Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Внутриберибиальная инъекция клеток остеосаркомы для создания ортотопических моделей мышиной остеосаркомы и метастазов в легкие

11.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63072

⸱

28 октября 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Настоящий протокол описывает интратибию остеосаркомы для генерации мышиных моделей, несущих ортотопическую остеосаркому и поражения легочными метастазами.

Аннотация

Остеосаркома является наиболее распространенным первичным раком кости у детей и подростков, причем легкие являются наиболее распространенным метастатическим участком. Пятилетняя выживаемость больных остеосаркомой с легочными метастазами составляет менее 30%. Поэтому использование мышиных моделей, имитирующих развитие остеосаркомы у людей, имеет большое значение для понимания фундаментального механизма канцерогенеза остеосаркомы и легочных метастазов для разработки новых терапевтических средств. Здесь сообщается о подробных процедурах для создания моделей первичной остеосаркомы и легочных метастазов мыши путем инъекции интратибии клеток остеосаркомы. В сочетании с биолюминесценцией или рентгеновской системой визуализации в реальном времени эти живые мышиные модели используются для мониторинга и количественной оценки роста и метастазирования остеосаркомы. Чтобы установить эту модель, базальную мембранную матрицу, содержащую клетки остеосаркомы, загружали в микрообъемный шприц и вводили в одну большеберцовую кость каждой атипичной мыши после анестезии. Мышей приносили в жертву, когда первичная остеосаркома достигла ограничения размера в одобренном IACUC протоколе. Ноги, несущие остеосаркому, и легкие с метастазирующими поражениями были разделены. Эти модели характеризуются коротким инкубационным периодом, быстрым ростом, тяжелыми поражениями, а также чувствительностью при мониторинге развития первичных и легочных метастатических поражений. Таким образом, это идеальные модели для изучения функций и механизмов специфических факторов канцерогенеза остеосаркомы и легочных метастазов, микроокружения опухоли и оценки терапевтической эффективности in vivo.

Введение

Остеосаркома является наиболее распространенным первичным раком кости у детей и подростков 1,2, который в основном проникает в окружающие ткани и даже метастазирует в легкие при постановке диагноза пациентам. Легочное метастазирование является основной проблемой для терапии остеосаркомы, а пятилетняя выживаемость пациентов с остеосаркомой с легочным метастазированием остается на уровне 20%-30%3,4,5. Тем не менее, пятилетняя выживаемость первичной остеосаркомы была увеличена примерно до 70% с 1970-х годов из-за введения химиотерапии6. Поэтому крайне необходимо понять фундаментальный механизм канцерогенеза остеосаркомы и легочных метастазов для разработки новых методов лечения. Применение мышиных моделей, которые лучше всего имитируют прогрессирование остеосаркомы у людей, имеет большое значение7.

Животные модели остеосаркомы генерируются спонтанной, индуцированной генной инженерией, трансплантацией и другими методами. Модель спонтанной остеосаркомы редко используется из-за длительного времени образования опухоли, непоследовательной частоты возникновения опухоли, низкой заболеваемости и плохой стабильности 8,9. Хотя модель индуцированной остеосаркомы более доступна для получения, чем спонтанная остеосаркома, применение модели индуцированной остеосаркомы ограничено, поскольку индуцирующий фактор будет влиять на микроокружение, патогенез и патологические характеристики остеосаркомы10. Трансгенные модели помогают понять патогенез раковых заболеваний, поскольку они могут лучше имитировать физиологическую и патологическую среду человека; однако трансгенные модели животных также имеют свои ограничения из-за сложности, долгосрочности и высокой стоимости трансгенной модификации. Более того, даже в наиболее широко распространенных трансгенных моделях животных, генерируемых модификацией генов p53 и Rb, только 13,6% саркомы произошло в четырех костях конечностей11,12.

Трансплантация является одним из наиболее часто используемых первичных и отдаленных методов производства модели метастатического рака в последние годы из-за ее простого маневра, стабильной скорости образования опухоли и лучшей однородности13. Трансплантация включает в себя гетеротопную трансплантацию и ортотопическую трансплантацию в соответствии с местами трансплантации. При гетеротопной трансплантации остеосаркомы клетки остеосаркомы вводят вне первичных участков остеосаркомы (кости) животных, обычно под кожу, подкожно14. Хотя гетеротопная трансплантация проста без необходимости выполнения операции у животных, участки, где вводятся клетки остеосаркомы, не представляют собой фактическую микросреду остеосаркомы человека. Ортотопическая трансплантация остеосаркомы - это когда клетки остеосаркомы вводятся в кости животных, такие как большеберцоваякость 15,16. По сравнению с гетеротопными трансплантатами ортотопические трансплантаты остеосаркомы характеризуются коротким инкубационным периодом, быстрым ростом и сильным эрозионным характером; поэтому они являются идеальными животными моделями для исследований, связанных с остеосаркомой17.

Наиболее часто используемыми животными являются мыши, собаки и рыбки данио18,19. Спонтанная модель остеосаркомы обычно используется у собак, потому что остеосаркома является одной из наиболее распространенных опухолей у собак. Однако применение этой модели ограничено из-за длительного времени образования опухоли, низкой скорости опухолевого генеза, плохой однородности и стабильности. Рыбки данио часто используются для построения трансгенных или нокаутирующих опухолевых моделей из-за их быстрого размножения20. Но гены рыбок данио отличаются от генов человека, поэтому их применение ограничено.

В этой работе описываются подробные процедуры, меры предосторожности и репрезентативные изображения для получения первичной остеосаркомы в большеберцовой кости с легочным метастазированием путем инъекции интратибии клеток остеосаркомы у атимических мышей. Этот метод был применен для создания первичной остеосаркомы у голени мыши для оценки терапевтической эффективности, которая показала высокую воспроизводимость21,22.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных были одобрены комитетом по защите животных Шанхайского университета традиционной китайской медицины. Четырехнедельные самцы атипичных мышей BALB/c акклиматизировались за неделю до операции по ортотопической инъекции клеток остеосаркомы. Мышей размещали в индивидуально вентилируемых клетках для мышей с пятью мышами на клетку в 12-часовом светло-темном цикле с доступом ad libitum к корму SPF и стерильной воде.

1. Подготовка клеток

  1. В день инъекции клетки остеосаркомы (143B-люциферазы) промыть 80%-90% сливающихся клеток, культивируемых в чашке для культуры клеток 10 см дважды с PBS (рН 7,4) и трипсинизировать 1,5 мл 0,25% трипсина в течение 3 мин. Затем добавьте 6 мл 10% сывороточащих MEM-сред для гашения трипсина и соберите клетки в 15 мл центрифужной трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная линия 143B-люциферазы получена из клеточной линии 143B, трансфектированной pLV-люциферазным вектором23.
  2. Аспирировать 20 мкл клеточной суспензии в камеру счетной пластины ячейки и рассчитать концентрацию клеток с помощью автоматического счетчика ячеек (см. Таблицу материалов).
  3. Центрифугируйте ячейки при 800 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  4. Аспирировать супернатант пипеткой и повторно суспендировать клеточную гранулу в матрице базальной мембраны 8,5 мг/мл (см. Таблицу материалов) до конечной концентрации 2 х 107 клеток/мл.
  5. Держа клетки на льду, принесите их в операционную. Ячейки должны быть использованы в течение 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание неточных инъекционных доз (например, из-за мертвого пространства в шприцах) готовят дополнительную клеточную суспензию (обычно в два раза превышающую требуемый объем клеточной суспензии). Матрица базальной мембраны все время держится на льду, так как обладает коагуляционным свойством выше комнатной температуры24.

2. Хирургия ортотопической инъекции клеток остеосаркомы

ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические инструменты показаны на рисунке 1.

  1. Мышей выращивали в специфических условиях, свободных от патогенов. Все процедуры проводились в асептическом кабинете со стерильными инструментами.
  2. Обезболивают мышей, подвергая их воздействию 2% изофлурана и 98% кислорода (скорость потока кислорода, 2 л/мин).
  3. Нанесите небольшое количество офтальмологической мази на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните всю процедуру в хорошо проветриваемом помещении. Перед инъекцией клеток остеосаркомы убедитесь, что каждая мышь находится под глубокой анестезией путем ущемления пальца ноги; если у мыши все еще есть ответы, такие как подергивание или рывок, подождите долго, пока вышеуказанные ответы не исчезнут.
  4. Держите каждую мышь в положении лежа на спине. Удерживайте лодыжку мыши большим и указательным пальцами и дезинфицируйте место инъекции большеберцовой кости 70% этаноловым тампоном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы крепко держать лодыжку мыши, как большой, так и указательный кончики пальцев имеют большое значение для последующих процедур.
  5. Поверните голеностопный сустав каждой мыши наружу, чтобы переместить большеберцовую и малоберцовую кости, и согните коленный сустав в подходящее положение, пока проксимальное плато большеберцовой кости (верхняя часть большеберцовой кости) не будет хорошо видно через кожу (рисунок 2A).
  6. Прикрепите иглу к шприцу объемом 1 мл и направьте кончик иглы к месту инъекции. Убедитесь, что игла шприца параллельна длинной оси большеберцовой кости.
    1. Чрескожно вводят иглу через или рядом с коленной связкой, когда она проходит через кожу / суставную капсулу; th0en, поверните шприц (от 1/2 до 3/4 круга), чтобы просверлить отверстие через платформу большеберцовой кости к дистальному концу большеберцовой кости (медуллярная полость) для инъекции клеток остеосаркомы с помощью микрообъемного шприца (рисунок 2B, C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одновременное вращение большеберцовой кости может ощущаться во время сверления, если кончик иглы точен. Убедитесь, что иглоукалывание движется вперед с вращением шприца, а не напрямую выдвигается вперед, пока около половины иглы не окажется в большеберцовой кости.
  7. Проверьте, сделала ли игла шприца заметное движение в медуллярный канал, чтобы обеспечить успешное бурение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите рентгенологическое исследование (см. Таблицу материалов) для подтверждения правильного положения иглы и сбора изображений.
  8. Загрузите суспензию клеток остеосаркомы 143B (со стадии 1.5) в микрообъемный шприц и замените шприц объемом 1 мл в большеберцовой кости на шприц микрообъемом 143B с клеточной нагрузкой (рисунок 2D). Медленно вводят ~ 10 мкл (игнорируя ранее существовавший раствор в игле) суспензии 143B-клеток в большеберцовую кость каждой атимической мыши (около 2 х 105 клеток) без применения высокого давления.
  9. Прижимайте место инъекции ватным тампоном в течение 20-30 с при удалении микрообъемного шприца.
  10. Поместите каждую мышь обратно в чистую клетку и внимательно следите за тем, чтобы мышь полностью не оправилась от анестезии (около 10 минут).
  11. Мониторинг роста опухоли in vivo с помощью рентгеновской системы визуализации. Измеряйте больший диаметр (a) и короткий диаметр (b) раковой массы каждую неделю с помощью штангенциркуля для расчета объема опухоли (V): V = 1/2 x a x b2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезируйте мышей, подвергая их воздействию 2% изофлурана и 98% кислорода. Мышей анестезировали для рентгеновской визуализации. Интратибийная инъекция люциферазы или флуоресцентного белка, меченого клетками остеосаркомы, позволяет отслеживать первичные и метастатические поражения остеосаркомы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гуманные конечные точки мышей с остеосаркомой из-за опухолевого роста колена и метастазирования в легких были основаны на следующих критериях: (1) показатель состояния тела, (2) порог потери веса 20%, (3) средний максимальный диаметр опухолей 2 см или (4) сильно ограниченное поведение животных.

3. Патологическое исследование (сбор первичного и легочного метастатического образца остеосаркомы для анализа)

  1. Через шесть недель после инъекции клеток остеосаркомы принесите мышей в жертву вывихом шейки матки после воздействия на них для вдыхания CO2 .
  2. Держите мышь в положении лежа на спине и вытяните обе задние конечности.
  3. Отделите целые ноги, несущие остеосаркому, от паховой области.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все ноги отделены от одного анатомического участка.
  4. Подготовьте гистологический образец ног, имеющих остеосаркому, удалив кожу, мышцы и ступни, а затем зафиксируйте образец каждой мыши в трубке объемом 50 мл раствором формалина 20 мл (10%) в течение 24 ч с последующим декальцификацией в 10% растворе ЭДТА в течение 14 дней с периодическим изменением буфера.
  5. Вставить образец в парафин и подготовить участки к гистологическому исследованию в соответствии с ранее опубликованной работой25.
  6. Осторожно отделите легкие и поместите их в 50 мл пробирку, заполненную 20 мл раствора формалина (10%). Через 24 ч переведите легкие каждой мыши в пробирку объемом 15 мл с 70% этанолом. Встраивают легкие в парафин для окрашивания гематоксилина и эозина (H&E) и иммуногистохимического анализа25.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешная ортотопическая (первичная) остеосаркома и метастатические легочные модели зависят от точной ортотопической инъекции клеток остеосаркомы. Здесь была успешно разработана модель ортотопической (первичной) остеосаркомы с помощью инъекции клеток интратибиальной остеосаркомы. На рисунке 3A показана репрезентативная мышь, несущая ортотопическую (первичную) остеосаркому, а на рисунке 3B показана репрезентативная изолированная ортотопическая (первичная)...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Ортотопическая инъекция клеток остеосаркомы является идеальной моделью для изучения функции и механизма специфических факторов канцерогенеза остеосаркомы и развития для оценки терапевтической эффективности. Чтобы избежать различий в росте опухоли, наиболее активные клетки остеосаркомы при 80%-90% слиянии с таким же количеством осторожно вводят в большеберцовую кость каждой мыши, а время трипсинизации клеток строго контролируется, не влияя на жизнеспособность клеток. Поскольку клеточные сгустки влияют на подсчет клеток, ч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами (1) Национальной ключевой программы исследований и разработок Китая (2018YFC1704300 и 2020YFE0201600), (2) Национального фонда наук о природе (81973877 и 82174408).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Автоматический счетчик клетокShanghai Simo Biological Technology Co., LtdIC1000Подсчет клеток
Аппарат для анестезииShenzhen RWD Life Technology Co., LtdR500IPОборудование для анестезии мышей
BALB/c athymic мышейShanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.
/Матрица базальной мембраныдля животных Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd356234, BD, Matrigelre-suspende
cells Биолюминесцентная система визуализацииShanghai Baitai Technology Co., LtdVieworksотслеживает рост опухоли и метастазирование в легкие, если инъекционная клетка помечена люциферазой
Центрифужная трубка (15 мл)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, Центрифуга Corningс клетками
изофлуранаШэньчжэнь RWD Life Technology Co., LtdVETEASY Анестезия мышей
MEM media ШанхайYueNian Biotechnology Co., LtdLM-E1141Среда для клеточной культуры
микрообъемный шприцШанхай высокая голубиная промышленность и торговля Co., Ltd0-50 μ LВводите точные клетки в голень
Фосфатно-солевой буферBeyotime BiotechnologyST447промывайте клетки остеосаркомы человека
1 мл шприцыShandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd20200411бурение
143B клеточная линияATCCCRL-8303клеточная линия остеосаркомы
Трипсин (0,25%)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd25200056, Gibcoлечение клеток трипсином
Trypan blueBeyotime BiotechnologyST798Окрашивание клеток для оценки вектора активности
(pLV-люцифераза)Shanghai YueNian Biotechnology Co., LtdVL3613Плазмидный
липофектамин 2000Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd11668027,Thermo fisherПлазмидный реагент для трансфекции
рентгеновская визуализация полученырентгеновские снимкиBrook (Beijing) Technology Co., LtdFX PRO
системы для выявления роста опухоли

Ссылки

  1. Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
  2. Yang, C., et al. Bone microenvironment and osteosarcoma metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), (2020).
  3. Mirabello, L., Troisi, R. J., Savage, S. A. Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program. Cancer. 115 (7), 1531-1543 (2009).
  4. Zhang, B., et al. The efficacy and safety comparison of first-line chemotherapeutic agents (high-dose methotrexate, doxorubicin, cisplatin, and ifosfamide) for osteosarcoma: a network meta-analysis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 51(2020).
  5. Tsukamoto, S., Errani, C., Angelini, A., Mavrogenis, A. F. Current treatment considerations for osteosarcoma metastatic at presentation. Orthopedics. 43 (5), 345-358 (2020).
  6. Aljubran, A. H., Griffin, A., Pintilie, M., Blackstein, M. Osteosarcoma in adolescents and adults: survival analysis with and without lung metastases. Annals of Oncology. 20 (6), 1136-1141 (2009).
  7. Ek, E. T., Dass, C. R., Choong, P. F. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
  8. Castillo-Tandazo, W., Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. Osteosarcoma in the post genome era: Preclinical models and approaches to identify tractable therapeutic targets. Current Osteoporosis Reports. 17 (5), 343-352 (2019).
  9. Mason, N. J. Comparative immunology and immunotherapy of canine osteosarcoma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1258, 199-221 (2020).
  10. Cobb, L. M. Radiation-induced osteosarcoma in the rat as a model for osteosarcoma in man. British Journal of Cancer. 24 (2), 294-299 (1970).
  11. Walkley, C. R., et al. Conditional mouse osteosarcoma, dependent on p53 loss and potentiated by loss of Rb, mimics the human disease. Genes & Development. 22 (12), 1662-1676 (2008).
  12. Entz-Werlé, N., et al. Targeted apc;twist double-mutant mice: a new model of spontaneous osteosarcoma that mimics the human disease. Translational Oncology. 3 (6), 344-353 (2010).
  13. Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
  14. Chang, J., et al. MicroRNAs for osteosarcoma in the mouse: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (51), 85650-85674 (2016).
  15. Maloney, C., et al. Intratibial injection causes direct pulmonary seeding of osteosarcoma cells and is not a spontaneous model of metastasis: A mouse osteosarcoma model. Clinical Orthopaedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
  16. Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
  17. Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected]. Cancer Metastasis Reviews. 9 (2), 149-165 (1990).
  18. Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 95-106 (2012).
  19. Sharma, S., Boston, S. E., Riddle, D., Isakow, K. Osteosarcoma of the proximal tibia in a dog 6 years after tibial tuberosity advancement. The Canadian Veterinary Journal. 61 (9), 946-950 (2020).
  20. Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C. Zebrafish as a model for human osteosarcoma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 221-236 (2014).
  21. Hu, S., et al. Cantharidin inhibits osteosarcoma proliferation and metastasis by directly targeting miR-214-3p/DKK3 axis to inactivate β-catenin nuclear translocation and LEF1 translation. International Journal of Biological Sciences. 17 (10), 2504-2522 (2021).
  22. Chang, J., et al. Polyphyllin I suppresses human osteosarcoma growth by inactivation of Wnt/β-catenin pathway in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7 (1), 7605(2017).
  23. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  24. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. , 3-18 (2014).
  25. Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).
  26. Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
  27. Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967(2015).
  28. Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (114), e54040(2016).
  29. Hildreth, B. E., Palmer, C., Allen, M. J. Modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone. Journal of Visualized Experiments. (163), e61313(2020).
  30. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. Journal of Visualized Experiments. (67), e4260(2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Внутриберибиальная инъекция клеток остеосаркомы для создания ортотопических моделей мышиной остеосаркомы и метастазов в легкие
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.