Протокол описывает получение колонок клеточной мембранно-аффинной хроматографии (CMAC) с иммобилизованными фрагментами клеточной мембраны, содержащими функциональные трансмембранные тропомиозинкиназные рецепторы В-белки. Также объясняется использование колонок CMAC для идентификации специализированных растительных метаболитов, взаимодействующих с этими рецепторами и присутствующих в сложных природных смесях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Колонки клеточной мембранной аффинности хроматографии для идентификации специализированных растительных метаболитов, взаимодействующих с иммобилизованным рецептором тропомиозинкиназы B
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Химические вещества, синтезируемые растениями, грибами, бактериями и морскими беспозвоночными, были богатым источником новых лекарственных средств и свинец. Лекарства, такие как статины, пенициллин, паклитаксел, рапамицин или артемизинин, обычно используемые в медицинской практике, были впервые идентифицированы и выделены из натуральных продуктов. Однако идентификация и выделение биологически активных специализированных метаболитов из природных источников является сложным и трудоемким процессом. Традиционно отдельные метаболиты выделяют и очищают от сложных смесей после экстракции биомассы. Впоследствии выделенные молекулы тестируются в функциональных анализах для проверки их биологической активности. Здесь мы представляем использование колонок клеточной мембранной аффинной хроматографии (CMAC) для идентификации биологически активных соединений непосредственно из сложных смесей. Колонки CMAC позволяют идентифицировать соединения, взаимодействующие с иммобилизованными функциональными трансмембранными белками (TMP), встроенными в их нативную фосфолипидную двухслойную среду. Это целенаправленный подход, который требует знания TMP, активность которого предполагается модулировать с недавно идентифицированным кандидатом на низкомолекулярное лекарство. В этом протоколе мы представляем подход к подготовке колонок CMAC с иммобилизованным тропомиозинкиназным рецептором B (TrkB), который стал жизнеспособной мишенью для открытия лекарств для многочисленных расстройств нервной системы. В этой статье мы предоставляем подробный протокол для сборки колонки CMAC с иммобилизованными рецепторами TrkB с использованием клеточных линий нейробластомы, чрезмерно экспрессирующих рецепторы TrkB. Далее представлен подход к исследованию функциональности колонки и ее использование при идентификации специализированных растительных метаболитов, взаимодействующих с рецепторами TrkB.
Введение
Ботанические смеси богаты фармакологически активными соединениями1, служащими хорошим источником для идентификации новых лекарственных хитов и свинец 2,3,4,5. Открытие новых лекарств из натуральных продуктов было плодотворным подходом, и многие одобренные в настоящее время лекарства произошли из соединений, впервые идентифицированных в природе. Химическое разнообразие природных соединений трудно сопоставить с искусственными библиотеками химически синтезированных молекул. Многие природные соединения взаимодействуют и м....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Клеточная культура клеток нейробластомы SH-SY5Y (клеточные линии TrkB и TrkB-NULL (родительские))
ПРИМЕЧАНИЕ: Сотовые линии (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) и SH-SY5Y Родительская клеточная линия (TrkB NULL))49,50 были приобретены у Kerafast. Культивируемые клетки используются в качестве источника трансмембранных рецепторов, подлежащих иммобилизации для подготовки колонок CMAC. Следующие шаги описывают, как получить фрагменты клеточной мембраны и собрать функциональные колонны CMAC.
- Выращивайте клетки в клеточной культуральной среде, приготовленной путем ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В соответствии с протоколом были собраны две хроматографические колонки CMAC: одна с иммобилизованными фрагментами клеточной мембраны нейробластомы SH-SY5Y с гиперэкспрессированным TrkB и одна с фрагментами клеточной мембраны SH-SY5Y TrkB-NULL. Правильно собранная колонна CMAC представлена на рисунке 1, а этапы, участвующие в иммобилизации фрагмента клеточной мембраны, представлены на рисунке 2.
С момента иммобилизации рецепторов TrkB.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Идентификация активных соединений, присутствующих в сложных смесях специализированных метаболитов, является очень сложной задачей23. Традиционно выделяют отдельные соединения, а их активность тестируют в разных анализах. Такой подход является трудоемким и дорогостоящим и часто приводит к выделению и идентификации наиболее распространенных и хорошо охарактеризованных соединений23. Используемые в настоящее время высокопроизводительные скрининговые анализы в значительной степе.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Лукаш Цисла сотрудничает с Regis Technologies, поставщиком IAM. ПК. Частицы DD2.
Благодарности
Z.C.A. была поддержана Советом по научным и технологическим исследованиям Турции (TUBITAK) 2219 - Международная программа постдокторских исследований. Исследование, о котором сообщается в этой публикации, было поддержано Национальным центром комплементарной и интегративной медицины Национальных институтов здравоохранения под номером 1R41AT011716-01. Эта работа также была частично поддержана грантом Американского общества фармакогнозии, грантом Regis Technologies для Лос-Анджелеса. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 7-8 Дигидроксифлавона гидрат | Sigma-Aldrich | D5446-10 мг | ≥ 98% (ВЭЖХ) |
| Аденозин 5'-трифосфат (АТФ) динатрия соль гидрат | Sigma-Aldrich | A2383-1 г | |
| ацетат аммония | VWR Chemicals BDH | BDH9204-500 г | |
| BDNF антитела | Invitrogen | PA5-15198-400 μ L | Первичное антитело; 2 мг/мл концентрации |
| бензамидина гидрохлорида гидрат | Sigma-Aldrich | B6506-25 г | |
| Нейротрофический фактор мозга (BDNF) человека | Sigma-Aldrich | B3795-10 μ g | Рекомбинантный, экспрессируемый в E. coli, лиофилизированный порошок, подходит для клеточной культуры |
| Хлорид кальция | VWR Analytical | BDH9224-1 кг | |
| Натриевая соль холевой кислоты | Alfa Aesar | J62050-100 г | |
| Гомогенизатор Dounce | VWR | 71000-516 | 40 мл, 285 мм (общая длина), 32 x 140 мм (Наружный диаметр x H) |
| Этанол | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) | VWR Аналитическая | BDH-9232-500 г | |
| Фетальная бычья сыворотка | Sigma-Aldrich | F2442-500 мл | стерильно-фильтрованная, подходит для клеточной культуры |
| G418 раствор дисульфатной соли | Sigma-Aldrich | G8168-100 мл | 50 мг/мл в H2O, 0,1 мкм; m фильтрованный, подходит для клеточной культуры |
| глицерин | VWR Life Science | E520-100 мл | |
| Иммобилизованная искусственная мембрана (IAM. ПК. DD2) | Реджис Текнолоджис, Инк. | 1-771050-500 | |
| Магния хлорид гексагидрат | VWR Аналитический | BDH9244-500 мл | |
| Метанол | Sigma-Aldrich | 322425 | |
| Nikon C2 DUVb | Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп | Нормальная | |
| козья сыворотка (10%) | Life Technologies | 50197Z | |
| Пенициллин-стрептомицин | Sigma-Aldrich | P4333-100 мл | |
| фенилметансульфонилфторида (PMSF) | Thermo Scientific | 36978-5 г | |
| Фосфатный буферный раствор (PBS) | VWR Life Science | K812-500 мл | 1x |
| Хлорид калия | VWR Химикаты BDH | 0395-1 кг | |
| Коктейль ингибиторов протеазы | VWR Life Science Ambreso | M221-1 мл | Класс протеомики, содержащий 50 мМ AEBSF, 30 &; M апротонин, 1 мМ бестатин, 1 мМ E-64 и 1 мМ лейпептин |
| RPMI-1640 средний | Sigma-Aldrich | R8758-500 мл | с L-глутамином и бикарбонатом натрия, жидкий, стерильно-фильтрованный, подходит для клеточной культуры |
| Вторичное антитело козье антикроличьи IgG (H+L) | Invitrogen Alexa Flour Plus 488 | A32731 | |
| SH-SY5Y Клеточные линии нейробластомы, экспрессирующие Trk-B | Kerafast | ECP007 | |
| SH-SY5Y Trk-NULL клеточная линия | Kerafast | ECP005 | |
| Трубка для диализа змеиной кожи | Thermo Scientific | 88245 | 10K MWCO, 35 мм сухой внутренний диаметр |
| Азид натрия | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | BDH VWR Analytical | BDH9286-2,5 кг | |
| Tricorn 5/20 колонка | GE Healthcare | 24-4064-08 | |
| Tris-HCl | VWR Life Science | 0497-1 кг | |
| Trypsin-EDTA раствор | Sigma-Aldrich | T4049-500 мл | 0,25%, стерильно-отфильтрованный, пригодный для клеточной культуры, 2,5 г свиного трипсина и 0,2&nb.л.; g ЭДТА |
Ссылки
- Thomford, N. E., et al. Natural Products for Drug Discovery in the 21st Century: Innovations for Novel Drug Discovery. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1578(2018).
- Atanasov, A. G., Zotchev, S. B., Dirsch, V. M.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
