Методическая статья

3D-визуализация внеклеточного матрикса печени на мышиной модели неалкогольного стеатогепатита

2.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63106

⸱

25 февраля 2022 г.

 ,  ,  , 
1Gastroenterology and Hepatology, Stanford University

В этой статье

Краткое содержание

Настоящий протокол оптимизирует методы перфузии/децеллюляризации печени in situ и двухфотонной микроскопии для создания надежной платформы для визуализации динамики ремоделирования внеклеточного матрикса (ECM) при неалкогольном стеатогепатите (НАСГ).

Аннотация

Неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) является наиболее распространенным хроническим заболеванием печени в Соединенных Штатах, поражающим более 70 миллионов американцев. НАСГ может прогрессировать до фиброза и, в конечном итоге, до цирроза, значительного фактора риска гепатоцеллюлярной карциномы. Внеклеточный матрикс (ECM) обеспечивает структурную поддержку и поддерживает гомеостаз печени с помощью матрицеллюлярных сигналов. Фиброз печени возникает в результате дисбаланса в динамическом процессе ремоделирования ECM и характеризуется чрезмерным накоплением структурных элементов и связанными с этим изменениями гликозаминогликанов. Типичная картина фиброза НАСГ называется «куриной проволокой», которая обычно состоит из перисинусоидального / перицеллюлярного фиброза зоны 3, основанного на особенностях, наблюдаемых трихромным пятном Массона и красными пятнами Picrosirius. Тем не менее, эти традиционные методы визуализации на основе тонких двумерных (2D) тканевых слайдов не могут продемонстрировать подробные трехмерные (3D) структурные изменения ECM, что ограничивает понимание динамического ремоделирования ECM при фиброзе печени.

Текущая работа оптимизировала быстрый и эффективный протокол для визуализации нативной структуры ECM в печени посредством децеллюляризации для решения вышеуказанных проблем. Мышей кормили либо чау-чау, либо фаст-фудом в течение 14 недель. Децеллюляризацию проводили после перфузии воротной вены in situ , а методы двухфотонной микроскопии применяли для визуализации и анализа изменений в нативной ECM. Были восстановлены и проанализированы 3D-изображения нормальной печени и печени с НАСГ. Выполнение перфузионной децеллюляризации in situ и анализ каркаса с помощью двухфотонной микроскопии обеспечили практичную и надежную платформу для визуализации динамического ремоделирования ECM в печени.

Введение

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) является наиболее распространенным заболеванием печени, поражающим 20-25% взрослого населения. У 25% пациентов с НАЖБП прогрессирует до неалкогольного стеатогепатита (НАСГ), при котором повышается риск цирроза печени, печеночной недостаточности и гепатоцеллюлярной карциномы1. По оценкам, в ближайшие 20 лет на долю НАСГ будет приходиться 2 миллиона смертей, связанных с печенью, в США2. Поскольку не существует утвержденных методов лечения, существует острая необходимость в расшифровке механизмов, вызывающих фиброз печени у пациентов с НАСГ, и разработке целенаправленного лечения3.

Внеклеточный матрикс (ECM) представляет собой динамическое сложное микроокружение, которое осуществляет двунаправленную связь с клетками для регулирования гомеостазатканей 4. ECM печени состоит из структурных элементов, таких как протеогликаны, коллагены, фибронектин, эластин и другие неструктурные белки (например, ольфактомедин и тромбоспондин) для обеспечения физической и структурной поддержки4.

Фиброз печени является хронической ранозаживляющей реакцией на поражение печени различной этиологии, включая НАСГ3. Он возникает в результате дисбаланса в процессе динамического ремоделирования матрицы ECM и характеризуется чрезмерным количеством структурных белков в поврежденной печени4. Фиброгенез зависит от динамической межклеточной коммуникации между различными типами клеток печени. Звездчатые клетки печени (ГСК) при активации дифференцируются в гладкомышечные альфа-2-актин-экспрессирующие, мигрирующие и пролиферирующие миофибробластоподобные клетки и синтезируют белки ECM в качестве закрывающего рану действия. Активированные ГСК являются центральными клетками, продуцирующими коллаген в печени1.

Молекулярный механизм ремоделирования ECM, паттерны фиброза и их связь с клеточными событиями не ясны. По-прежнему необходимо лучше понять трехмерную (3D) структуру ECM, даже несмотря на то, что методы масс-спектрометрии помогли проанализировать состав белкаECM 4. Традиционно трихромное окрашивание Массона, красители Picro Sirius Red и визуализация генерации второй гармоники (SHG) выполнялись на двумерных (2D) тонких срезах печени. Типичная картина фиброза НАСГ называется «куриной проволокой», которая распространяется на зону 3 и представляет собой перисинусоидальный/перицеллюлярный фиброз 5,6. Тем не менее, не хватало исследований, посвященных 3D-структуре нативной печени, особенно тех, которые не связаны с разделением тканей. Надежные подходы к визуализации для выявления закономерностей и характеристик фиброза во время динамического ремоделирования ECM при фиброзе печени значительно укрепит понимание механизмов НАСГ и выявят новые терапевтические мишени.

Чтобы решить эти проблемы, был оптимизирован быстрый и эффективный протокол для визуализации ECM нативной печени с помощью децеллюляризации7. Децеллюляризация всей печени — это подход к удалению клеточного содержимого печени при сохранении нативной сети 3D ECM за счет перфузии детергента. Мышей кормили либо чау-чау, либо диетой быстрого питания (FFD) в течение 14 недель. Децеллюляризацию проводили после перфузии воротной вены in situ мягким детергентом и низкой скоростью потока для сохранения тройных спиральных и нативных фибриллярных коллагеновых структур. Двухфотонная микроскопия применялась для анализа изменений коллагеновых структур в ECM. Были восстановлены и проанализированы 3D-изображения нативной структуры ECM в нормальной печени и печени с НАСГ. Выполнение перфузионной децеллюляризации in situ и анализ каркаса с помощью двухфотонной микроскопии обеспечивает практичную и доступную платформу для визуализации динамического ремоделирования ECM в печени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты на животных проводятся в соответствии с экспериментальными процедурами, утвержденными институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию (IACUC) Стэнфордского университета и Госпиталя по делам ветеранов в Пало-Альто. 6-8-недельных мышей-самцов C57BL / 6J кормили либо чау-чау, либо диетой быстрого питания с добавлением 4,2% кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы (см. Таблицу материалов) в питьевой воде в течение 14 недель5. Мышей содержали в стандартных клетках в течение 12 часов в темно-светлом цикле.

1. Хирургическая подготовка и процедуры перфузии печени

  1. Взвесьте мышь перед процедурой.
  2. Обезболивают мышей, вводя кетамин (90 мг / кг) и ксилазин (10 мг / кг) (см. Таблицу материалов) посредством внутрибрюшинной инъекции. Убедитесь, что мышь полностью обезболивается, ущипнув пальцы ног, прежде чем переходить к следующему шагу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран здесь не нужен, так как это операция, не приводящая к выживанию.
  3. Побрейте вентральную область с помощью машинки для стрижки волос и продезинфицируйте кожу 70% этанолом. Положите мышь на спину, а ноги на хирургической доске обездвижите скотчем.
  4. После подтверждения глубины анестезии защемлением пальца ноги используйте ножницы Майонеза и щипцы Адсона (см. Таблицу материалов), чтобы сделать разрез 3 см сбоку в нижней части живота, а затем разрез 5 см по вертикали от нижней части живота до мечевидного отростка. Будьте осторожны, чтобы не открыть грудную полость.
  5. После вскрытия брюшины аккуратно поместите кишечник слева от животного и поднимите правую долю печени с помощью аппликатора с вискозным наконечником (см. Таблицу материалов), чтобы обнажить воротную вену.
  6. Катетеризируют воротную вену с помощью катетера 24 G IV. Ввести катетер в дистальный конец воротной вены. Поместите наконечник катетера до того, как воротная вена разветвится в печеночные доли.
  7. Извлеките иглу сразу после того, как катетер войдет в вену. Убедитесь, что катетер правильно расположен внутри вены, перфузируя печень PBS с помощью шприца объемом 1 мл через катетер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После перфузии PBS все доли должны немедленно побледнеть. Если катетер установлен правильно, венозная кровь будет быстро течь через катетер.
  8. Используйте микрощипцы Dumont, держатель микроиглы Castroviejo и шов 4-0 (см. Таблицу материалов), чтобы наложить шов ниже разветвления воротной вены, и второй стежок на 1 см ниже, чтобы закрепить катетер.

2. Тканевая децеллюляризация

  1. Подсоедините катетер к силиконовой трубке (длина ~1 м, внутренний диаметр 3 мм и наружный диаметр 4,1 мм) с помощью соединителя Luer. Подсоедините силиконовую трубку к перистальтическому насосу и резервуару с деионизированной водой (см. Таблицу материалов).
  2. Осторожно удалите пузырьки воздуха внутри трубки и избегайте образования новых пузырьков во время перфузии. Установите перистальтический насос на производительность 0,2 мл/мин (т.е. 288 мл/24 ч).
  3. Сначала перфузируйте деионизированной водой (~ 50 мл / мышь) в течение 2 часов. Цвет печени изменится с красного на желтый во время перфузии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животное умрет через 10 минут перфузии.
  4. Переключите перфузионный раствор на 0,5% (мас./об.) дезоксихолата натрия (DOC, см. Таблицу материалов) и продолжайте в течение ночи (18 ч, ~ 250 мл / мышь). Печень станет белой в конце перфузии (рис. 1).
  5. Замените перфузионный раствор на деионизированную воду (~ 50 мл / мышь) и перфузируйте в течение 2 часов.
  6. Используйте микрощипцы Дюмона и ножницы с микропружиной (см. Таблицу материалов), чтобы собрать децеллюляризированную печень и тщательно вымыть ее в чашке Петри с PBS.
  7. Разрежьте децеллюляризированную ткань на мелкие кусочки для немедленной визуализации или заморозьте при -80 ° C для дальнейшего биохимического анализа, такого как тандемная масс-спектрометрия, ИФА или вестерн-блоттинг.

3. Подготовка предметного стекла к визуализации (с помощью многофотонного/конфокального флуоресцентного микроскопа)

  1. Перенесите небольшой кусочек децеллюляризированной печени (<3 x 3 x 3 мм) на предметное стекло микроскопа и поместите ткань в середину.
  2. Добавьте 10 мкл антибактериальной монтажной среды (см. Таблицу материалов) в ткань с помощью пипетки, чтобы избежать высыхания ткани.
  3. Накройте ткань покровным стеклом и приложите небольшое усилие, чтобы сплющить образец. Заклейте края покровного стекла бесцветным и прозрачным лаком для ногтей (рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за установки вертикального двухфотона через микроскоп на образце использовалось покровное стекло. Однако образцы могут быть размещены по-другому, если используется инвертированный микроскоп.

4. Получение изображения

  1. Нанесите каплю иммерсионного масла на верхнюю часть покровного стекла и поместите предметное стекло на держатель предметного стекла микроскопа. Опустите 20-кратную масляную линзу объектива до тех пор, пока она не соприкоснется с иммерсионным маслом.
  2. Переключитесь на фиолетовый (405 нм) канал, включите затвор и сфокусируйтесь на образце. Перемещайтесь и позиционируйте интересующую область для визуализации. Выключите затвор, прежде чем переходить к получению изображения с помощью лазерного излучения.
  3. Переключитесь на компьютерное управление и запустите двухфотонный лазер. Сначала включите двухфотонный лазер (рис. 3A), затем включите контроллер двухфотонного лазера (см. Таблицу материалов) и затвор (рис. 3B, C). Убедитесь, что выходная мощность превышает 2.5 Вт.
    Уменьшите мощность лазера, чтобы предотвратить гашение флуоресценции. Выберите и отрегулируйте детекторы (как фотоумножители, так и гибридные) в соответствии с выбранными флуорофорами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Двухфотонная визуализация была выполнена на длине волны возбуждения 860 нм. Два канала были выбраны для коллагеновых ГСП и двухфотонных возбужденных флуоресцентных изображений (TPEF) соответственно. Один канал, соответствующий диапазону длин волн 415-445 нм, обнаружил детальную структуру коллагена по сигналам SHG. Другой канал охватывал диапазон 465-669 нм для сбора сигналов TPEF.
  4. Выберите одновременное или последовательное получение изображений. Отрегулируйте точечное отверстие до максимального значения. Отрегулируйте длины волн лазера, усиление, мощность и смещение. Отрегулируйте время выдержки пикселя, размер пикселя, усреднение и масштаб (рис. 4A).
  5. Прокрутите z-контроллер компьютера и установите z-размеры, определите начальную и конечную точки, а также выберите количество изображений, передаваемых в томе (z-стек). Получение изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь был выбран объем Z 20 мкм и размер шага Z 1 мкм (рис. 4B).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Коллагеновые волокна были обнаружены с помощью генерации второй гармоники и двухфотонной микроскопии. Сигнал исходит от хрупких тройных спиральных и нативных фибриллярных коллагеновых структур. Специфические антитела не использовались для анализа подтипов коллагена; Тем не менее, это может быть добавлено к технике визуализации.

Когда ткань печени изучается без децеллюляризации, сложно получить изображения коллагеновой сети с высоким разрешением (рис. 5А).<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Настоящий протокол показывает, что децеллюляризация с помощью перфузии DOC in situ с низкой скоростью потока сохраняет хрупкие структуры тройной спирали и нативного фибриллярного коллагена, обеспечивая надежную и экономичную платформу для динамического ремоделирования ECM при фиброзе печени НАСГ. Несмотря на то, что децеллюляризация проводилась в нормальной и фиброзной печени до идентификации компонентов ECM или создания биологических каркасов для клеточной культуры, динамика ремоделирования ECM при фиброзе пече...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении данной статьи.

Благодарности

Благодарим Hyesuk Park за техническую помощь. Это исследование было поддержано финансированием Национального института диабета, болезней органов пищеварения и почек (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, в NJT), Национального института старения (NIA), NIH (1R01AG060726, в NJT). Мы выражаем благодарность Джону Малхолланду (Jon Mulholland) и Китти Ли (Kitty Lee) из Центра клеточных наук (Cell Sciences Imaging Facility) Центра Бекмана (Beckman Center) за техническую помощь в проведении двухфотонной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4-0 МОНОКРИЛ НЕОКРАШЕННЫЙ 1 x 18" P-3МОНОКРИЛY494G
4-0 шовFisher Scientific10-000-649https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true
AnaSed Injection (ксилазин)AnaSedNDC 59399-110-20этот препарат для использования лицензированным ветеринаром или по его заказу.
BD INSYTE AUTOGUARD I.V. КАТЕТЕР С ТЕХНОЛОГИЕЙ BC
Chow диетаEnvigo# 2918Control diet. Фиксированная формула, не подлежащая автоклавированию, изготовленная из высококачественных ингредиентов и предназначенная для поддержки беременности, лактации и роста грызунов.
Диета быстрого приготовления (AIN76A Западная диета)Тестовая диета1810060https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf
гематоксилина и эозина Stain KitvectorlabsH-3502https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html
Kent Scientific Rat Surgical Kitfisher scientific13-005-205https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit
КЕТАМИНА ГИДРОХЛОРИД ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙVedcoNDC 50989-996-06 - 10 мл - флакон.КетаВед был клинически изучен на приматах недочеловеков в дополнение к видам, перечисленным в разделе «Применение и дозировка».
Leica SP5 вертикальный Confocal, многофотонныйLeicaSP5
Luer (трехпозиционный запорный кран с SPIN-LOCK®)bbraunD300https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html
Picrosirius Red Stain KitPolysciences, Inc.24901https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771
Аппликатор с вискозным наконечникомпуритан25-806 1PR
Дезоксихолат натриясигмалдричD6750-100G
Сиропwww.target.com24 жидкими унциямиhttps://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801
перистальтическим насосом с регулируемой скоростьюINTLLABBT100https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumvectorlabsH-1000-10https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html
382612 разъем

Ссылки

  1. Friedman, S. L., Pinzani, M. Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future. Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).
  2. Ye, Q., et al. Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).
  3. Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).
  4. Arteel, G. E., Naba, A. The liver matrisome - looking beyond collagens. JHEP Reports. 2 (4), 100115(2020).
  5. Jiang, J. X., et al. Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging. Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).
  6. Dehnad, A., et al. AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).
  7. Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).
  8. Mazza, G., et al. Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition. Cells. 9 (1), 83(2019).
  9. Klaas, M., et al. The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue. Scientific Reports. 6, 27398(2016).
  10. Mattei, G., et al. Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices. Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).
  11. Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).
  12. Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. Fibrosis and cancer: A strained relationship. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356(2020).
  13. Cox, T. R. The matrix in cancer. Nature Reviews Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).
  14. Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).
  15. Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079(2015).
  16. Jia, Z., et al. 3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity. BioMed Research International. 2020, 6354183(2020).
  17. Shimoda, H., et al. Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy. Scientific Reports. 9 (1), 12543(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи