Method Article

Обработка образцов протеомики дробовика автоматизирована лабораторным роботом с открытым исходным кодом

DOI:

10.3791/63092

⸱

October 28th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine-Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Biochemistry & Molecular Genetics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Consortium for Fibrosis Research & Translation, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подробный протокол и три скрипта Python предоставляются для работы роботизированной системы обработки жидкостей с открытым исходным кодом для выполнения полуавтоматизированной подготовки образцов белка для экспериментов масс-спектрометрии, охватывающих удаление моющих средств, переваривание белка и этапы обессоливания пептидов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперименты по протеомике дробовика на основе масс-спектрометрии требуют нескольких этапов подготовки образцов, включая ферментативное переваривание и очистку белка, что может занять значительные человеко-часы труда на скамейке и представлять собой источник изменчивости от партии к партии. Автоматизация лабораторий с помощью роботов-пипеток может сократить ручную работу, максимизировать пропускную способность и повысить воспроизводимость исследований. Тем не менее, высокие стартовые цены на стандартные станции автоматизации делают их недоступными для многих академических лабораторий. В этой статье описывается рабочий процесс пробоподготовки протеомики с использованием доступной системы автоматизации с открытым исходным кодом (The Opentrons OT-2), включая инструкции по настройке полуавтоматических этапов восстановления белка, алкилирования, пищеварения и очистки; а также сопутствующие скрипты Python с открытым исходным кодом для программирования системы OT-2 через интерфейс прикладного программирования.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протеомика дробовика на основе масс-спектрометрии является мощным инструментом для измерения обилия многих белков в биологических образцах одновременно. Эксперименты по протеомике с анализом биоинформатики обычно используются для выявления биомаркеров и обнаружения связанных биологических комплексов и путей, лежащих в основе патологических механизмов. Обладая высокой аналитной специфичностью и потенциальной количественной точностью, протеомика дробовика также имеет отличный потенциал для принятия исследовательскими учреждениями и диагностическими лабораториями для анализа клинических образцов без необходимости полагаться на антитела1,2.

Чтобы подготовить образцы белка для анализа протеомики дробовика, белки, извлеченные из биологических образцов (например, клеток и тканей), обычно сначала должны быть обработаны с использованием длительных протоколов, включая измерение концентрации белка в образце, снижение белка и алкилирование, а также ферментативное переваривание в пептиды. Кроме того, белки, извлеченные в общих буферах лизиса, содержащих моющие средства, часто требуют дополнительных этапов буферного обмена или удаления моющего средства перед анализом, поскольку моющее средство может мешать пищеварению трипсина и значительно ухудшать производительность последующего анализа жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC-MS / MS)3. Пептиды обычно дополнительно обессолены, высушены и восстановлены в LC-MS/MS совместимых растворителях после ферментативного сбраживания. Эти процедуры биохимии белка могут быть трудоемкими и трудоемкими. Таким образом, они продолжают ограничивать пропускную способность рабочих процессов протеомики и способствуют изменчивости получаемых данных4,5. Человеческие ошибки и предубеждения были признаны в качестве решающих факторов, влияющих на дисперсию и воспроизводимость данных6,7. Чтобы свести к минимуму человеческие ошибки в рабочих процессах масс-спектрометрической пробоподготовки, автоматизированные роботизированные системы пипетирования были использованы для повышения пропускной способности и воспроизводимости идентификации и количественной оценки белка с помощью протеомики дробовика и целевого масс-спектрометрического анализа, где такие достижения были высоко оценены как инструменты для продолжения стремления к широкому внедрению технологий протеомики в критических исследованиях и клинических условиях8, 9,10,11,12,13. Тем не менее, большинство существующих протоколов используют роботизированные платформы обработки жидкостей, которые требуют значительных инвестиций и обучения, ограничивая их полезность во многих лабораториях в академической среде или иным образом с ограниченным бюджетом.

В этой статье описывается протокол, который использует недорогую роботизированную систему обработки жидкостей с открытым исходным кодом, OT-2, для полуавтоматизации типичного рабочего процесса пробоподготовки протеомики дробовика. OT-2 имеет более низкую стоимость, чем многие другие роботизированные системы обработки жидкостей, и на момент написания статьи стоил примерно 5000 долларов США. Если учесть цены на различные модули и лабораторное полотно, общая стоимость проведения экспериментов по этому протоколу на момент написания статьи составляет около 10 000 долларов США, что делает его более доступным для значительно более широкого круга лабораторий по сравнению с более дорогими вариантами. OT-2 совместим с программированием с открытым исходным кодом с помощью скриптов Python и предлагает большую гибкость в разработке пользовательского протокола DIY. Используя три собственных сценария, приведенные ниже протоколы охватывают выполнение типичного рабочего процесса пробоподготовки протеомики дробовика на станции OT-2 с архетипичным стандартом белка (бычий сывороточный альбумин; BSA) и сложный образец белка нормального лизата сердца человека (рисунок 1). Процедуры обработки (1) образца BSA и (2) сложного образца лизата сердца подробно описаны в разделах Протокола 1, 2, 5, 6 и 3, 4, 5, 6 соответственно. Модифицированные карбоксилатом магнитные шарики Sera-Mag используются в однофазной твердофазной пробоподготовке (SP3) для удаления моющих средств и солей из белковых и пептидных образцов. Триптические дигесты из бычьего сывороточного альбумина и сердечных белков человека дополнительно очищаются шариками SP3 и представляются для анализа LC-MS / MS. Затем масс-спектры анализируются с использованием программного обеспечения MaxQuant для идентификации пептидов и белков. Репрезентативные результаты, выполненные нами, показывают, что протокол достигает отличных технических коэффициентов вариации (CV) при экономии времени стенда и не уступает ручному дайджесту.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разработанные скрипты Python были размещены на GitHub по адресу: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Копия скриптов приведена в дополнительном файле 1. Пожалуйста, обратитесь к репозиторию GitHub для получения последних версий.

1. Экспериментальные препараты

  1. Проверьте необходимое оборудование перед запуском протокола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Требуются следующие аппаратные компоненты: пипетки OT-2, наконечники пипеток, набор трубчатых стоек 4-в-1, комплект алюминиевых блоков, магнитный модуль, температурный модуль, пластины скважин глубиной 96 мл 2 мл (см. Таблицу материалов).

2. Масс-спектрометрия (МС) пробоподготовка с одним белком бычьего сывороточного альбумина (BSA)

  1. Откройте сценарий NoSP3_digestion.py в текстовом редакторе и укажите переменные для конкретного эксперимента в разделе НАСТРОЙКА ТОЛЬКО ЗДЕСЬ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Переменные, специфичные для эксперимента, включают количество выборок и репликацию; концентрация пробы; объем реагентов дитиотрейтола – ДТТ, йодоацетамида – ИАА, трипсина; время инкубации DTT и IAA, а также начальный наконечник для пипетки P20/P50 и P300).
    1. Откройте приложение Opentrons и загрузите скрипт на вкладку PROTOCOL в приложении Opentrons.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приложение Opentrons можно загрузить из Reference14 на локальный компьютер. На момент написания статьи электронная пипетка Opentrons P50 недоступна для покупки в магазине Opentrons. Она была заменена одноканальной электронной пипеткой P20, совместимой с объемами, указанными в протоколе. В сценарии были сделаны примечания и инструкции по замене пипетки P50 на пипетку P20. Пользователям может потребоваться протестировать и проверить совместимость конкретной пипетки с этим протоколом в соответствии с инструкцией Opentrons API.
  2. Откройте вкладку ROBOT и выполните калибровку колоды роботов Calibrate Deck на вкладке ROBOT , следуя пошаговым инструкциям на экране в приложении Opentrons.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг требуется только в том случае, если он не был ранее реализован или робот недавно был перемещен.
  3. Нажмите кнопку MANAGE PIPETTES, чтобы выполнить калибровку длины наконечника, а затем калибровку смещения пипетки для калибровки положения наконечника и пипетки по умолчанию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим, если пипетка используется впервые.
  4. Поместите необходимую лабораторную посуду и пипетки в соответствующее место в колоде OT-2, указанной в скрипте Python (рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что температурный модуль подключен и включен, а алюминиевый блок размещен поверх температурного модуля.
  5. Откройте вкладку CALIBRATE и выполните калибровку для комбинации лабораторного ПО и пипеток, необходимых в этом скрипте python.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приложение Opentrons будет записывать параметры калибровки, что не является необходимым для будущих применений с той же лабораторной посудой и пипетками.
  6. Готовят 5 мл раствора бикарбоната аммония (АВС) (рН ~ 8,0) емкостью 100 мМ, растворив 39,53 мг АВС в воде масс-спектрометрического класса до общего объема 5 мл в конической трубке объемом 15 мл. Поместите буфер бикарбоната аммония в скважину А1 трубчатой стойки 4-в-1 с верхней частью держателя трубки 15 мл + 50 мл.
  7. Приготовьте 1 мл белка бычьего сывороточного альбумина (BSA) в пробирке с низким связыванием белка 2,0 мл (см. Таблицу материалов). Поместите образец в колодец формата А1 стойки для труб 4-в-1 с верхней частью держателя трубки объемом 2 мл.
  8. Вручную поместите белковые трубки с низким связыванием 2,0 мл в скважины A1, B1, C1, D1, E1, F1, A2 и т. Д. В алюминиевый блок поверх температурного модуля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Роботизированная пипетка будет распределять образцы в вертикальном порядке, начиная с A1 (первый образец) до последнего образца по умолчанию. Горизонтальное дозирование может быть указано. Подробности см. в разделе15 . Общее число пробирок, которые необходимо подготовить, должно равняться общему числу образцов (т.е. числу биологических образцов, умноженному на количество технических реплик на образец).
  9. Приготовьте 1 мл 60 мМ DTT путем растворения 9,26 мг твердых веществ DTT в воде масс-спектрометрии до общего объема 1 мл. Поместите DTT в колодец A6 трубчатой стойки 4-в-1 с верхней частью держателя трубки 2 мл.
    ВНИМАНИЕ: DTT вреден для глаз, кожи и дыхательной системы человека. Носите СИЗ и обращайтесь с ними под химическим капотом. Обратитесь к паспорту безопасности производителя для надлежащих процедур.
  10. Наблюдайте, как робот передает соответствующий объем буфера ABC в пробоотборники в алюминиевом блоке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем ABC и белковой смеси в каждой пробирке составляет 100 мкл, а объем буфера ABC рассчитывается в скрипте (V = 100 мкл минус объем 100 мкг образца белка).
  11. Убедитесь, что робот передает 100 мкг белка BSA в каждую трубку с буфером ABC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный эксперимент может использовать до 100 мкг белков для переваривания белка, т.е. 50 мкл 2,0 мкг/мкл для этого образца BSA.
  12. Вручную убедитесь, что программа робота приостановлена и отображает сообщение: Убедитесь, что DTT загружен в A6 стойки 2 мл, расположенной в слоте 4, прежде чем возобновить протокол. Убедитесь, что трубка DTT помещена в колодец A6 и откройте его крышку. Нажмите кнопку «Возобновить» в приложении Opentrons, чтобы продолжить. Убедитесь, что робот передает 10 мкл раствора DTT в каждую пробную скважину, а затем пять раундов смешивания.
  13. Убедитесь, что программа робота приостановлена и отображает сообщение: Убедитесь, что крышки на пробках закрыты. Вручную закройте колпачки трубок и нажмите « Возобновить», чтобы продолжить. Подождите, пока температурный модуль робота не начнет нагревать алюминиевый блок, пока температура не достигнет 55 ° C, а затем 5-минутная инкубация, чтобы позволить образцам достичь 55 ° C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Робот будет удерживать температуру на уровне 55 ° C в течение 30 минут, чтобы обеспечить снижение белка С помощью DTT во время инкубации.
  14. В течение 30 мин инкубации DTT приготовьте 1 мл 187,5 мМ йодоацетамида (IAA), растворив 34,68 мг IAA в буфере ABC до общего объема 1 мл. Вручную оберните раствор IAA алюминиевой фольгой, чтобы избежать воздействия света.
    ВНИМАНИЕ: IAA может вызвать сильное раздражение глаз и дыхательных путей. Обрабатывайте его под химическим капюшоном, надевая надлежащие СИЗ.
  15. Убедитесь, что температурный модуль робота охлаждается после завершения 30-минутного этапа инкубации DTT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как температура модуля достигнет 22 °C, модуль поддерживает температуру в течение 5 минут, чтобы позволить образцам полностью остыть.
  16. Снимите крышку пробирок, когда программа робота приостановлена, и отобразите предупреждающее сообщение: Убедитесь, что крышки на пробках открыты. Нажмите « Возобновить», чтобы продолжить.
  17. Вручную убедитесь, что программа робота приостановлена с предупреждающим сообщением: Убедитесь, что IAA загружена в B6 стойки 2 мл, расположенной в слоте 4, прежде чем возобновить протокол. Подтвердите расположение трубки IAA в стойке и откройте крышку трубки. Нажмите « Возобновить», чтобы продолжить. Убедитесь, что робот передает 10 мкл IAA в каждую пробку с последующим пятью раундами смешивания.
  18. Закройте пробирки, когда программа робота приостановлена, и отобразите сообщение: Закройте колпачки на пробирках для образцов и накройте пробирки фольгой. Накройте весь алюминиевый блок чистым куском фольги. Нажмите « Возобновить», чтобы продолжить. Подождите, пока образцы не будут инкубированы при 22 °C в течение 30 минут. Убедитесь, что температурный модуль робота деактивируется по завершении инкубации IAA.
  19. Приготовьте смесь раствора трипсина во время инкубации IAA (стадия 2.19) в конечной концентрации 0,2 мкг/мкл: растворите 20 мкг масс-спектрометрии/трипсина класса секвенирования в 100 мкл воды класса MS.
  20. Поместите раствор трипсина в колодец C6 стойки для трубок объемом 2 мл с открытой крышкой трубки, когда программа робота приостановлена, и отобразите предупреждающее сообщение: Убедитесь, что трипсин был загружен в C6 стойки для трубок объемом 2 мл, расположенной в слоте 4, до возобновления протокола. Нажмите «Возобновить», чтобы продолжить.
  21. Убедитесь, что программа робота приостановлена и отображает предупреждающее сообщение: Откройте колпачки на пробках на температурном модуле. Снимите крышку пробирок и нажмите «Возобновить», чтобы продолжить. Подождите, пока робот переносит 10 мкл трипсина в каждую пробку, а затем пять раундов смешивания.
  22. Оберните крышки пробок парафиновой пленкой, перенесите все образцы в смеситель с контролируемой температурой и инкубируйте при 37 °C в течение 16-20 ч с встряхиванием 600 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сбраживание трипсина также может быть выполнено непосредственно на температурном модуле при 37 °C.

3. Пептидная очистка с использованием парамагнитных шариков SP3

  1. На следующий день после ночного переваривания трипсина кратковременно раскрутите образцы с помощью настольной микроцентрифуги (≤2000 х г) (см. Таблицу материалов) и поместите образцы на стойку с магнитной трубкой. Дайте образцам постоять в течение 2 минут.
    1. Осторожно перенесите супернатант пипеткой в новый набор белковых микроцентрифуг с низким связыванием. Храните образцы в холодильнике и переходите к шагам 3.2-3.9.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного хранения храните образцы при -80 °C.
  2. Откройте скрипт SP3_peptide_cleanup.py Python в текстовом редакторе и укажите при необходимости в разделе НАСТРОИТЬ ТОЛЬКО ЗДЕСЬ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Переменные, специфичные для эксперимента, включают количество образцов и реплик, объем переносимых пептидов, объем реагентов (шарики, ацетонитрил, ДМСО), начальный наконечник для пипеток P20/P50 и P300 и начальный колодец в пластине глубокой скважины на магнитном модуле. Каждый образец дайджеста BSA содержит около 120 мкл объема пищеварения, который будет аликвотирован в две технические реплики с 55 мкл в каждой реплике. Чтобы очистить только половину дайджеста, измените переменную replicate number на 1.
  3. Загрузите скрипт на вкладку ПРОТОКОЛ в приложении Opentrons .
  4. Поместите необходимую лабораторную посуду и пипетки в соответствующее место в колоде OT-2, указанной в скрипте Python (рисунок 3). Убедитесь, что магнитный модуль включен и подключен к роботу. Поместите новую плиту скважины глубиной 2 мл 96 скважин (см. Таблицу материалов) на верхнюю часть магнитного модуля.
  5. Откройте вкладку CALIBRATE и выполните калибровку для комбинации лабораторного ПО и пипеток, необходимых в этом скрипте Python.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка для одной и той же комбинации лабораторной посуды и пипетки должна быть выполнена только один раз, и приложение Opentrons запишет параметры калибровки.
  6. Поместите переваренные образцы (супернатант, собранный на стадии 3.1) в трубчатую стойку объемом 2,0 мл в вертикальном порядке в скважинах A1, B1....
  7. Подготовьте 15 мл LC-MS/MS-совместимого ацетонитрила в конической трубке объемом 50 мл и поместите трубку в скважину A3 в стойку для труб 4-в-1 с верхней частью держателя трубки 15 мл + 50 мл.
  8. Приготовьте 5 мл 2% ДМСО, добавив 100 мкл ДМСО с масс-спектрометрической водой 4,9 мл в конической пробирке объемом 15 мл. Поместите трубу в колодец А1 в стойку трубы 15 мл + 50 мл.
  9. Пометьте пустую коническую трубу объемом 50 мл как отходы и поместите ее в скважину B3 в трубную стойку объемом 15 мл + 50 мл.
  10. Подготовьте бусины пакета обновления 3 (SP3) в соответствии со ссылкой 16.
    1. Приготовьте соответствующее количество смешанных шариков в микроцентрифужной пробирке объемом 2,0 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая реакция очистки пептидов требует 10 мкл смешанных шариков. Например, приготовьте не менее 40 мкл смешанных шариков для четырех реакций очистки.
    2. Дайте бисерной смеси постоять на магнитной подставке в течение 2 минут. Осторожно удалите супернатант пипеткой и измерьте объем супернатанта пипеткой.
    3. Рассчитайте оставшийся объем шариков и добавьте в 5-10 раз больше масс-спектрометрической воды (например, 100-200 мкл воды на 20 мкл бусин) и вихревой (скорость 10) в течение 10 с. Посадите бусины на магнитную подставку на 2 мин.
    4. Повторите шаги промывки водой в общей сложности для трех стирок.
    5. Повторно суспендировать конечные шарики в воде ms-класса до конечной концентрации 50 мкг/мкл. Поместите промытые магнитные шарики в скважину A6 в трубчатую стойку объемом 2,0 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шарики рекомендуется повторно суспендировать в концентрации 10 мкг/мкл16. В текущих усилиях по оптимизации конечную концентрацию модифицировали до 50 мкг/мкл, чтобы свести к минимуму общий объем смеси шарик-пептид-ацетонитрил.
  11. Убедитесь, что робот передает 55 мкл переваренных образцов в скважины в глубоких пластинах скважины на магнитном модуле.
  12. Убедитесь, что протокол робота приостановлен и отображает сообщение: Перед возобновлением протокола убедитесь, что подготовленные бусины загружены в A6 стойки для трубок объемом 2 мл, расположенной в слоте 4. Вихрьте бусины, а затем ненадолго открутите вниз в течение 5 с на мини-настольной центрифуге и поместите бусины в колодец A6 стойки для трубок объемом 2 мл с открытой крышкой. Подождите, пока робот смешивает бусины 10 раз в течение пяти раундов, пипеткой вверх и вниз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Робот передает 10 мкл шариков в каждый переваренный образец в пластинах глубокой скважины с последующим пятикратным перемешиванием.
  13. Убедитесь, что робот переносит 1 292 мкл ацетонитрила в каждую лунку и сразу же перемешивается 10 раз путем пипетки вверх и вниз, чтобы облегчить связывание пептидов и шариков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая передача выполняется в течение нескольких раундов, потому что пипетка P300 может передавать только до 300 мкл за раз.
  14. Убедитесь, что робот смешивает все образцы пять раз, пипетируя вверх и вниз в пластине глубокой скважины.
  15. Подождите, пока магнитный модуль не будет включен и образцы будут инкубированы на модуле в течение 2 минут.
  16. В режиме ожидания, пока скорость аспирации и дозирования пипетки замедляется на уровне 25 мкл/с при значении по умолчанию 150 мкл/с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Робот медленно удаляет супернатант из каждой скважины и выбрасывает его в трубку для отходов, пока задействован магнитный модуль.
  17. Подождите, пока скорости аспирации и дозирования пипетки не вернутся к настройкам по умолчанию. Обратите внимание, что магнитный модуль отключается.
  18. Убедитесь, что программа робота приостановлена и отображает сообщение: Убедитесь, что крышка трубки ACN выключена. Вручную снимите крышку ацетонитриловой трубки и поместите ее обратно в стойку для труб. Нажмите « Возобновить», чтобы продолжить. Убедитесь, что робот передает 1 мл ацетонитрила для промывки каждого образца и сразу же перемешивается 10 раз.
  19. Убедитесь, что робот смешивает все образцы 10 раз, чтобы промыть образцы.
  20. Подождите, пока задействован магнитный модуль, и инкубируйте образцы в течение 2 минут.
  21. Подождите, пока робот не изменит скорость аспирации пипетки на медленную и медленно удалит супернатант и выдаст его в трубу для отходов.
  22. Наблюдайте, пока робот инкубирует образцы на магнитном модуле в течение 60 с, чтобы позволить остаточному ацетонитрилу испариться, а затем изменяет скорости аспирации пипетирования обратно к умолчанию. Обратите внимание, что магнитный модуль отключается.
  23. Убедитесь, что программа робота приостановлена и отображает сообщение: Vortex DMSO снова и откройте колпачки. Вручную вихрьте 2% DMSO в течение 10 с и поместите его обратно в скважину A1 в стойку трубы 15 мл-50 мл. Нажмите « Возобновить», чтобы продолжить.
  24. Убедитесь, что робот передает 80 мкл 2% DMSO в каждую скважину и сразу же перемешивается 10 раз.
  25. Убедитесь, что робот смешивает все образцы 10 раз в течение дополнительных пяти раундов.
  26. Подождите, пока задействован магнитный модуль, и инкубируйте образцы в течение 2 минут.
  27. Наблюдайте, как робот изменяет скорость аспирации пипетки на медленную (25 мкл/с) и медленно переносит супернатант в пустые скважины в пластине глубокой скважины.
  28. Подождите, пока робот инкубирует образцы на магнитном модуле в течение 2 минут, чтобы удалить остаточные шарики в образцах.
  29. Убедитесь, что программа робота приостановлена и отображает сообщение: Поместите новые трубки 2 мл в стойку для трубок 2 мл и убедитесь, что количество труб соответствует общему количеству образцов.
  30. Поместите первую микроцентрифужную трубку объемом 2 мл в скважину непосредственно после окончательного образца BSA. Нажмите « Возобновить», чтобы продолжить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, шесть образцов дайджеста BSA, протестированных в соответствии с этим протоколом, находятся в скважинах A1, B1, C1, D1, A2 и B2. Поэтому новый комплект труб по 2,0 мл размещен в скважинах B3, C3, D3, ... и так далее.
  31. Наблюдайте, как робот передает 88 мкл образцов из скважин в плите глубокой скважины в новый набор трубок объемом 2,0 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Передаваемый объем (1,1 x 80 мкл) в протоколе оптимизирован для обеспечения того, чтобы весь объем образца был аспирирован в наконечники пипетки.
  32. Подождите, пока робот изменяет скорость аспирации пипетки по умолчанию и отключает магнитный модуль.
  33. Вручную высушите очищенные пептиды в вакуумном испарителе (см. Таблицу материалов) и перейдите к разделу 5 или храните высушенные образцы при -20 °C.

4. Пробоподготовка MS с белковым лизатом сердца человека (5 мг/мл) с парамагнитными шариками SP3

  1. Откройте скрипт SP3_digestion.py Python и укажите значения переменных в разделе НАСТРОИТЬ ЗДЕСЬ ТОЛЬКО.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Переменные включают количество образцов и репликаций, концентрацию образца, объем реагентов (DTT, IAA, трипсин, шарики, 100% и 80% этанол), время инкубации DTT и IAA, стартовый наконечник для пипеток P20/P50 и P300 и начало скважины в пластине глубокой скважины на магнитном модуле.
  2. Выполните шаги 2.2-2.23 в разделе 2 для пробоподготовки MS с одним белком бычьего сывороточного альбумина для инкубации DTT и IAA. Обратитесь к рисунку 1 для настройки колоды роботов на этих шагах.
  3. Приготовьте свежую смесь шариков SP3 (20 мкл шариков на реакцию очистки) для очистки белка (как указано на этапе 3.10) на этапах инкубации DTT и IAA (этапы 2.15 и 2.19). Поместите бусины в колодец D6 на стойку для трубок объемом 2 мл.
  4. Убедитесь, что программа робота приостановлена с сообщением: Открыть крышки трубок. Вручную снимите крышку пробоотборников в алюминиевом блоке поверх температурного модуля и нажмите «Возобновить», чтобы продолжить.
  5. Убедитесь, что робот передает все образцы из трубок объемом 2,0 мл на новую пластину глубокой скважины поверх магнитного модуля.
  6. Убедитесь, что программа робота приостановлена и отображает сообщение: Убедитесь, что подготовленные бусины были загружены в D6 стойки 2 мл, расположенной в слоте 4, до возобновления протокола. Откройте крышку бусин и нажмите « Возобновить», чтобы продолжить.
  7. Наблюдайте, как робот переносит 20 мкл шариков в каждую скважину в пластине глубокой скважины с пятью раундами смешивания шариков и пятью раундами смешивания смеси пробы и шариков.
  8. Убедитесь, что программа робота приостановлена и отображает сообщение: Убедитесь, что 100-процентный этанол был загружен в A3 трубчатой стойки объемом 15 мл-50 мл, расположенной в слоте 5, до возобновления протокола. Приготовьте 10-20 мл 100% этанола (т.е. 200 пробного этанола, см. Таблицу материалов) в коническую трубку объемом 50 мл и поместите ее в колодец формата А3 стойки. Нажмите « Возобновить», чтобы продолжить.
  9. Подождите, пока робот переносит 140 мкл 100% этанола в каждую скважину в пластине сразу после 10 раундов смешивания, чтобы облегчить связывание пептидов с шариками.
  10. Убедитесь, что робот смешивает каждый образец, пипетируя вверх и вниз 10 раз каждый раунд в общей сложности пять раундов смешивания.
  11. Подождите, пока задействован магнитный модуль, и инкубируйте образцы на модуле в течение 2 минут.
  12. Наблюдайте, как робот изменяет скорость пипетки на медленную (25 мкл / с) и аспирирует супернатант из каждой скважины и дозирует его в трубу для отходов.
  13. Подождите, пока робот не изменит скорость пипетки обратно на стандартную и отключит магнитный модуль.
  14. Убедитесь, что программа робота приостановлена и отображает сообщение: Убедитесь, что 80 процентов этанола было загружено в A4 из стойки трубки объемом 15 мл-50 мл, расположенной в слоте 5, до возобновления протокола. Вручную готовят 20 мл 80% этанола, смешивая 4 мл воды MS-класса с 16 мл 100% этанола (т.е. 200 проб). Поместите 80% этанола в колодец формата А4 в стойку для труб. Нажмите « Возобновить», чтобы продолжить. Убедитесь, что робот переносит 1 мл 80% этанола в каждую скважину и сразу же перемешивается 10 раз.
  15. Наблюдайте, как робот изменяет скорость дозирования на медленную (25 мкл / с), аспирирует супернатант из каждой скважины и дозирует в трубу для отходов. Подождите, пока робот не изменит скорость пипетки обратно на стандартную и отключит магнитный модуль.
  16. Откройте колпачок решения ABC, когда программа робота приостановлена, и отобразите сообщение: Открыть колпачок на трубке ABC. Нажмите « Возобновить», чтобы продолжить. Подождите, пока робот отключает магнитный модуль, передает 250 мкл ABC в каждую скважину и сразу же перемешивается в течение 10 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг заключается в промывке образцов с помощью ABC.
  17. Убедитесь, что робот задействует магнитный модуль и инкубирует образцы на модуле в течение 2 минут.
  18. Наблюдайте, как робот изменяет скорость дозирования на медленную (25 мкл /с) и переносит супернатант из каждой скважины в трубу для отходов. Подождите, пока робот передаст 100 мкл буфера ABC в каждую скважину и сразу же перемешает 10 раз.
  19. Убедитесь, что программа робота приостановлена и отображает сообщение: Убедитесь, что новые трубки для сбора были помещены в алюминиевый блок объемом 2,0 мл перед возобновлением протокола. Поместите новый набор микроцентрифужных трубок с низким удержанием белка в алюминиевый блок сразу после последней пробои для отбора проб, первоначально в блоке. Нажмите « Возобновить», чтобы продолжить. Подождите, пока робот передает каждый образец в буфере ABC в новые пробирки объемом 2,0 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осмотрите скважины и вручную перенесите любой остаточный образец в пробирки, если это необходимо.
  20. Подготовьте соответствующее количество трипсина MS-класса (10 мкл на образец), растворив 20 мкг трипсина MS-класса в воде ms-класса до конечной концентрации 0,2 мкг/мкл, когда программа робота приостановлена и отображает сообщение: Убедитесь, что трипсин (0,2 мкг/мкл) был загружен в C6 из 2 мл трубчатой стойки, расположенной в слоте 4, до возобновления протокола. Убедитесь, что робот передает 10 мкл трипсина в каждую пробирку, а затем пять раундов перемешивания.
  21. Оберните крышки пробирок парафиновой пленкой, перенесите все образцы в смеситель с контролируемой температурой и инкубируйте при 37 °C в течение 16-20 ч с встряхиванием 1000 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется выполнять пищеварение с встряхиванием 1000 об/мин, чтобы свести к минимуму выпадение шариков во время ночной инкубации.

5. Очистка пептидов с помощью парамагнитных шариков SP3

  1. Следуйте пошаговым инструкциям в шаге 2, Очистка пептидов с помощью парамагнитных шариков SP3.

6. Жидкостная хроматография и масс-спектрометрия

  1. Повторное суспендирование пептидов BSA (этапы 2-3) и лизата сердца (этап 4) в 0,1% муравьиной кислоты путем добавления 1 мл LC-MS 99% муравьиной кислоты в воду MS до общего объема 1 л.
    ВНИМАНИЕ: Муравьиная кислота является сильной кислотой. Он сильно разъедает глаза, кожу и дыхательную систему. Обращайтесь с осторожностью под химическим капюшоном с СИЗ.
  2. Количественно оцените концентрацию пептидов после переваривания с помощью количественного набора пептидного анализа17 и введите 0,5 мкг BSA digest и 1,5 мкг сердечного переваривания для анализа LC-MS / MS.
  3. Настройка программы жидкостной хроматографии для анализа LC-MS/MS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В типичной установке пептидные дайджесты могут быть загружены в колонку C18 с обратной фазой (частица 3 мкм; 100 пор Å; 75 мкм x 150 мм; см. Таблицу материалов) с использованием параметров, указанных в дополнительном файле 2.
  4. Получение данных протеомики дробовика с помощью масс-спектрометра (см. Таблицу материалов) с использованием параметров, указанных в Дополнительном файле 3.
  5. Выполните поиск в базе данных белков для идентификации белка.
    1. Загрузите и установите необходимое программное обеспечение MaxQuant.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение MaxQuant (v.1.6.10.43) использовалось здесь для следующих шагов (см. Таблицу материалов).
    2. Загрузите кураторскую базу данных протеомов человека из высококачественной базы данных последовательностей белков (UniProt/SwissProt) (см. Таблицу материалов). Нажмите на кнопку Загрузить и выберите FASTA (канонический)..
      ПРИМЕЧАНИЕ: При желании загрузите FASTA (неканонический), чтобы включить изоформы белка каждого гена в базу данных.
    3. В программном интерфейсе MaxQuant укажите файл FASTA, который будет использоваться в качестве базы данных белка, перейдя на панель Глобальные параметры и перейдя на вкладку Последовательности ; затем нажмите на кнопку Добавить , чтобы указать путь к файлу FASTA.
    4. В программном интерфейсе MaxQuant укажите полученные файлы необработанного массового спектра для анализа, перейдя на панель «Необработанные данные », нажав кнопку «Загрузить» и выбрав необработанные файлы.
    5. Настройте параметры поиска, как показано в таблице 1. При необходимости включите количественную оценку без меток (LFQ).
    6. Дождитесь завершения поиска и найдите количество совпадений пептидного спектра (PSM), которые превышают пороговые значения FDR 1% в файле msms.txt в папке /combined/txt.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В сравнениях, выполненных здесь для репрезентативного раздела результатов, PSM, сопоставленные с несколькими белками, были отфильтрованы, а PSM, сопоставленные с одним уникальным белком, были сохранены для подсчета количества PSM, пептидов и белков (Рисунок 4 и Рисунок 5).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлены три скрипта Python, совместимые с роботом OT-2 и выполняющие пробоподготовку для протеомики масс-спектрометрии с одним белком стандартного бычьего сывороточного альбумина (технические реплики n = 5 диверсий) и моющим средством, содержащим образец лизата сердца человека (n = 5 диверсий). Каждый продукт переваривания разделяется на две реакции очистки пептидов. Количество идентифицированных совпадений пептидного спектра (PSM), пептидов и белков в каждом прогоне образцов BSA и сердца показано

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические шаги в рамках протокола
Для достижения наилучшей производительности следует использовать проверенную Opentrons лабораторную посуду, модули и расходные материалы, совместимые с OT-2. Пользовательское лабораторное ПО может быть создано в соответствии с инструкцией Opentrons в Reference14. Обязательно откалибруйте палубу OT-2, пипетки и лабораторную посуду при первом использовании. Также важно следовать рекомендациям производителя бусин SP3 для подготовки бусин для очи...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов, которые можно было бы декларировать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана наградами NIH F32-HL149191 YH; R00-HL144829 в EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 в MPL. Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3 создаются с помощью веб-инструмента научной иллюстрации, BioRender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
300 &микро; L наконечники для пипетокOpentrons
Каждый набор включает в себя 2 базовые стойки и 4 верхних держателя пробирок 1,5 мл, 2 мл, 15 мл + 50 мл, 15 мл и 50 мл. В этом исследовании мы используем верхние части 2 мл и 15 мл + 50 мл.
Acclaim PepMap 100 C18 Колонна для ВЭЖХThermo Scientific#1645683 μ частица m; 100 & Аринг; пора; 75 μ m x 150 мм
Ацетонитрил LC-MS маркиVWR
Набор алюминиевых блоковOpentronsЭтот набор блоков включает в себя 3 крышки, совместимые с 96-луночными пробирками, 2,0 мл и ПЦР-полоску для использования с температурным модулем OT-2. В этой рукописи мы используем держатель пробирки объемом 2,0 мл.
Бикарбонат аммонияSigma-Aldrich# A6141
Бычья сыворотка Альбумин стандартный, 2 мг/мл ThermoScientific#23210
Диметилсульфоксид (DMSO) LC-MS gradeThermo Scientific#85190
ДитиотреитолSigma-Aldrich#D5545
EASY-Spray Колонки ВЭЖХThermo Scientific#ES800A
EasynLC 1200 Nano LCThermo Scientific#LC140
Этанол Proof 195-200Fisher#04-355-720
Муравьиная кислота LC-MS классаThermo Scientific#85178
Лизат сердца человекаNovus BiologicalsNB820-59217
ЙодоацетамидSigma-Aldrich#I1149
Магнитная трубка для штативаThermo Scientific#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 Mini CentrifugeThermo Scientific#75004061настольная мини-центрифуга для быстрого вращения
NEST 2 мл 96-Well Deep Well Plate, V BottomOpentrons
OT-2 магнитный модульOpentronsGEN1
OT-2 P300 одноканальный пипеткаOpentronsGEN1
OT-2 P50 одноканальный пипеткаOpentronsGEN1
OT-2
OT-2 температурный модульOpentronsGEN1
Pierce Количественный колориметрический пептидный анализThermo Scientific#23275
Пробирки Protein LoBind 2,0 млEppendorf#022431102
База данных последовательностей белковUniProt/SwissProthttps://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640%
20рассмотрено:да
sera-mag speedbead карбоксилат-модифицированные магнитные частицы, гидрофобнаяцитива#65152105050250
sera-mag speedBead карбоксилат-модифицированные магнитные частицы, ГидрофильнаяCytiva#45152105050250
SpeedVacThermo ScientificВакуумный испаритель
Thermo Q Exactive HF Масс-спектрометрThermo Scientific#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Трипсин MS GradeThermo Scientific#90057
Вода LC-MS маркаVWR#BDH83645.400
4-в-1 набор штатива для пробирок Opentrons #JT9829 OT-2 робот-пипетка Opentrons

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942(2017).
  2. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
  3. Yeung, Y. -G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
  4. Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
  5. Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
  6. Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
  7. Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
  8. van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
  9. Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111(2020).
  10. Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
  11. Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
  12. Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
  13. Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
  14. Web URL. , Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021).
  15. Web URL. , Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021).
  16. Web URL. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021).
  17. Web URL. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021).
  18. Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Shotgun ProteomicsSample PreparationLab AutomationOpen Source RobotProtein DigestionMass SpectrometryLiquid Handling SystemPython Automation ScriptsProtein ReductionPeptide Cleanup

Related Articles