Этот протокол описывает динамику вирусных инфекций с использованием люциферазы и флуоресцентно-экспрессирующих рекомбинантных (r)SARS-CoV-2 и систем визуализации in vivo (IVIS) у трансгенных мышей K18 hACE2 для преодоления необходимости вторичных подходов, необходимых для изучения инфекций SARS-CoV-2 in vivo.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Живая визуализация и количественная оценка вирусной инфекции у трансгенных мышей K18 hACE2 с использованием репортер-экспрессирующего рекомбинантного SARS-CoV-2
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Пандемия коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19) была вызвана тяжелым острым респираторным синдромом коронавируса 2 (SARS-CoV-2). На сегодняшний день SARS-CoV-2 является причиной более 242 миллионов инфекций и более 4,9 миллиона смертей во всем мире. Подобно другим вирусам, изучение SARS-CoV-2 требует использования экспериментальных методов для обнаружения присутствия вируса в инфицированных клетках и/или на животных моделях. Чтобы преодолеть это ограничение, мы создали репликационно-компетентный рекомбинантный (r)SARS-CoV-2, который экспрессирует биолюминесцентные (нанолюцифераза, Nluc) или флуоресцентные (Венера) белки. Эти репортер-экспрессирующие rSARS-CoV-2 позволяют отслеживать вирусные инфекции in vitro и in vivo на основе экспрессии генов-репортеров Nluc и Venus. Здесь исследование описывает использование rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus для обнаружения и отслеживания инфекции SARS-CoV-2 в ранее описанной K18 человеческой ангиотензинпревращающей ферменте 2 (hACE2) трансгенной мышиной модели инфекции с использованием систем визуализации in vivo (IVIS). Эти rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus демонстрируют rSARS-CoV-2/WT-подобную патогенность и репликацию вируса in vivo. Важно отметить, что экспрессия Nluc и Venus позволяет нам напрямую отслеживать вирусные инфекции in vivo и ex vivo у инфицированных мышей. Эти rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus представляют собой отличный вариант для изучения биологии SARS-CoV-2 in vivo, понимания вирусной инфекции и связанного с ней заболевания COVID-19 и определения эффективных профилактических и/или терапевтических методов лечения для борьбы с инфекцией SARS-CoV-2.
Введение
Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) представляет собой оболочку, с положительным чувством, одноцепочечный РНК-вирус, который принадлежит к линии бетакоронавирусов в семействе Coronaviridae 1. Это вирусное семейство делится на альфа-, бета-, гамма- и дельта-коронавирус1. Альфа- и бетакоронавирусы в основном заражают млекопитающих, тогда как гамма- и дельтакоронавирусы заражают почти исключительно птиц2. На сегодняшний день семь коронавирусов (CoV) пересекли видовые барьеры и стали коронавирусами человека (HCoV): два альфа-CoV (HCoV-229E и HCoV-NL63) и пять б....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протоколы с участием трансгенных мышей K18 hACE2 были одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности (IBC) Техасского биомедицинского научно-исследовательского института (TBRI) и Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC). Все эксперименты проводятся в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию Национальным исследовательским советом40. При работе с мышами требуется соответствующее средство индивидуальной защиты (СИЗ).
1. Использование трансгенных мышей K18 hACE2
- Покупка и содержание 4-6-недельны....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Инфекция rSARS-CoV-2/Nluc у трансгенных мышей K18 hACE2 (рисунки 1 и 2)
На рисунке 1А показано схематическое изображение rSARS-CoV-2/WT (вверху) и rSARS-CoV-2/Nluc (снизу), используемых для оценки инфекций in vivo. На рисунке 1B показана схематическая блок-схема, применяемая для оценки динамики инфекции rSARS-CoV-2/Nluc у трансгенных мышей K18 hACE2. Четырех-шестинедельные самки трансген.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол демонстрирует возможность использования этих rSARS-CoV-2 экспрессирующих репортерных генов для мониторинга вирусных инфекций in vivo. Оба репортер-экспрессирующих рекомбинантных вируса являются отличным инструментом для изучения инфекций SARS-CoV-2 in vivo. Описанные системы визуализации ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) и in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) представляют собой отличный вариант для понимания динамики инфекции SARS-CoV-2, вирусного патогенеза и выявления инфицированных кл.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии какого-либо коммерческого, финансового и нефинансового или личного конфликта интересов в отношении описываемой работы.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить членов нашего института (Техасского института биомедицинских исследований) за их усилия по поддержанию наших объектов в полной рабочем состоянии и безопасности во время пандемии COVID-19. Мы также хотели бы поблагодарить наш Институциональный комитет по биобезопасности (IBC) и Spell (IACUC) за обзор наших протоколов эффективным по времени образом. Мы благодарим доктора Томаса Морана из Медицинской школы Айкана на горе Синай за предоставление моноклонального антитела к протоклональному белку нуклеокапсида (N) sarS-CoV с перекрестным реактивным 1C7C7 (N). Исследования SARS-CoV-2 в лаборатории Мартинеса-Собридо в настоящее время поддерживаются ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Хранить при комнатной температуре (RT) |
| 1% DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
| 10% раствор формалина, нейтральный буферный | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Agar | Oxoid | LP0028 | |
| 24-луночный планшет для клеточной культуры | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 5% бикарбонат натрия | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| 6-луночный планшет для клеточной культуры | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-луночный планшет для клеточной культуры | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Эпителиальные клетки почек африканской зеленой мартышки (Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
| Aura Программное обеспечение для визуализации 3.2.0 | Spectral Instruments | Программное обеспечение для анализа изображений | |
| Бычья сыворотка Альбумин (BSA), 35% | Sigma-Aldrich | A9647 | Хранить при 4 ° |
| C Культура клеточной культуры водная Corning | 25-055-CV | ||
| Dulbecco' s модифицированный Eagle' s среда (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Хранить при 4 ° |
| C Газовый аппарат для анестезии | Veterinary Anesthesia Systems, Inc. | VAS 2001R | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Хранить при -20 °deg; C |
| Самки трансгенных мышей K18-hACE2 в возрасте от четырех до шести недель | The Jackson Laboratory | 34860 | |
| Graphpad Prism Version 9.1.0 | GraphPad | ||
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Храните в RT |
| MARS Программное обеспечение для анализа данных | BMG LABTECH | ||
| MB10 таблетки | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | Храните в RT |
| Реактив для анализа нано-Glo люциферазы | Promega | N1110 | Этот реагент используется для измерения активности Nluc. Хранить при -20 °deg; C |
| Nunc MicroWell 96-луночные микропланшеты | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Nunc MicroWell 96-луночные микропланшеты | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| пенициллин/стрептомицин/L-глютамин (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | хранить при -20 °°; C |
| PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
| Precelleys Evolution гомогенизатор | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| Гомогенизация мягких тканей CK14 – 7 мл | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
| T75 EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP Kit, пероксидаза | Vector Laboratories | PK-4002 | ABC и набор DAB-пероксидазного субстрата |
Ссылки
- V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
- Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome cor....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
