Schäfer, H. Experimental rat model for therapeutic retinal pigment epithelium transplantation - Unequivocal microscopic identification of human donor cells by in situ hybridisation of human-specific Alu sequences. Virchows Archiv. 444 (1), 74-81 (2004).
  46. Kasten, P., et al. Ectopic bone formation associated with mesenchymal stem cells in a resorbable calcium deficient hydroxyapatite carrier. Biomaterials. 26 (29), 5879-5889 (2005).
  47. Baptista, L., et al. Adipose tissue of control and ex-obese patients exhibit differences in blood vessel content and resident mesenchymal stem cell population. Obesity Surgery. 19 (9), 1304-1312 (2009).
  48. Christ, B., Huang, R., Scaal, M. Formation and differentiation of the avian sclerotome. Anatomy and Embryology. 208 (5), 333-350 (2004).
  49. Scaal, M., Christ, B. Formation and differentiation of the avian dermomyotome. Anatomy and Embryology. 208 (6), 411-424 (2004).
  50. Tucker, G. C., Delarue, M., Zada, S., Boucaut, J. C., Thiery, J. P. Expression of the HNK-1/NC-1 epitope in early vertebrate neurogenesis. Cell and Tissue Research. 251 (2), 457-465 (1988).
  51. Creuzet, S., Schuler, B., Couly, G., le Douarin, N. M. Reciprocal relationships between Fgf8 and neural crest cells in facial and forebrain development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4843-4847 (2004).
  52. Charrier, J. B., Lapointe, F., le Douarin, N. M., Teillet, M. A. Dual origin of the floor plate in the avian embryo. Development. 129 (20), 4785-4796 (2002).
  53. Kordes, U., Cheng, Y. C., Scotting, P. J. Sox group e gene expression distinguishes different types and maturational stages of glial cells in developing chick and mouse. Developmental Brain Research. 157 (2), 209-213 (2005).
  54. Stricker, S., Fundele, R., Vortkamp, A., Mundlos, S. Role of Runx genes in chondrocyte differentiation. Developmental Biology. 245 (1), 95-108 (2002).
  55. Grottkau, B. E., Lin, Y. Osteogenesis of adipose-derived stem cells. Bone Research. 1 (2), 133(2013).
  56. Culling, C. F. A. Handbook of histopathological and histochemical techniques. Including museum techniques. , Elsevier. (1974).
  57. Francis, P. H., Richardson, M. K., Brickell, P. M., Tickle, C. Bone morphogenetic proteins and a signalling pathway that controls patterning in the developing chick limb. Development. 120 (1), 209-218 (1994).
  58. Huber, K., et al. Persistent expression of BMP-4 in embryonic chick adrenal cortical cells and its role in chromaffin cell development. Neural Development. 3, 28(2008).
  59. Pouget, C., Gautier, R., Teillet, M. A., Jaffredo, T. Somite-derived cells replace ventral aortic hemangioblasts and provide aortic smooth muscle cells of the trunk. Development. 133 (6), 1013-1022 (2006).
  60. Kirby, M. L., Hutson, M. R. Factors controlling cardiac neural crest cell migration. Cell Adhesion and Migration. 4 (4), 609-621 (2010).
  61. Isern, J., et al. The neural crest is a source of mesenchymal stem cells with specialized hematopoietic stem cell niche function. eLife. 3, 03696(2014).
  62. Yamazaki, S., et al. Nonmyelinating schwann cells maintain hematopoietic stem cell hibernation in the bone marrow niche. Cell. 147 (5), 1146-1158 (2011).
  63. Carr, M. J., et al. Mesenchymal precursor cells in adult nerves contribute to mammalian tissue repair and regeneration. Cell Stem Cell. 24 (2), 240-256 (2019).
  64. Walker, J. A., et al. Quantitative intra-short interspersed element PCR for species-specific DNA identification. Analytical Biochemistry. 316 (2), 259-269 (2003).
  65. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
  66. Yong, K. S. M., Her, Z., Chen, Q. Humanized mice as unique tools for human-specific studies. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 66 (4), 245-266 (2018).
  67. Cordeiro, I. R., Tanaka, M. Environmental oxygen is a key modulator of development and evolution: From molecules to ecology: Oxygen-sensitive pathways pattern the developing organism, linking genetic and environmental components during the evolution of new traits. BioEssays. 42 (9), 2000025(2020).
  68. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  69. Puente, B. N., et al. The oxygen-rich postnatal environment induces cardiomyocyte cell-cycle arrest through DNA damage response. Cell. 157 (3), 565-579 (2014).
  70. Colton, C. K. Implantable biohybrid artificial organs. Cell Transplantation. 4 (4), 415-436 (1995).
  71. Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in situAlu

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.