Method Article

Проточный цитометрический анализ множественных митохондриальных параметров в индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клетках и их нервных и глиальных производных

DOI:

10.3791/63116

⸱

November 8th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании сообщается о новом подходе к измерению нескольких митохондриальных функциональных параметров на основе проточной цитометрии и двойного окрашивания двумя флуоресцентными репортерами или антителами для обнаружения изменений в объеме митохондрий, митохондриальном мембранном потенциале, уровне активных форм кислорода, составе митохондриальной дыхательной цепи и митохондриальной ДНК.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрии играют важную роль в патофизиологии многих нейродегенеративных заболеваний. Изменения в объеме митохондрий, митохондриальном мембранном потенциале (MMP), митохондриальной продукции активных форм кислорода (АФК) и количестве копий митохондриальной ДНК (мтДНК) часто являются особенностями этих процессов. В этом отчете подробно описывается новый подход на основе проточной цитометрии для измерения нескольких митохондриальных параметров в различных типах клеток, включая индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (IPSCs) и нейронные и глиальные клетки, полученные из iPSC. Эта стратегия, основанная на потоке, использует живые клетки для измерения объема митохондрий, уровней MMP и АФК, а также фиксированные клетки для оценки компонентов митохондриальной дыхательной цепи (MRC) и связанных с мтДНК белков, таких как митохондриальный фактор транскрипции A (TFAM).

Путем совместного окрашивания с флуоресцентными репортерами, включая MitoTracker Green (MTG), тетраметилродаминэтиловый эфир (TMRE) и MitoSox Red, изменения в объеме митохондрий, MMP и митохондриальном АФК могут быть количественно определены и связаны с содержанием митохондрий. Двойное окрашивание антителами против субъединиц комплекса MRC и транслоказы наружной митохондриальной мембраны 20 (TOMM20) позволяет оценить экспрессию субъединицы MRC. Поскольку количество TFAM пропорционально числу копий мтДНК, измерение TFAM на TOMM20 дает косвенное измерение мтДНК на митохондриальный объем. Весь протокол может быть выполнен в течение 2-3 ч. Важно отметить, что эти протоколы позволяют измерять митохондриальные параметры, как на общем уровне, так и на конкретном уровне на митохондриальный объем, используя проточную цитометрию.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрии являются важными органеллами, присутствующими почти во всех эукариотических клетках. Митохондрии отвечают за энергоснабжение, производя аденозинтрифосфат (АТФ) путем окислительного фосфорилирования и действуют как метаболические посредники для биосинтеза и метаболизма. Митохондрии глубоко вовлечены во многие другие важные клеточные процессы, такие как генерация АФК, гибель клеток и внутриклеточная регуляция Ca2+. Митохондриальная дисфункция была связана с различными нейродегенеративными заболеваниями, включая болезнь Паркинсона (БП), болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Хантингтона (БГ), атаксию Фридрейха (FRDA) и боковой амиотрофический склероз (БАС)1. Считается, что повышенная митохондриальная дисфункция и аномалия мтДНК также способствуют старению человека 2,3.

Различные типы митохондриальной дисфункции встречаются при нейродегенеративных заболеваниях, а изменения в объеме митохондрий, деполяризация MMP, производство АФК и изменения в количестве копий мтДНК распространены 4,5,6,7. Поэтому способность измерять эти и другие митохондриальные функции имеет большое значение при изучении механизмов заболевания и тестировании потенциальных терапевтических агентов. Более того, ввиду отсутствия животных моделей, которые точно воспроизводят нейродегенеративные заболевания человека, создание подходящих модельных систем in vitro, которые рекапитулируют заболевание человека в клетках мозга, является важным шагом на пути к лучшему пониманию этих заболеваний и разработке новых методов лечения 2,3,8,9.

Человеческие ИПСК могут быть использованы для генерации различных клеток мозга, включая нейронные и ненейрональные клетки (то есть глиальные клетки), а митохондриальное повреждение, связанное с нейродегенеративными заболеваниями, было обнаружено в обоих типах клеток 3,10,11,12,13. Соответствующие методы дифференциации iPSC в нейронные и глиальные линии доступны 14,15,16. Эти клетки обеспечивают уникальную платформу для моделирования заболеваний in vitro и скрининга лекарств. Кроме того, поскольку они получены от пациентов, нейроны и глиальные клетки, полученные из iPSC, обеспечивают модели заболеваний, которые более точно отражают то, что происходит у людей.

На сегодняшний день существует мало удобных и надежных методов измерения множественных митохондриальных функциональных параметров в ИПСК, особенно в живых нейронах и глиальных клетках. Использование проточной цитометрии предоставляет ученому мощный инструмент для измерения биологических параметров, включая митохондриальную функцию, в отдельных клетках. Этот протокол предоставляет подробную информацию о генерации различных типов клеток мозга, включая нервные стволовые клетки (NSC), нейроны и глиальные астроциты из iPSCs, а также новые подходы на основе проточной цитометрии для измерения нескольких митохондриальных параметров в разных типах клеток, включая iPSCs и нейронные и глиальные клетки, полученные из iPSC. Протокол также обеспечивает стратегию совместного окрашивания для использования проточной цитометрии для измерения объема митохондрий, MMP, уровня митохондриальной АФК, комплексов MRC и TFAM. Включая измерения объема или массы митохондрий, эти протоколы также позволяют измерять как общий уровень, так и конкретный уровень на митохондриальную единицу.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов и Дополнительную таблицу S1 для рецептур всех сред и решений, используемых в этом протоколе.

1. Дифференциация ИПСК человека в NCS, дофаминергические (DA) нейроны и астроциты

  1. Подготовьте пластины с матричным покрытием.
    1. Разморозьте флакон 5 мл матрицы на льду за ночь. Разбавьте 1 мл матрицы 99 мл холодной модифицированной среды Eagle Medium advanced Dulbecco/F-12 Ham (Advanced DMEM/F12) (конечная концентрация 1%). Сделайте 1 мл аликвоты и храните их при -20 °C.
    2. Разморозьте матричный раствор при 4 °C (держите его холодным) и покройте 6 лунок (1 мл на скважину в 6-луночной плите).
    3. Поместите пластину с матричным покрытием в увлажненный 5% CO2/95% воздушный инкубатор при 37 °C в течение 1 ч. Выньте тарелку из инкубатора и дайте ей уравновеситься до комнатной температуры (RT).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать пластину в течение 3 дней после нанесения покрытия. Однако пластина с покрытием может храниться до 2 недель при температуре 4 °C. Просто не забудьте вынуть его и дать ему нагреться до RT перед использованием. Для длительного хранения добавьте 1 мл питательной среды iPSC к покрытой пластине, чтобы избежать высыхания матрицы.
  2. Размораживающие иПСК
    1. Предварительно прогрейте пластины с матричным покрытием при RT или в инкубаторе при 37 °C в течение 20-30 мин. Предварительно прогреть необходимое количество питательной среды iPSC на РТ.
    2. Смешайте 6 мл предварительной питательной среды iPSC с 12 мкл ингибитора Y-27632 ROCK для получения конечной концентрации 10 мкМ.
    3. Частично разморозьте замороженный флакон иПСК при 37 °C на водяной бане, пока не останется небольшой кусочек льда.
    4. Медленно добавляют 1 мл предварительной питательной среды iPSC с 12 мкл ингибитора ROCK по каплям к клеткам. Перенесите жидкое содержание флакона с iPSCs по каплям в одну лунку 6-луночной предварительно покрытой пластины с помощью пипетки 5 мл.
    5. Переместите пластину в перпендикулярных направлениях, чтобы перемешать содержимое скважины и вернуть пластину в инкубатор. Замените питательную среду iPSC через 24 ч после промывки фосфатно-буферным физиологическим раствором Dulbecco (DPBS) (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 мл на скважину в 6-луночной пластине).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте ингибитор ROCK к последующим кормлениям. Ежедневно меняйте среду культуры iPSC.
  3. Субкультурирование ИПСК
    1. Предварительно прогрейте пластины с матричным покрытием при RT или в инкубаторе при 37 °C в течение 20-30 мин. Предварительно прогреть необходимое количество питательной среды iPSC на РТ.
    2. Аспирируйте питательную среду из пластин, содержащих клетки. Промыть иПСК DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 мл на скважину в 6-луночной пластине).
    3. Добавьте ЭДТА (0,5 мМ) (1 мл на скважину в 6-луночной плите). Насиживайте пластины при 37 °C до тех пор, пока края колоний не начнут подниматься из лунки (обычно 3-5 мин). Аспирация ЭДТА.
    4. Добавьте предварительно расплавленную питательную среду iPSC (4 мл на лунку в 6-луночной пластине) и принудительно отсоедините колонии iPSC с помощью стерильной пипетки объемом 10 мл один раз. Не пипетка вверх и вниз, так как это может разбить комки клеток на отдельные клетки.
    5. Перенесите содержимое каждой скважины в две отдельные скважины в 6-луночной плите с матричным покрытием (2 мл на скважину в 6-луночной плите) и инкубируйте при 37 °C. Не создавайте пузырьков в суспензии во время пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно встряхните тарелку, прежде чем держать ее в инкубаторе. Коэффициент разделения может составлять от 1:2 (одна скважина на 2 новые скважины) до 1:4 (одна скважина на 4 новые скважины).
    6. Заменяйте среднюю суточную до тех пор, пока колонии не достигнут 60% слияния с хорошими размерами и соединениями.
  4. Нейронная индукция и генерация нейронных предшественников
    1. Приготовьте 500 мл химически определенной среды (CDM), 500 мл нейронной индукционной среды (NIM) и 500 мл среды без сыворотки нервных стволовых клеток (NSC SF).
    2. Промыть ячейки DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 мл на скважину в 6-луночной пластине) и добавить NIM (3 мл на скважину в 6-луночную пластину). Настройте как День 0.
    3. Замените NIM (3 мл на скважину в 6-луночной пластине) на день 1, день 3 и день 4 и наблюдайте под микроскопией ежедневно.
    4. На 5-й день отделите нейронные розетки в культуру суспензии, как описано ниже.
      1. Один раз аккуратно вымойте DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 мл на лунку в 6-луночной пластине). Добавить коллагеназу IV (1 мл на лунку в 6-луночную пластину) и выдержать в инкубаторе 1 мин. Аспирировать коллагеназу IV и вымыть один раз DPBS (1x) (4 мл на лунку в 6-луночной пластине) осторожно.
      2. Добавьте 2 мл NSC SF Medium на скважину в 6-луночную плиту. Отделите ячейки, соскребая дно скважин, рисуя сетки с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл.
      3. Соберите клеточную суспензию с 6-луночной пластины в 10-сантиметровую неприлипшную посуду. Увеличьте объем до 12 мл с помощью NSC SF Medium.
      4. Встряхните неадгезивную посуду со скоростью 65-85 об/мин на орбитальном шейкере в инкубаторе, чтобы предотвратить агрегацию.
  5. Дифференциация нейронов DA
    1. На 7-й день добавьте 12 мл CDM, дополненное 100 нг/мл фактора роста фибробластов-8b (FGF-8b), и поместите чашку на орбитальный шейкер в инкубаторе.
    2. На 8-13 день меняйте среду каждые 2 дня и ежедневно наблюдайте под микроскопией.
    3. На 14-й день добавьте 12 мл CDM, дополненного 100 нг/мл FGF-8b и 1 мкМ пурморфамина (PM). Поместите тарелку на орбитальный шейкер в инкубаторе.
    4. На 15-20 день меняйте среду каждые 2 дня и ежедневно наблюдайте за клетками под микроскопией.
    5. Механически проходите сферы, используя наконечники 1000 мкл, чтобы разбить большие сферы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение может быть 1:2 (одно блюдо на 2 новых блюда).
  6. Прекращение дифференциации
    1. Покройте 6-луночную пластину или крышки поли-L-орнитином (PLO) и ламинином, как описано ниже.
      1. Покрыть 6-луночную пластину 1 мл ПЛО на лунку и инкубировать пластину при 37 °C в течение 20 мин. Аспирировать решение ООП.
      2. Стерилизуйте пластину под ультрафиолетом в течение 20 мин. Промывайте скважины дважды DPBS (1x) (4 мл на скважину в 6-луночной плите).
      3. Добавьте в скважину 5 мкг/мл раствора ламинина (1 мл на скважину в 6-луночной пластине) и инкубируйте при 37 °C в течение 2 ч. Аспирировать ламинин и ненадолго промыть скважины DPBS (1x) (4 мл на скважину в 6-луночной плите) один раз перед нанесением покрытия.
    2. Соберите все сферы (начиная с шага 1.5.5) в трубки по 50 мл и дополните DPBS (1x). Отжимать при 300 × г в течение 5 мин. Аспирировать супернатанта.
    3. Инкубировать с 2 мл реагента диссоциации клеток (см. Таблицу материалов) в течение 10 мин при 37 °С на водяной бане с последующим мягким тритурированием пипеткой 200 мкл (в 20-50 раз в зависимости от размера сфер, избегая образования пузырьков).
    4. Нейтрализуют реагент диссоциации клеток 2 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) Дульбекко с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и центрифугируют коническую трубку объемом 50 мл, содержащую клетки при 300 × г в течение 5 мин при RT. Аспирировать супернатант.
    5. Добавьте 1 мл CDM, дополненного 10 нг/мл нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) и 10 нг/мл нейротрофического фактора, полученного из глиальных клеточных линий (GDNF), чтобы повторно суспендировать клеточные гранулы путем осторожного пипетирования вверх и вниз для получения одноклеточных суспензий.
    6. Аспирировать раствор ламинина с пластины (стадия 1.6.1.3), ненадолго промыть DPBS (1x) (4 мл на лунку в 6-луночной пластине) и засеять клетки (со стадии 1.6.5) в предварительно покрытые пластины или крышки в 3 мл CDM, дополненных 10 нг/мл BDNF и 10 нг/мл GDNF. Кормите клетки каждые 4 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференциация культур может сохраняться в течение многих недель до 3 месяцев. Нейронная морфология обычно появляется через 2 недели после прекращения и может быть использована для последующего анализа с этого момента. BDNF и GDNF не нужны для культивирования для более длительного обслуживания (до 2 месяцев).
  7. Генерация НСК
    1. Покрытие матричных пластин.
    2. Соберите все нейронные сферы (сгенерированные из шага 1.4) в трубки по 50 мл и пополните DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free). Открутить при 300 × г в течение 5 мин. Аспирировать супернатанты.
    3. Инкубируют гранулы с 2 мл клеточного диссоциационного реагента в течение 10 мин при 37 °С на водяной бане с последующим мягким тритурированием пипеткой 200 мкл (в 20-50 раз в зависимости от размера сфер, избегая образования пузырьков).
    4. Нейтрализуют 2 мл ДМЭМ с 10% ФБС и центрифугируют конические трубки объемом 50 мл, содержащие клетки при 300 × г в течение 5 мин при РТ. Аспирация супернатантов. Повторное суспендирование клеточных гранул путем осторожного пипетирования вверх и вниз для получения одноэлементных суспензий.
    5. Аспирировать матричный раствор из предварительно покрытой пластины и засеять клетки в предварительно покрытые пластины в NSC SF Medium (3 мл на скважину в 6-луночной пластине). Подкармливайте клетки каждые 2-3 дня и расщепляйте клетки при слиянии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, НСК могут быть расширены и заморожены.
  8. Дифференциация астроцитов глии
    1. Дифференцировка астроцитов от НСК
      1. Приготовьте 500 мл среды дифференцировки астроцитов.
      2. Семена НСК на пластинах/крышках с покрытием из поли-D-лизина (PDL) со средой NSC SF.
      3. На следующий день промыть клетки DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 мл на лунку в 6-луночной пластине) и добавить среду дифференцировки астроцитов (3 мл на скважину в 6-луночной пластине). Настройте как День 0.
      4. Ежедневно наблюдают за НСК под микроскопом и заменяют среду дифференцировки астроцитов (3 мл на лунку в 6-луночной пластине) каждые 2 дня с 1 по 27 дни.
    2. Созревание астроцитов
      1. Готовят среду созревания астроцитов.
      2. На 28-й день промыть клетки DPBS (1x) (4 мл на лунку в 6-луночной пластине) и добавить среду созревания астроцитов (3 мл на скважину в 6-луночной пластине).
      3. На 29 день и далее ежедневно наблюдайте за клетками под микроскопом и заменяйте среду созревания астроцитов (3 мл на лунку в 6-луночной пластине) каждые 2 дня.
      4. После одного месяца созревания расширьте клетки и криоконсервируйте их с этой стадии.
        ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе количество клеток увеличится. При расщеплении клеток для культивирования не нужны покрытые PDL чехлы.

2. Характеристика клеток иммуноцитохимией и иммунофлуоресцентным окрашиванием

  1. В конце периода культивирования переложите покровы с клетками на 12-луночную пластину.
    Промыть клетки фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) (1x) два раза и инкубировать в течение 10 мин в 4% параформальдегиде (PFA) (0,5 мл на лунку в 12-луночной пластине) на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированный образец может быть покрыт 2 мл PBS (1x) и храниться при 4 °C до тех пор, пока не потребуется иммуноокрашивание. PFA токсичен и подозревается в возникновении рака. Предотвращайте воздействие на кожу и глаза и работайте под химическим дымом.
  2. Блокируют и проникают клетки и инкубируют блокирующим буфером, содержащим PBS (1x), 0,3% Triton X-100 и 10% нормальную козью сыворотку в течение 1 ч при RT.
  3. Инкубировать с первичными антителами в блокирующем буфере в течение ночи при 4 °C: окрашивать иПСК с антиоктамер-связывающим фактором транскрипции 4 (Oct4) и антистадийным эмбриональным антигеном-4 (SSEA4), НСК с анти-определяющей пол областью Y box-2 (Sox2) и анти-Nestin, нервные сферы с антипарным боксом-6 (Pax6) и анти-Nestin, астроциты с антиглиальным фибриллярным кислым белком (GFAP) и анти-S100 кальций-связывающим белковым β (S100β) и нейроны DA с антитирозингидроксилазой (TH), анти-β III тубулин (Tuj 1), анти-синаптофизин и анти-PSD-95 (0,5 мл раствора первичного антитела на лунку в 12-луночной пластине; см. Таблицу материалов для деталей).
  4. Промывайте образцы PBS (1x) три раза в течение 10 минут каждый с мягким раскачиванием.
  5. Инкубировать с раствором вторичных антител (1:800 в блокирующем буфере, 0,5 мл раствора вторичных антител Alexa Fluor на лунку в 12-луночной пластине) в течение 1 ч при РТ с мягким раскачиванием.
  6. Инкубируют клетки с Hoechst 33342 (1:5000, 0,5 мл на лунку в 12-луночной пластине) в PBS (1x) в течение 15 мин на RT для маркировки ядер.
  7. Установите клетки с монтажной средой и высушите в течение ночи в RT для визуализации под флуоресцентным микроскопом в темноте. Дополнительный рисунок S1 для настроек и параметров микроскопа.

3. Измерение проточной цитометрии митохондриального объема, MMP и митохондриального АФК в живых клетках

  1. Засейте клетки отдельно в 4 лунки в 6-луночную пластину, пока ячейки не достигнут 50-60% слияния. Обозначьте эти четыре скважины как # 1, # 2, # 3 и # 4.
  2. В конце периода культивирования готовят 5 отдельных окрашивающих растворов (500 мкл на лунку в 6-луночной пластине) следующим образом: No1 только культуральная среда (до скважины No1, содержащей только клетки для контроля); No2-1, содержащий FCCP (100 мкМ); No2-2, содержащий FCCP (100 мкМ) + TMRE (100 нМ) + МТГ (150 нМ) в питательной среде; No3, содержащий TMRE (100 нМ) + МТГ (150 нМ) в питательной среде; #4, содержащий MitoSox Red (10 мкМ) + MTG (150 нМ) в PBS (1x) с 10% FBS. См. Рисунок 1А, Дополнительная таблица S2 и Таблица материалов для получения подробной информации об этих соединениях и настройке проточной цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте культуральную среду для приготовления окрашивающего раствора. Разогрейте среду и PBS (1x) на RT перед использованием. FCCP токсичен; предотвращать воздействие на кожу и глаза и работать под химическим дымом.
  3. Аспирируйте среду из лунки No2 и добавьте раствор No2-1 (только FCCP). Инкубировать клетки при 37 °C в течение 10 мин.
  4. Аспирировать среду из скважин No2 и No3 и добавить раствор No2-2 (FCCP + TMRE + MTG) в скважину No2 и раствор No3 (ПМРЭ + МТГ) в Луну No3. Инкубировать клетки при 37 °C в течение 45 мин.
  5. Аспирировать среду из лунки No4 и добавить раствор No4 (MitoSox Red + MTG). Инкубируют клетки при 37 °C в течение 15 мин.
  6. Аспирировать среду из всех скважин. Промывайте PBS (1x) (4 мл на скважину в 6-луночной плите). Отсоедините клетки с помощью 1 мл клеточного диссоциационного реагента (1 мл на лунку в 6-луночной пластине) при 37 °C в течение 5 мин. Нейтрализуют клеточный диссоциационный реагент в 1 мл DMEM с 10% FBS (2 мл на лунку в 6-луночной пластине).
  7. Соберите содержимое всех колодцев в конические трубки по 15 мл. Центрифугируйте пробирки по 300 × г в течение 5 мин. Вымойте гранулы PBS (1x) один или два раза.
  8. Аспирируйте супернатанты, но оставляйте примерно 100 мкл в пробирках. Повторное суспендирование клеточных гранул в 300 мкл PBS (1x). Перенесите клетки в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл. Держите трубки в темноте при RT.
  9. Анализируйте клетки с помощью проточного цитометра (с конфигурацией 3 синего и 1 красного лазера). Обнаружение MTG в фильтре 1 (FL1) с помощью полосового фильтра 530/30, TMRE в фильтре 2 (FL2) с помощью полосового фильтра 585/40 и MitoSox Red в фильтре 3 (FL3) с помощью полосового фильтра 510/580.

4. Измерение проточной цитометрии субъединиц комплекса MRC и TFAM в фиксированных клетках

  1. В конце периода культивирования отсоединяют клетки (~106) путем добавления реагента диссоциации клеток; затем гранулируют и собирают клетки в пробирку объемом 15 мл. Промыть ячейки центрифугированием PBS (1x) дважды центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин.
  2. Зафиксируйте клетки в 1,6% PFA (1 мл 1,6% PFA в пробирке 15 мл) на RT в течение 10 мин. Промыть ячейки центрифугированием PBS (1x) дважды центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин.
  3. Пермеабилизируйте клетки ледяным 90% метанолом (1 мл 90% метанола в пробирке 15 мл) при -20 °C в течение 20 мин.
  4. Блокируйте образцы в блокирующем буфере, содержащем 0,3 М глицина, 5% козьей сыворотки и 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) - фракцию V в PBS (1x) (1 мл блокирующего буфера в пробирке 15 мл). Промывайте ячейки центрифугированием PBS (1x) дважды (как на этапе 3.7).
  5. Инкубируют клетки со следующими первичными антителами в течение 30 мин: анти-NDUFB10 (1:1000) для измерения субъединицы комплекса I, антисукцинатдегидрогеназного комплекса флавопротеиновая субъединица A (SDHA, 1:1000) для измерения субъединицы комплекса II и анти-ЦОГ IV (1:1000) для измерения комплексной IV субъединицы и анти-TFAM антитело, конъюгированное с Alexa Fluor 488 (1:400). Окрашивают такое же количество клеток отдельно антителом против TOMM20, конъюгированным с Alexa Fluor 488 (1:400) в течение 30 мин (1 мл раствора первичного антитела в пробирке объемом 15 мл; подробнее об антителах см. Таблицу материалов ).
  6. Промыть ячейки PBS (1x) однократно с центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин. Добавьте вторичное антитело (1:400) в пробирки NDUFB10, SDHA и COX IV и инкубируйте клетки этими растворами в течение 30 мин.
  7. Промывайте ячейки PBS (1x) однократно центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатанты, оставляя примерно 100 мкл в пробирках. Повторное суспендирование клеточных гранул в 300 мкл PBS (1x). Переложите клетки в 1,5 мл микроцентрифужных трубок, хранящихся в темноте на льду.
  8. Проанализируйте клетки на проточном цитометре (с конфигурацией 3 синих и 1 красный лазер). Обнаружение сигналов в фильтре 1 (FL1) с помощью полосового фильтра 530/30. Дополнительный рисунок S2 для настроек и параметров микроскопа.

5. Сбор и анализ проточной цитометрии

  1. Используйте неокрашенную контрольную трубку для установки диаграмм рассеяния прямого рассеяния (FSC-A) и области бокового рассеяния (SSC-A) на основе размера и сложности анализируемой популяции клеток. Дополнительный рисунок S2 для настроек и параметров микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка неокрашенных элементов управления для отдельных типов клеток.
  2. Используйте непятнистые контрольные трубки для выбора положительных затворов и используйте одноцветные управляющие трубки для компенсации флуоресцентного спектрального перекрытия между MTG (флуорофор-1 [FL-1]) и TMRE (FL-2) в многоцветной проточной цитометрии. Используйте контроль изотипов для отрицательного контроля для мониторинга фонового окрашивания в образцах MRC и TFAM. Используйте трубку FCCP в качестве деполяризационного контроля для окрашивания TMRE.
  3. Выгоните посторонний мусор для отбора живых клеток и основного затвора с передней и боковой диаграммы рассеяния (рисунок 2А). Выгоняйте дублеты, используя график плотности прямого рассеяния (FSC-H) против (vs.) FSC-A для исключения дублетов, а также построения боковой высоты рассеяния (SSC-H) против графика SSC-A (рисунок 2A).
  4. Сбор данных (проточный цитометр)
    1. Используя неокрашенные или изотипные образцы в качестве отрицательного элемента управления, создайте затвор над основной популяцией одноклеточных событий при просмотре SSC-A и различных фильтров (FL1, FL2, FL3, FL4) (рисунок 1B и рисунок 2B).
  5. Анализ данных (программное обеспечение CFlow)
    1. Скопируйте положение затворов на образцы окрашенных клеток и запишите количество положительно окрашенных клеток для положительного окрашивания.
    2. Для каждой подпопуляции клеток выберите график гистограммы и проанализируйте среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) различных каналов фильтра (FL1, FL2, FL3, FL4) (ось X).
      1. Рассчитайте уровни TMRE, вычитая MFI FL2 клеток, обработанных FCCP, из MFI FL2 из образцов, окрашенных #3 TMRE, в гистограмме, как в Eq (1) ниже.
        Уровни TMRE = MFI FL2 из образцов, окрашенных #3 TMRE - MFI FL2 клеток, обработанных FCCP #2 (1)
      2. Рассчитайте конкретные значения для MMP и митохондриальной АФК по MFI в TMRE или MitoSox Red, разделив индикатор объема митохондрий MTG.
      3. Рассчитайте конкретное значение для сложной субъединицы и TFAM с помощью MFI в комплексном выражении или TFAM, разделив индикатор объема митохондрий TOMM20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схематическое описание метода дифференциации и цитометрических стратегий потока показано на рисунке 3. Человеческие ИПСК дифференцируются в нейронные розетки, а затем поднимаются в культуру суспензии для дифференциации в нейронные сферы. Нейронные сферы далее дифференцируются и созревают в нейроны DA. Нервные сферы диссоциируются на отдельные клетки для генерации глиальных астроцитов, перестраиваются в монослои в виде НСК, а затем дифференцируются в астроциты. Этот протокол предоставляет стр...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлены протоколы для генерации нейронов и астроцитов, полученных из iPSC, и оценки нескольких аспектов функции митохондрий с использованием проточной цитометрии. Эти протоколы позволяют эффективно преобразовывать человеческие ИПСК как в нейроны, так и в глиальные астроциты и детально характеризовать митохондриальную функцию, в основном в живых клетках. Протоколы также обеспечивают стратегию совместного окрашивания проточной цитометрии для получения и анализа нескольких митохондриальных функций, включая объемн...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы любезно благодарим Центр молекулярной визуализации и Центр проточной цитометрии в Университете Бергена в Норвегии. Эта работа была поддержана финансированием Норвежского исследовательского совета (номер гранта: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat и Китайского стипендиального совета (номер проекта: 201906220275).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
anti-Oct4Abcamab19857, RRID:AB_445175Первичное антитело; использование в виде 1:100, 10 μ L в 1000 μ L раствор для окрашивания; использовать Alexa Fluor ® 488 козий антикроличьи IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, каталог # A-11008) в качестве вторичного антитела.
anti-SSEA4Abcamab16287, RRID:AB_778073Первичное антитело; использование в виде 1:100, 10 μ L в 1000 μ L раствор для окрашивания; использовать Alexa Fluor ® 594 козий антимышиный IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Каталог # A-11005) в качестве вторичного антитела.
anti-Sox2Abcamab97959, RRID:AB_2341193Первичное антитело; использование в виде 1:100, 10 μ L в 1000 μ L раствор для окрашивания; использовать Alexa Fluor ® 488 козий антикроличьи IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, каталог # A-11008) в качестве вторичного антитела.
anti-Pax6Abcamab5790, RRID:AB_305110Первичное антитело; использовать как 1:100, 10 μ L в 1000 μ L раствор для окрашивания; использовать Alexa Fluor ® 488 козий антикроличьи IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, каталог # A-11008) в качестве вторичного антитела.
anti-NestinSanta Cruz Biotechnologysc-23927, RRID:AB_627994Первичное антитело; использование в виде 1:50, 20 μ L в 1000 μ L раствор для окрашивания; использовать Alexa Fluor ® 594 козий антимышиный IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Каталог # A-11005) в качестве вторичного антитела.
анти-GFAPAbcamab4674, RRID:AB_304558Первичное антитело; использование в виде 1:100, 10 μ L в 1000 μ L раствор для окрашивания;   использовать Alexa Fluor ® 594 козий антикуриный IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Каталог # A-11042) в качестве вторичного антитела.
анти-S100&бета;   конъюгировано с Alexa Fluor 488Abcamab196442, RRID:AB_2722596Первичное антитело; использование в виде 1:400, 2,5 μ L в 1000 μ L раствор для окрашивания;
anti-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Первичное антитело; использование в виде 1:100, 10 μ L в 1000 μ L раствор для окрашивания; использовать Alexa Fluor ® 488 козий антикроличьи IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, каталог # A-11008) в качестве вторичного антитела.
anti-Tuj 1Abcamab78078, RRID:AB_2256751Первичное антитело; использовать как 1:1000, 1 μ L в 1000 μ L раствор для окрашивания; использовать Alexa Fluor ® 594 козий антимышиный IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Каталог # A-11005) в качестве вторичного антитела.
анти-синаптофизинAbcamab32127, RRID:AB_2286949Первичное антитело; использование в виде 1:100, 10 μ L в 1000 μ L раствор для окрашивания; использовать Alexa Fluor ® 488 козий антикроличьи IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, каталог # A-11008) в качестве вторичного антитела.
anti-PSD-95Abcamab2723, RRID:AB_303248Первичное антитело; использование в виде 1:100, 10 μ L в 1000 μ L раствор для окрашивания;   использовать Alexa Fluor ® 594 козий антикуриный IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Каталог # A-11042) в качестве вторичного антитела.
анти-ТФАМ конъюгирован с первичным антителом Alexa Fluor 488Abcamab198308; использование в виде 1:400, 2,5 и мкм; L в 1000 μ L раствор для окрашивания; использовать мышиный моноклональный IgG2b  Алекса Флуор 488 в качестве контроля изотипа.
анти-TOMM20 конъюгирован с Alexa Fluor 488Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-17764 RRID:AB_628381Первичное антитело; использование в виде 1:400, 2,5 μ L в 1000 μ L раствор для окрашивания; использовать мышиный моноклональный IgG2a  Алекса Флуор 488 в качестве контроля изотипа.
анти-NDUFB10Abcamab196019Первичное антитело; использовать как 1:1000, 1 μ L в 1000 μ L раствор для окрашивания; использовать Alexa Fluor ® 488 козий антикроличьи IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Каталог # A-11008) в качестве вторичного антитела; использовать моноклональный IgG кролика в качестве контроля изотипа.
анти-SDHAAbcamab137040Первичное антитело; использование в виде 1:1000, 1 μ L в 1000 μ L раствор для окрашивания;   использовать Alexa Fluor ® 488 козий антикроличьи IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Каталог # A-11008) в качестве вторичного антитела; использовать моноклональный IgG кролика в качестве контроля изотипа.
анти-ЦОГ IVAbcamab14744, RRID:AB_301443Первичное антитело; использование в виде 1:1000, 1 μ L в 1000 μ L раствор для окрашивания; Использование  Alexa Fluor ® 488 козий антимышиный IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Каталог # A-11001) в качестве вторичного антитела; использовать мышиный моноклональный IgG в качестве контроля изотипа.
Активин АPeproTech120-14EСреда для дифференцировки астроцитов ингредиент
ABM Базальная средаLonzaCC-3187Базальная среда для культуры астроцитов
AGM SingleQuots Supplement PackLonzaCC-4123Добавка для культуры астроцитов
Антибиотик-антимикотикThermo Fisher Scientific15240062CDM ингредиент
Advanced DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634010Базальная среда для разбавленного Geltrex
Bovine Serum AlbuminEuropa BioproductsEQBAH62-1000Блокатор для предотвращения неспецифического связывания антител в иммуноокрашивающих анализах и ингредиент CDM
BDNFPeproTech450-02DA нейроны средний ингредиент
B-27 ДобавкаThermo Fisher Scientific17504044Среда для дифференцировки астроцитов
BD Accuri C6 Plus Проточный цитометрBD Biosciences, США
Химически определенный липидный концентратThermo Fisher Scientific11905031CDM ингредиент
Коллагеназа IVThermo Fisher Scientific17104019Реагент для щадящей диссоциации иПСК человека
CCD Микроскоп Камера Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Германия
Corning необработанные питательные чашкиSigma-AldrichCLS430589Суспензия
культуры DPBSThermo Fisher Scientific14190250Используется для промывки различных клеточных культур
DMEM/F-12, добавка GlutaMAX ThermoFisher Scientific10565018Астроцитарная дифференцировка базальная среда
EDTAThermo Fisher Научный15575020Реагент для щадящей диссоциации иПСК человека
Essential 8 Базальная средаThermo Fisher ScientificA1516901Базальная среда для культуры иПСК
Эссенция 8 Добавка (50X)Thermo Fisher ScientificA1517101Добавка для культуры иПСК
EGF Рекомбинантный человеческий белокThermo Fisher ScientificPHG0314Добавка для культуры НСК
FGF-basic (AA 10– 155) Рекомбинантный человеческий белокThermo Fisher ScientificPHG0024Добавка для культуры NSC
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаSigma-Aldrich12103CСредний ингредиент
FGF-basicPeproTech100-18BСреда для дифференцировки астроцитов
ингредиент FCCPAbcamab120081Устраняет потенциал митохондриальной мембраны и окрашивание
TMREСистема аспирации жидкости BVC controlVacuubrand, Германия
Формальдегид (PFA) 16%Thermo Fisher Scientific28908Фиксация клеток
GeltrexThermo Fisher ScientificA1413302Используется для прикрепления и поддержания иПСК человека
Добавка GlutaMAX ThermoFisher Scientific35050061Добавка для культуры NSC
GDNFPeprotech450-10DA нейроны средний ингредиент
ГлицинSigma-AldrichG8898Используется для блокировки буфера
Смесь питательных веществ Ham's F-12Thermo Fisher Scientific31765027Базальная среда для CDM
Херегулин бета-1 человекаSigma-AldrichSRP3055Астроциты дифференцировка средний ингредиент
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Окрашивание ядер для конфокального изображения
Heracell 150i CO2 ИнкубаторыFisher Scientific, США
IMDMThermo Fisher Scientific21980032Базальная среда для CDM
ИнсулинRoche1376497CDM ингредиент
InSolution AMPK ИнгибиторSigma-Aldrich171261Нейроиндукционная среда ингредиент
Инсулиноподобный фактор роста-I человекаSigma-AldrichI3769Среда для дифференцировки астроцитов ингредиент
Нокаут DMEM/F-12 средаThermo Fisher Scientific12660012Базальная среда для культуры НСК
ЛамининSigma-AldrichL2020Способствует прикреплению и росту нервных клеток in vitro
Leica TCS SP8 STED конфокальный микроскопLeica Microsystems, Германия
МонотиоглицеринSigma-AldrichM6145CDM ингредиент
MitoTracker Green FMThermo Fisher ScientificM7514Используется для индикатора объема митохондрий
MitoSox RedThermo Fisher ScientificM36008Используется для индикатора митохондриальных АФК
N-ацетил-L-цистеинSigma-AldrichA7250Neural Ингредиент индукционной среды
N-2 ДобавкаThermo Fisher Scientific17502048Среда для дифференцировки астроцитов Нормальная
козья сывороткаThermo Fisher ScientificPCN5000Используется для блокировки буфера
Орбитальные шейкеры - SSM1Stuart Equipment, Великобритания
Раствор поли-L-орнитинаSigma-AldrichP4957Способствует прикреплению и росту нервных клеток in vitro
Poly-D-лизина гидробромидSigma-AldrichP7405Способствует прикреплению и росту нервных клеток in vitro
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204Способствует дифференцировке нейронов DA
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930Монтаж покровного стекла для конфокального изображения
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Используется для различных видов промывки
рекомбинантного белка человека/мыши FGF-8b R& D Systems423-F8-025/CFСпособствует дифференцировке нейронов
DA SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPНейронная индукция Средний ингредиент
StemPro Нейронная добавкаThermo Fisher ScientificA10508-01Добавка для культуры НСК
TrypLE Express EnzymeThermo Fisher Scientific12604013Реагент для диссоциации клеток
ТрансферринRoche652202ингредиент CDM
TRITON X-100VWR International9002-93-1Используется для проникновения клеток в иммуноокрашивающих анализах
TMREAbcamab113852Используется для окрашивания потенциала митохондриальной мембраны
Водяная баня Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, США

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  2. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304(2021).
  3. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146(2020).
  4. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).
  5. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  6. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24 (8), Basel, Switzerland. 1583(2019).
  7. Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311(2019).
  8. Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Schöler, H. R. Investigating human disease using stem cell models. Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).
  9. Patani, R. Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine. Nature Medicine. 26 (4), 449(2020).
  10. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. , 337(2021).
  11. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  12. Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17(2012).
  13. Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Liu, Q., et al. Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).
  15. Hong, Y. J., Do, J. T. Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400(2019).
  16. Lundin, A., et al. Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models. Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).
  17. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536(2021).
  18. Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues. Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).
  19. Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs. Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).
  20. Buckman, J. F., et al. MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants. Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).
  21. Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryMitochondrial ParametersInduced Pluripotent Stem CellsNeural DerivativesGlial DerivativesMitochondrial Membrane PotentialReactive Oxygen SpeciesMitochondrial VolumeMitochondrial DNA CopyMitochondrial Respiratory Chain

Related Articles