Методическая статья

Ex Vivo Оптогенетический опрос дальней синаптической передачи и пластичности от медиальной префронтальной коры к латеральной энторинальной коре

DOI:

10.3791/63077

⸱

25 февраля 2022 г.

 , 
1School of Physiology, Pharmacology and Neuroscience, University of Bristol

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол, описывающий вирусную трансдукцию дискретных областей мозга с оптогенетическими конструкциями, позволяющими синапсеспецифическую электрофизиологическую характеристику в острых срезах мозга грызунов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение физиологических свойств специфических синапсов в мозге и того, как они претерпевают пластические изменения, является ключевой задачей в современной нейробиологии. Традиционные электрофизиологические методы in vitro используют электрическую стимуляцию, чтобы вызвать синаптическую передачу. Основным недостатком данного метода является его неспецифический характер; все аксоны в области стимулирующего электрода будут активированы, что затруднит приписывание эффекта конкретному афферентному соединению. Эту проблему можно преодолеть, заменив электрическую стимуляцию оптогенетической стимуляцией. Описан метод сочетания оптогенетики с записями патч-зажимов in vitro . Это мощный инструмент для изучения как базальной синаптической передачи, так и синаптической пластичности точных анатомически определенных синаптических связей и применим практически к любому пути в головном мозге. Здесь мы описываем подготовку и обработку вирусного вектора, кодирующего канально-мозговой белок, для хирургической инъекции в пресинаптическую область, представляющую интерес (медиальную префронтальную кору) в мозге грызунов и создание острых срезов нисходящих целевых областей (латеральная энторинальная кора). Также представлена подробная процедура комбинирования записей патч-зажима с синаптической активацией путем световой стимуляции для изучения краткосрочной и долгосрочной синаптической пластичности. Мы обсуждаем примеры экспериментов, которые достигают специфичности пути и клеток путем объединения оптогенетики и cre-зависимой маркировки клеток. Наконец, гистологическое подтверждение пресинаптической области, представляющей интерес, описано вместе с маркировкой биоцитина постсинаптической клетки, чтобы обеспечить дальнейшую идентификацию точного местоположения и типа клетки.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание физиологии синапсов и того, как они претерпевают пластические изменения, имеет основополагающее значение для понимания того, как мозговые сети функционируют в здоровом мозге1 и как они неисправны при расстройствах мозга. Использование острых срезов мозга ex vivo позволяет регистрировать электрическую активность синапсов от одиночных нейронов с высоким отношением сигнал/шум с использованием записей цельноклеточных патч-зажимов. Контроль мембранного потенциала и простые фармакологические манипуляции позволяют выделить подтипы рецепторов. Эти записи могут быть сделаны с изысканной специфичностью для идентификации постсинаптическ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры для животных проводились в соответствии с Законом Соединенного Королевства о научных процедурах в отношении животных (1986 год) и связанными с ним руководящими принципами, а также местными институциональными руководящими принципами.

1. Стереотаксическая вирусная инъекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Текущий протокол требует анатомической, но не постсинаптической специфичности типа клеток.

  1. Выберите подходящее животное. В этом протоколе использовались самцы крыс с капюшоном Lister дикого типа (300-350 г, примерно 3 месяца).
  2. Выберите подходящую вирусную конструкцию. Есть несколько ф....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе мы описываем, как изучать долгосрочную синаптическую физиологию и пластичность с использованием вирусной доставки оптогенетических конструкций. Протокол может быть очень легко адаптирован для изучения практически любой дальней связи в мозге. В качестве примера мы описываем инъекцию AAV, кодирующих опсин, в крысиный mPFC, приготовление острых срезов из LEC, записи зажимов из пирамидальных нейронов LEC слоя 5 и световой активации терминалов mPFC в LEC (рисунок 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, представленный здесь, описывает метод исследования высокоспецифичных синаптических проекций дальнего действия с использованием комбинации стереотаксической хирургии для доставки AAV, кодирующих оптогенетические конструкции, и электрофизиологии в острых срезах мозга (рисунок 1). Вместе эти методы предлагают инструменты для характеристики физиологии и пластичности схем головного мозга с высокой точностью в дальних и анатомически диффузных путях, которые ранее были недоступны с исполь.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа поддерживается грантом Wellcome 206401/Z/17/Z. Мы хотели бы поблагодарить Зафара Башира за его экспертное наставничество и доктора Клэра Бута за техническую помощь и комментарии к рукописи.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 мл тубаFisher Scientific Ltd12134102
10 & микро; L пипеткаGilsonFD10001
24-луночная пластинаSARSTEDT83.3922
3-ходовой люэровский клапанCole-ParmerWZ-30600-02
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) субстратVector LaboratoriesSK-4105
40x объективOlympusLUMPLFLN40XW
4-аминопиридинаHello BioHB1073
4x объективOlympusPLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherryAddgene35512Титр вируса: 3,3x1013 GC/ml
Achromatic lensEdmund Optics49363Фокусирует визуальный спектр и ближний инфракрасный диапазон
Настольная микроцентрифугаBenchmark ScientificC1005*
БиоцитинСигма-ОлдричB4261
Боросилликатный стеклянный капиллярWarner InstrumentsG150F-6
БоррТонкие научные инструменты19008-07
CaCl2Sigma-AldrichC5670
Камера - Qimaging Retiga ElectroPhotometrics01-ELECTRO-M-14-C
CarbacholTocris2810
Chlorhexidine хирургический скрабVetaseptXHG008
Машинки для стрижкиAndis22445AGC Super 2-Speed Съемная ножка Машинка для стрижки
Коллимация конденсорная линзаThorLabsACL2520-A
CoverslipsFisher Scientific Ltd10011913
CryostatLeicaCM3050 S
CsMeSO4Sigma-AldrichC1426
Цианоакрилатный клейRapid Electronics Ltd84-4557
Устройство сбора данныхNational InstrumentsUSB-6341 BNC
D-глюкозаSigma-AldrichG8270
Дихроичное зеркало 500 нм длиннопроходноеEdmund Optics69899
Дихроичное зеркало 600 нм длиннопроходноеEdmund Optics69901
Дихроичное зеркальное кубThorLabsCM1-DCH/M
EGTA Millpore324626
Держатель электродов с боковым портомHEKA895150
Фильтр излученияChroma59022m
Фильтр возбужденияChromaET570/20x
Гель для глазDechraLubrithal
Тонкая кисть для рисованияНаучная лаборатория Расходные материалыBRU2052
гильотиныWorld Precision InstrumentsDCAP
HEPESSigma-AldrichH3375
Раствор перекиси водородаSigma-AldrichH100930% (w/w)
ИзофлуранHenry Schein988-3245
ИзопентанSigma-AldrichM32631
KClSigma-AldrichP3911
k-глюконатSigma-AldrichG4500
Кинематический флуоресцентный фильтр кубикThorLabsDFM1T1
LED драйверThorLabsLEDD1B
Лидокаиновая мазьTeva80007150
MgATPSigma-AldrichA9187
MgClSigma-AldrichM2670
MgSO4Sigma-AldrichM7506
МикродрельHarvard Apparatus75-1887
Съемник микроэлектродовSutter instrumentsP-87
Шприц для микроинъекцийHamilton7634-01/00
Шприц для микроинъекций иглаHamilton7803-05Пользовательские характеристики: калибр 33, длина 15мм, тип острия 4 - 12°
Микроинъекционный шприцевой насосWorld Precision InstrumentsUMP3T-1
Установленный синий светодиодThorLabsM470L5
Установленный зеленый светодиодThorLabsM565L3
Na2HPO4.7H2OSigma-AldrichS9390
NaClSigma-AldrichS9888
NaGTPSigma-AldrichG8877
2PO4Sigma-AldrichS0751
2PO4.H2OSigma-AldrichS9638
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
NIR СВЕТОДИОДOSRAMSFH4550Используется для преломленной инфракрасной визуализации среза, дифференциально-интерференционно-контрастная (DIC) оптика является еще одним часто используемым методом
ОКТ-средаVWR InternationalRAYLLAMB/OCTОптимальная температура резания среда
ПараформальдегидSigma-Aldrich158127
ПараформальдегидSigma-AldrichP6148
Патч-зажимной усилительMolecular Devices700A
Перистальтический насосWorld Precision InstrumentsMinistar
Микроскоп с поли-L-лизиновым покрытием предметные стеклаFisher Scientific Ltd23-769-310
Записывающая камераWarner InstrumentsRC-26G
Лезвие скальпеляSwann Morton#24
Срез якоряWarner InstrumentsSHD-26-GH/15
Стереотаксическая рамкаKopfModel 902
Стереотаксический держатель для микродрелиHarvard Apparatus75-1874
СахарозаSigma-AldrichS0389
Хирургический микроскопCarl ZeissOPMI 1 FR pro
SutureEthiconW577H
Шприцевой фильтр для внутриклеточной записи растворThermo Scientific Nalgene171-0020
Тетродотоксина цитратHello BioHB1035
Переносные пипеткиFisher Scientific Ltd10458842
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Вертикальный флуоресцентный микроскопLeicaDM6 B
VECTASHIELD Antifade Монтажная среда с DAPIVector LaboratoriesH-1200-10
VECTASTAIN ABC-HRP kitVector LaboratoriesPK-4000
VibratomeCampden Instruments7000smz-2
WinLTPhttps://www.winltp.com/версия 2.32Программное обеспечение для сбора данных
Solution
aCSF
раствор для резки
PFA
Intracellular?
сахарозы

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
  2. Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nico....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи