Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Здесь мы представляем протокол, описывающий вирусную трансдукцию дискретных областей мозга с оптогенетическими конструкциями, позволяющими синапсеспецифическую электрофизиологическую характеристику в острых срезах мозга грызунов.

Abstract

Изучение физиологических свойств специфических синапсов в мозге и того, как они претерпевают пластические изменения, является ключевой задачей в современной нейробиологии. Традиционные электрофизиологические методы in vitro используют электрическую стимуляцию, чтобы вызвать синаптическую передачу. Основным недостатком данного метода является его неспецифический характер; все аксоны в области стимулирующего электрода будут активированы, что затруднит приписывание эффекта конкретному афферентному соединению. Эту проблему можно преодолеть, заменив электрическую стимуляцию оптогенетической стимуляцией. Описан метод сочетания оптогенетики с записями патч-зажимов in vitro . Это мощный инструмент для изучения как базальной синаптической передачи, так и синаптической пластичности точных анатомически определенных синаптических связей и применим практически к любому пути в головном мозге. Здесь мы описываем подготовку и обработку вирусного вектора, кодирующего канально-мозговой белок, для хирургической инъекции в пресинаптическую область, представляющую интерес (медиальную префронтальную кору) в мозге грызунов и создание острых срезов нисходящих целевых областей (латеральная энторинальная кора). Также представлена подробная процедура комбинирования записей патч-зажима с синаптической активацией путем световой стимуляции для изучения краткосрочной и долгосрочной синаптической пластичности. Мы обсуждаем примеры экспериментов, которые достигают специфичности пути и клеток путем объединения оптогенетики и cre-зависимой маркировки клеток. Наконец, гистологическое подтверждение пресинаптической области, представляющей интерес, описано вместе с маркировкой биоцитина постсинаптической клетки, чтобы обеспечить дальнейшую идентификацию точного местоположения и типа клетки.

Introduction

Понимание физиологии синапсов и того, как они претерпевают пластические изменения, имеет основополагающее значение для понимания того, как мозговые сети функционируют в здоровом мозге¹ и как они неисправны при расстройствах мозга. Использование острых срезов мозга ex vivo позволяет регистрировать электрическую активность синапсов от одиночных нейронов с высоким отношением сигнал/шум с использованием записей цельноклеточных патч-зажимов. Контроль мембранного потенциала и простые фармакологические манипуляции позволяют выделить подтипы рецепторов. Эти записи могут быть сделаны с изысканной специфичностью для идентификации постсинаптического нейрона, включая ламинарное и субрегиональное положение², клеточную морфологию³, наличие молекулярных маркеров⁴, его афферентные проекции⁵ или даже если он был недавно активным⁶.

Достижение специфичности пресинаптических входов, однако, несколько сложнее. Традиционный метод использует стимулирующие электроды для возбуждения аксонов, которые работают в определенной пластине. Примером этого является гиппокамп, где локальная стимуляция в радиатном слое активирует синапсы, которые проецируются из CA3 в подполе CA1⁷. В этом случае достигается пресинаптическая специфичность, поскольку вход CA3 представляет собой единственный возбуждающий вход, расположенный внутри радиатного слоя, который проецируется на пирамидальные ячейки CA1⁸. Однако эта высокая степень входной специфичности, достижимая при обычной электрической пресинаптической активации аксонов CA3-CA1, является исключением, которое отражено в интенсивном исследовании, которому подвергался этот синапс. В других областях мозга аксоны из нескольких афферентных путей сосуществуют в одной и той же пластинке, например, в слое 1 неокортекса⁹, что делает невозможной пресинаптическую стимуляцию с помощью обычных стимулирующих электродов. Это проблематично, поскольку различные синаптические входы могут иметь расходящиеся физиологические свойства; поэтому их стимуляция может привести к неправильной характеристике синаптической физиологии.

Появление оптогенетики, генетического кодирования фоточувствительных мембранных белков (опсинов), таких как каналродопсин-2 (ChR2), позволило значительно расширить возможности для изучения изолированных синаптических проекций между областями мозга^10,11. Здесь мы описываем обобщающее и недорогое решение для изучения долгосрочной синаптической физиологии и пластичности. Оптогенетические конструкции доставляются очень специфическим образом с использованием вирусных векторов, что позволяет чрезвычайно точно контролировать пресинаптическую область, представляющую интерес. Эфферентные проекции будут выражать светоактивированный канал, позволяющий активировать эти волокна в целевой области. Таким образом, могут быть изучены дальние, анатомически диффузные пути, которые не могут быть независимо активированы традиционной, неспецифической, электрической стимуляцией.

В качестве примера мы описываем трансдукцию медиальной префронтальной коры (mPFC) аденоассоциированными вирусами (AAV), кодирующими возбуждающие катион-канальные опсины. Затем мы описываем подготовку острых срезов из латеральной энторинальной коры (LEC), записей зажимов из пирамидных нейронов LEC слоя 5 и световой активации глутаматергических проекций mPFC-LEC (рисунок 1). Мы также описываем гистологическую оценку места инъекции для подтверждения местоположения пресинаптической области, представляющей интерес, и идентификации морфологии постсинаптических клеток.

Protocol

Все процедуры для животных проводились в соответствии с Законом Соединенного Королевства о научных процедурах в отношении животных (1986 год) и связанными с ним руководящими принципами, а также местными институциональными руководящими принципами. 1. Стереотаксическая вирусная инъекция ПРИМЕЧАНИЕ: Текущий протокол требует анатомической, но не постсинаптической специфичности типа клеток. Выберите подходящее животное. В этом протоколе использовались самцы крыс с капюшоном Lister дикого типа (300-350 г, примерно 3 месяца). Выберите подходящую вирусную конструкцию. Есть несколько факторов, которые следует учитывать (см. Обсуждение). Текущий протокол использует вирус для экспрессии оптогенетического канала ChETATC12, для передачи возбуждающих нейронов (AAV9 – CaMKIIa – ChR2 (E123T / T159C) – mCherry; титр: 3,3 х 1013 вирусных геномов / мл). Установите координаты и объем инъекции с помощью атласа мозга, какописано ранее 35. Стереотаксическая инъекция вирусного препаратаПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать все соответствующие национальные и институциональные руководящие принципы использования животных и ухода за ними. Вирусные векторы стереотаксически вводятся, как описано ранее13 со следующими изменениями.Держите вирусный препарат на льду во время обезболивания и подготовки животного. Индуцировать анестезию в анестетической индукционной камере с 4% изофлураном. Контролировать уровень анестезии можно по более медленному регулярному дыханию (1 Гц) и отсутствию педальных и роговичных рефлексов (тест путем защемления пальцев ног и легкого прикосновения к уголку глаза соответственно; реакция не должна быть обнаружена). Вводите предоперационный анальгетик, такой как мелоксикам, по крайней мере, за 30 минут до инвазивной процедуры. Когда животное будет полностью обезболено, используйте кусачки, чтобы удалить шерсть с кожи головы. Переключите поток изофлурана на носовой конус стереотаксической рамки и установите крысу в кадр. Нанесите смазывающий гель для глаз на глаза, чтобы предотвратить сухость во время процедуры. Операция должна проводиться в асептических условиях. Используйте стерильные перчатки и инструменты на протяжении всей процедуры. Применяют лидокаиновую мазь (5% мас./мас.) перед дезинфекцией кожи головы 4% мас./об. раствором хлоргексидина, а затем накрывают тело стерильной драпировкой. Используя скальпель, сделайте продольный разрез длиной примерно 15 мм на коже головы, чтобы обнажить брегму. Загрузите шприц Гамильтона в микроинъекционный шприцевой насос, прикрепленный к подвижному рычагу, установленному на стереотаксической раме. Поместите 5 мкл аликвоты вируса в трубку объемом 0,2 мл и вращайте в течение нескольких секунд, пока весь объем не окажется в нижней части трубки. Пипетка 2 мкл вирусного препарата попадает в крышку пробирки. Заполните шприц вирусным препаратом, сначала рассмотрев кончик иглы хирургическим микроскопом, а затем вручную поместите болюс вируса на кончик иглы и выньте плунжер шприца с помощью органов управления насосом. Установите объем впрыска насоса на 300 нЛ и расход на 100 нл/мин. Запустите насос и подтвердите правильное течение, наблюдая за каплей вируса на кончике иглы. Впитать вирус на ватную палочку и аккуратно очистить иглу 70% этанолом. Используя винты регулятора на стереотаксической раме, перейдите кончиком иглы к брегме (точке на черепе, где встречаются корональный и сагиттальный швы) и обратите внимание на стереотаксические измерения, наблюдаемые на трех шкалах Вернье на раме. Координаты относительно брегмы крыс mPFC передне-задние + 3,1 мм, медиолатеральные ± 0,7 мм, дорсовентральные – 4,5 мм; сложите/вычтите (как указано) эти расстояния от координат брегмы, а затем переместите иглу к передне-задним и медиолатеральным координатам и осторожно опустите иглу на поверхность черепа.ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные выше координаты mPFC подходят для самцов крыс с капюшоном весом 300-350 г; изменения штамма крыс, размера могут потребовать изменения этих координат (см. Обсуждение). Поднимите иглу с поверхности черепа и отметьте эту точку перманентной маркерной ручкой с тонким наконечником. Сделайте отверстие для заусенцев в этой точке с помощью микросверла, установленного на стереотаксическом рычаге. Вводят иглу в мозг по заранее определенной дорсовентральной координате и вводят заранее определенный объем (для mPFC: 300 нЛ). Оставьте иглу на месте в течение 10 минут, чтобы обеспечить диффузию болюса. После извлечения иглы запустите насос, чтобы убедиться, что игла не заблокирована.ПРИМЕЧАНИЕ: Вставляйте и извлекайте иглу медленно (~3 мм/мин), чтобы свести к минимуму повреждение мозговой ткани и обратный поток вируса в игольчатый тракт. Вводите 2,5 мл подкожного раствора хлорида натрия (0,9% мас./об.) и глюкозы (5% мас./об.) для поддержания гидратации. Повторите шаг 1.4.12. для второго полушария. Зашить разрез кожи головы и по завершении процедуры ввести 2,5 мл раствора хлорида натрия и глюкозы и соответствующий, рекомендованный в установленном законом, анальгетик для лечения боли, например, бупренорфин или мелоксикам. Не оставляйте животное без присмотра в бессознательном состоянии. Поместите крысу в нагретую спасательную коробку до тех пор, пока она полностью не придет в сознание. Возвращайтесь в домашнюю клетку только после полного выздоровления с другими животными. Следуйте институциональным руководящим принципам послеоперационного ухода и процедур содержания инфицированных вирусом грызунов. Подождите не менее 2 недель, пока трансген опсина адекватно экспрессируется, прежде чем начинать эксперимент.ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для трансдукции, зависит от расстояния и прочности связи между пре- и постсинаптическими областями. Для перехода от mPFC к LEC требуется 4-6 недель. 2. Подготовка острых срезов мозга ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы описываем простой метод приготовления срезов мозга, которых в наших руках достаточно для получения высококачественных кортикальных, гиппокампальных и таламических срезов от взрослых мышей и крыс. Подготовьте растворы для рассечения.Наполните стакан объемом 250 мл ~200 мл ледяного раствора для резки сахарозы (189 мМ сахарозы, 26 мМ NaHCO3, 10 мМ D-глюкозы, 5 мМ MgSO4, 3 мМ KCl, 1,25 мМ2PO4 и 0,2 мМ CaCl2 , изготовленных в сверхчистой воде (UPW) с удельным сопротивлением 18,2 МОм см при 25 °C) или достаточным объемом для заполнения камеры вибратомной ткани. Пузырьки с карбогеном (95% O2, 5% CO2) и держат на льду. Наполните камеру сбора срезов искусственной спинномозговой жидкостью (aCSF; 124 мМ NaCl, 26 мМ NaHCO3, 10 мМ D-глюкозы, 3 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1,25 мМ2PO4 и 1 мМ MgSO4 , изготовленной в UPW) при комнатной температуре, пузырьков карбогеном. Камера14 для сбора срезов изготовлена на заказ из стойки для микроцентрифуги, наклеенной на лист нейлоновой сетки и помещенной в стакан, в который она погружена в aCSF (фиг.2A). Заполните трубку объемом 50 мл 4% параформальдегида (PFA) в фосфатном буфере (PB; 75,4 мМ Na2HPO 4,7H 2O и 24,6 мМ2PO4. Н2О).ВНИМАНИЕ: PFA токсичен. Используйте в вытяжном шкафу. Рассечение головного мозга.Обезболивайте крысу в индукционной камере, используя 5% изофлурана, пока дыхание не станет медленным и регулярным (~1 Гц). Для обеспечения достаточного уровня анестезии проверяют на отсутствие педальных и роговичных рефлексов. Обезглавить животное с помощью гильотины. Быстро рассекают весь мозг, как описано ранее15 и переносят в раствор сахарозы. Выполните шаг в течение 90 с после обезглавливания для хорошего качества срезов и успешной записи целых клеток. Используя металлическую чайную ложку, поднимите мозг, выбросьте лишний режущий раствор и поместите его на лист фильтровальной бумаги на столешнице. С помощью скальпеля или лезвия бритвы быстро удалить мозжечок и разрезать головной мозг в корональной плоскости примерно на полпути по его длине; задняя половина представляет собой тканевый блок LEC. Обязательно включите некоторую избыточную ткань в дополнение к области, которая будет разрезана для следующих шагов. Верните как этот тканевой блок, так и остальную часть мозга в раствор для резки сахарозы. Поместите каплю цианоакрилатного клея на стадию ткани вибратома. Распределите его тонким слоем с площадью, немного большей, чем тканевый блок, созданный на предыдущем этапе. Возьмите блок ткани LEC с помощью чайной ложки, выбросьте лишний раствор и переложите на клеевой пластырь так, чтобы передний корональный срез прилип. Установите ступень в тканевую камеру вибратома и быстро налейте достаточное количество режущего раствора сахарозы для погружения ткани; пузырьковый этот раствор с карбогеном. Направьте тканевый блок LEC вентральной поверхностью к лезвию. В то время как окружающее освещение комнаты недостаточно для активации опсина, избегайте использования дополнительных источников света, которые могут присутствовать на вибратоме. Нарезайте срезы толщиной 350 мкм от вентрального до дорсального с использованием высокой скорости колебаний лезвия (100 Гц) и медленной скорости продвижения лезвия (0,06 мм/с). Как правило, на полушарие можно получить семь срезов LEC. Перенесите ломтики в камеру сбора ломтиков. По завершении сбора срезов переведите камеру сбора на водяную баню 34 °C в течение 1 ч, прежде чем вернуться к комнатной температуре. Пузырь с карбогеном непрерывно. Ломтики будут достаточно здоровыми для записи в течение не менее 6 ч. Поместите оставшуюся часть мозга в PFA в течение 48 ч для пост-специального обследования места инъекции (см. раздел 4). 3. Электрофизиология и оптогенетическая стимуляция Идентификация клетки-мишени.Поместите срез в погружную регистрирующую камеру при 34 °C, перфузионную с aCSF со скоростью 2 мл/мин перистальтическим насосом. Обездвижите фрагмент с помощью привязки фрагмента. Под объективом с низким увеличением (4x) широкоугольного микроскопа с использованием наклонного инфракрасного освещения перейдите к уровню LEC 5. Измерьте расстояние от поверхности пиала до требуемого слоя.ПРИМЕЧАНИЕ: Косая инфракрасная подсветка была достигнута путем размещения вблизи инфракрасного светодиода примерно на 3 мм ниже крышки регистрирующей камеры под углом ~55° к плоскости крышки (рисунок 2B). Дифференциальный интерференционный контраст является альтернативным и широко используемым методом визуализации для электрофизиологии срезов. Перейдите на объектив погружения в воду с большим увеличением (40x) и определите пирамидальные нейроны. Отметьте положение ячейки на мониторе компьютера лентой.ПРИМЕЧАНИЕ: Пирамидальные нейроны имеют примерно треугольную морфологию с выдающимися апикальными дендритами, выступающими к пиальной поверхности среза (рисунок 3A). Здоровье клеток можно оценить по отсутствию конденсированного, видимого ядра и осмотру плазматической мембраны, которая должна казаться гладкой. Маловероятно, что четкая флуоресцентная маркировка аксонов белком слияния опсин-флуорофора будет видна при использовании широкопольного флуоресцентного микроскопа. Для визуализации аксональных проекций выполняют иммуногистохимию пост-хок с использованием первичного антитела против флуорофора опсина и амплируют вторичным антителом, конъюгированным с флуорофором той же или аналогичной длины волны. Формирование цельноклеточного пластыря-зажима.Изготовьте микропипетку из боросиликатного стекла с помощью съемника пипетки и заполните фильтрованным внутриклеточным регистрирующим раствором (120 мМ k-глюконата, 40 мМ HEPES, 10 мМ KCl, 2 мМ NaCl, 2 мМ MgATP, 1 мМ MgCl, 0,3 мМ NaGTP, 0,2 мМ EGTA и 0,25% биоцитина, произведенного в UPW, рН 7,25, 285-300 мОсм). Поместите заполненную микропипетку в держатель электрода на головную ступень усилителя с патч-зажимом, чтобы провод электрода контактировал с внутриклеточным раствором. Применяйте положительное давление ртом, сильно вдувая мундштук (например, шприц объемом 1 мл со снятым плунжером), соединенный трубкой со боковым портом держателя электрода, и поддерживайте давление, закрывая линейный трехсторонний клапан. Поднимите объектив микроскопа так, чтобы образовался мениск, и вставьте электрод в мениск, пока его не увидят на микроскопе. Откройте окно Seal Test в WinLTP16 (или другом программном обеспечении/осциллографе) и с усилителем в режиме зажима напряжения примените квадратный импульс 5 мВ, чтобы определить, составляет ли сопротивление пипетки 3-6 МОм. Подойдите и прикоснитесь к идентифицированной ячейке кончиком пипетки; это должно привести к углублению в клеточной мембране (рисунок 3A; правая панель) и небольшому увеличению сопротивления пипетки (0,1 МОм). Освободите положительное давление и примените отрицательное давление, применяя умеренное всасывание на мундштуке; это должно привести к значительному увеличению сопротивления пипетки (>1000 МОм). Давление теперь можно оставить нейтральным. Применяйте отрицательное давление в постепенно увеличивающейся рампе до тех пор, пока клеточная мембрана не разорвется, что приведет к переходным процессам емкости цельноклеточной клетки. Записывайте оптогенетически вызванные синаптические события.Введите конфигурацию тока-зажима.ПРИМЕЧАНИЕ: В большинстве случаев синаптическая передача на большие расстояния является глутаматергической, поэтому регистрация на мембранных потенциалах, близких к потенциалу разворота хлоридов, наилучшим образом изолирует передачу, опосредованную рецептором AMPA (AMPAR), и минимизирует измерение любого вызванного ингибирования прямой передачи (FFI). Разворот хлорида зависит от состава внутриклеточного регистрирующего раствора и aCSF и может быть рассчитан с использованием уравнения Голдмана-Ходжкина-Каца; для вышеуказанных решений это было -61,3 мВ. Пирамидальные нейроны LEC 5-го слоя имели средний мембранный потенциал покоя -62 мВ и, при необходимости, поддерживались на этом уровне путем впрыска постоянного тока. Альтернативно, ячейки могут быть зажаты напряжением до желаемого потенциала. Для регистрации ингибирующих проекций16 на большие расстояния или для регистрации FFI, зажим напряжения при потенциале разворота катионов для выделения проводимости ГАМКергического хлорида. При напряжении зажимных нейронов на мембранных потенциалах выше порога потенциала действия внутриклеточный раствор на основе цезия, содержащий блокаторы натриевых каналов с напряжением, для улучшения напряжения-зажима и предотвращения инициирования потенциалов действия (130 мМ CsMeSO4, 10 мМ HEPES, 8 мМ NaCl, 5 мМ QX 314 хлорида, 4 мМ MgATP, 0,5 мМ EGTA, 0,3 мМ NaGTP, 0,25% биоцитина, произведенного в UPW, pH 7,25, 285-300 мОсм). Используя программное обеспечение для сбора данных, отправляйте сигналы транзистор-транзисторной логики (TTL) на светодиодный драйвер для активации установленного светодиода 470 нм. Установленный светодиод направляется в световой путь микроскопа с помощью фильтрующих кубов и соответствующей оптики (рисунок 2B) для подачи световых импульсов на срез через 40-кратный объектив для вызова оптогенетических возбуждающих постсинаптических потенциалов (oEPSP).ПРИМЕЧАНИЕ: Световые импульсы могут быть применены перисоматически / над дендритами, что приведет к активации опсинов в аксонах и пресинаптическом бутоне, или исследователь может переместить цель в аксоны подальше от зарегистрированной клетки, чтобы избежать чрезмерной стимуляции бутона (см. Обсуждение). Максимальная амплитуда oEPSP зависит от силы синаптической проекции, эффективности вирусных инъекций и используемого опсина. oEPSP могут титроваться до желаемой амплитуды путем изменения интенсивности света и/или длительности18; изменение длительности световых импульсов (типичная продолжительность между 0,2-5 мс при максимальной выходной мощности светодиода, что приводит к плотности света 4,4 мВт / мм19) дает более последовательные амплитуды oEPSP, чем изменение выходной мощности светодиода. Исследовать пресинаптические свойства высвобождения (изменение напряжения) путем подачи потоков множественных световых импульсов с различными межстимульными интервалами (рисунок 3E); следует соблюдать осторожность при интерпретации оптогенетически вызванной передачи (см. Обсуждение). Исследуйте долгосрочную пластичность либо путем повторного вызова oEPSP19 , либо путем применения лигандов. Контролируйте амплитуду oEPSP в течение 5-10 мин, чтобы обеспечить стабильность до индукции пластичности, а затем контролируйте до достижения стабильной амплитуды (обычно 30-40 мин).ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство современных опсинов не способны надежно вызывать множественные потенциалы действия на высоких частотах, например, 100 стимулов, подаваемых при 100 Гц, как это обычно используется для индуцирования LTP. Чтобы подтвердить, что oEPSP являются моносинаптическими, выполните чрезмерную активацию бутона трансдуцированного пути, расположив объектив над дендритной беседкой и стимулируя в присутствии 0,5 мкМ тетродотоксина и 100 мкМ аминопиридина. Применение тетродотоксина отменит передачу, если реакции зависят от потенциала действия, а последующее включение аминопиридина частично восстановит передачу, если oEPSP генерируются моносинаптически19,20. Чтобы биоцитин заполнил нейрон, подождите не менее 15 минут после входа в полноклеточную конфигурацию. В напряжении-зажиме, контролируйте емкость мембраны и входное сопротивление. Медленно отведите пипетку вдоль угла подхода подальше от сомы клетки, наблюдая медленное исчезновение емкостных переходных процессов и мембранного тока, что указывает на повторное уплотнение клеточной мембраны и образование внешнего пятна на кончике пипетки. Обратите внимание на ориентацию фрагмента и расположение ячеек внутри фрагмента. Поместите ломтик в PFA в 24-луночную пластину и инкубируйте в течение ночи при 4 °C, а затем переведите в 0,1 М ПБ.ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагменты могут храниться до недели. Если требуется более длительное хранение, регулярно меняйте ПБ или используйте ПБ, содержащий азид натрия (0,02%-0,2% азида натрия). 4. Гистология Место нарезки инъекцииПосле фиксации криозащитите ткань в 30% сахарозе (мас./об.) в ПБ до тех пор, пока она не утонет (первоначально она будет плавать в растворе сахарозы), обычно на ночь при комнатной температуре или через 24-48 ч при 4 °C. Используя среду с оптимальной температурой резания (OCT), прикрепите блок ткани к диску образца криостата. Заморозьте тканевый блок в соответствии с шагами 4.1.3-4.1.4. Поместите изопентан в соответствующий контейнер. Погрузите только диск образца, гарантируя, что ткань находится выше уровня изопентана. Опустите контейнер изопентана в жидкий азот (или сухой лед) и дайте ткани замерзнуть. После полной заморозки (весь тканевый блок становится бледным и твердым), оставьте тканевый блок в криостатной камере при -20 ° C в течение 30 минут, чтобы температура блока уравновешивалась. Вырежьте в криостате участки толщиной 40 мкм при -20 °C. Используйте тонкую кисть, чтобы направить участки от лезвия. Приклейте замороженные срезы к комнатной температуре, с поли-L-лизином покрытием, стеклянный микроскоп скользит, касаясь слайда к секциям. Добавьте около 150 мкл монтажного носителя на каждый слайд и крышку с крышкой; удалите пузырьки воздуха, осторожно надавливая на крышку. Накройте слайды для защиты от фотоотбеливания и высушите воздухом при комнатной температуре не менее 12 ч (или ночью). Используя флуоресцентный микроскоп, исследуйте местоположение места вирусной инъекции. Протокол окрашивания биоцитиномПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть применен к толстым сечениям; срезы не нуждаются в повторном секционировании.Промывайте срезы мозга фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS; 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4 и 1,8 мМ KH2PO4) шесть раз в течение 10 мин за одну промывку. Используйте передаточную пипетку для опорожнения скважин после каждого шага. Инкубировать ломтики в 3% H2O2 (мас./об.) в PBS в течение 30 мин, чтобы блокировать любую эндогенную активность пероксидазы. При этом образуются пузырьки кислорода. Промывайте кусочки мозга PBS шесть раз в течение 10 минут за одну промывку или до тех пор, пока не будут видны новые пузырьки кислорода. Инкубируют срезы мозга в 1% (v/v) авидин-биотинилированном растворе HRP комплекса (ABC) в PBS, содержащем 0,1% (v/v) Triton X-100 при комнатной температуре в течение 3 ч. Промывайте кусочки мозга PBS шесть раз в течение 10 минут за одну промывку. Инкубируйте каждый ломтик в растворе 3,3′-диаминобензидина (DAB) в течение нескольких минут, пока не станет видно окрашивание биоцитином нейронных структур (занимает около 5-10 мин).ВНИМАНИЕ: DAB токсичен. Используйте в вытяжном шкафу.ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации DAB может быть непредсказуемым, внимательно следите за тканями по мере развития цвета. Остановите реакцию, перенеся срезы в холодные (4 °C) PBS. Промывайте кусочки мозга PBS шесть раз в течение 10 минут за одну промывку. Используйте щетку для крепления срезов мозга на стеклянные стекла микроскопа с поли-L-лизином. Удалите все излишки PBS чистой тканью. Накройте каждый срез примерно 200 мкл монтажной среды; накройте крышкой и осторожно надавите на крышку, чтобы вытолкнуть пузырьки воздуха. Высушивают на воздухе при комнатной температуре не менее 12 ч (или на ночь). Используя световой микроскоп, изучите местоположение и морфологические детали клетки (клеток).ПРИМЕЧАНИЕ: Биоцитин может быть альтернативно визуализирован с использованием флуорофор-конъюгированного стрептавидина; однако для визуализации может потребоваться резекция или использование конфокального микроскопа21.

Representative Results

В этом протоколе мы описываем, как изучать долгосрочную синаптическую физиологию и пластичность с использованием вирусной доставки оптогенетических конструкций. Протокол может быть очень легко адаптирован для изучения практически любой дальней связи в мозге. В качестве примера мы о?…

Discussion

Протокол, представленный здесь, описывает метод исследования высокоспецифичных синаптических проекций дальнего действия с использованием комбинации стереотаксической хирургии для доставки AAV, кодирующих оптогенетические конструкции, и электрофизиологии в острых срезах мозга (<strong …

Materials

0.2 mL tube	Fisher Scientific Ltd	12134102
10 µL pipette	Gilson	FD10001
24 well plate	SARSTEDT	83.3922
3 way luer valve	Cole-Parmer	WZ-30600-02
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate	Vector Laboratories	SK-4105
40x objective	Olympus	LUMPLFLN40XW
4-aminopyridine	Hello Bio	HB1073
4x objective	Olympus	PLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry	Addgene	35512	Viral titre: 3.3×1013 GC/ml
Achromatic lens	Edmund Optics	49363	Focusses visual spectrum and near-IR
Benchtop microcentrifuge	Benchmark Scientific	C1005*
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Borosillicate glass capillary	Warner Instruments	G150F-6
Burr	Fine science tools	19008-07
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
Camera – Qimaging Retiga Electro	Photometrics	01-ELECTRO-M-14-C
Carbachol	Tocris	2810
Chlorhexidine surgical scrub	Vetasept	XHG008
Clippers	Andis	22445	AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper
Collimation condenser lens	ThorLabs	ACL2520-A
Coverslips	Fisher Scientific Ltd	10011913
Cryostat	Leica	CM3050 S
CsMeSO4	Sigma-Aldrich	C1426
Cyanoacrylate glue	Rapid Electronics Ltd	84-4557
Data acquisition device	National Instruments	USB-6341 BNC
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Dichroic mirror 500 nm long-pass	Edmund Optics	69899
Dichroic mirror 600 nm long-pass	Edmund Optics	69901
Dichroic mirror cube	ThorLabs	CM1-DCH/M
EGTA	Millpore	324626
Electrode holder with side port	HEKA	895150
Emission filter	Chroma	59022m
Excitation filter	Chroma	ET570/20x
Eye gel	Dechra	Lubrithal
Fine paint brush	Scientific Laboratory Supplies	BRU2052
Guillotine	World Precision Instruments	DCAP
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009	30% (w/w)
Isoflurane	Henry Schein	988-3245
Isopentane	Sigma-Aldrich	M32631
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
k-gluconate	Sigma-Aldrich	G4500
Kinematic fluorescence filter cube	ThorLabs	DFM1T1
LED driver	ThorLabs	LEDD1B
Lidocaine ointment	Teva	80007150
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187
MgCl	Sigma-Aldrich	M2670
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Micro drill	Harvard Apparatus	75-1887
Microelectrode puller	Sutter instruments	P-87
Microinjection syringe	Hamilton	7634-01/00
Microinjection syringe needle	Hamilton	7803-05	Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 – 12°
Microinjection syringe pump	World Precision Instruments	UMP3T-1
Mounted blue LED	ThorLabs	M470L5
Mounted green LED	ThorLabs	M565L3
Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S9390
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaGTP	Sigma-Aldrich	G8877
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
NaH2PO4.H2O	Sigma-Aldrich	S9638
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
NIR LED	OSRAM	SFH4550	Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method
OCT medium	VWR International	RAYLLAMB/OCT	Optimal cutting temperature medium
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	700A
Peristaltic pump	World Precision Instruments	Ministar
Poly-L-lysine coated microscope slides	Fisher Scientific Ltd	23-769-310
Recording chamber	Warner Instruments	RC-26G
Scalpel blade	Swann Morton	#24
Slice anchor	Warner Instruments	SHD-26-GH/15
Stereotaxic frame	Kopf	Model 902
Stereotaxic holder for micro drill	Harvard Apparatus	75-1874
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Surgical Microscope	Carl Zeiss	OPMI 1 FR pro
Suture	Ethicon	W577H
Syringe filter for intracellular recording solution	Thermo Scientific Nalgene	171-0020
Tetrodotoxin citrate	Hello Bio	HB1035
Transfer pipettes	Fisher Scientific Ltd	10458842
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Upright fluorescence microscope	Leica	DM6 B
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200-10
VECTASTAIN ABC-HRP kit	Vector Laboratories	PK-4000
Vibratome	Campden Instruments	7000smz-2
WinLTP	https://www.winltp.com/	Version 2.32	Data acquisition software
Solution
aCSF
sucrose cutting solution
PFA
Intracellular?