Методическая статья

Создание мышиной модели тяжелого острого панкреатита с использованием ретроградной инъекции таурохолата натрия в билиопанкреатический проток

DOI:

10.3791/63129

⸱

1 апреля 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Soochow University, 2MOE Engineering Center of Hematological Disease, Soochow University, 3Cyrus Tang Hematology Center, Soochow University, 4National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, the First Affiliated Hospital of Soochow University, 5MOH Key Lab of Thrombosis and Hemostasis, Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 6Collaborative Innovation Center of Hematology, Soochow University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем описана мышиная модель тяжелого острого панкреатита. Процедура, представленная здесь, очень быстрая, простая и доступная, что потенциально позволяет изучать молекулярные механизмы и различные терапевтические вмешательства при остром панкреатите удобным способом.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Распространенность острого панкреатита (АП), особенно тяжелого острого панкреатита (САП), ежегодно увеличивается в младших возрастных группах. Однако в современной клинической практике не хватает эффективных методов лечения. Благодаря легкой доступности трансгенных и нокаутных штаммов и их небольшому размеру, что позволяет использовать минимальные дозы препаратов, необходимых для оценки in vivo , для исследования АП предпочтительна хорошо зарекомендовавшая себя экспериментальная модель на мышах. Кроме того, SAP, индуцированный с помощью таурохолата натрия (TC), в настоящее время является одной из наиболее широко используемых и наиболее характеризуемых моделей. Эта модель была исследована для новых методов лечения и возможных молекулярных событий во время процесса AP. Здесь мы представляем поколение модели мыши AP с использованием таурохолата натрия и простого самодельного микрошприца. Кроме того, мы также предоставляем методологию для последующего гистологического и серологического тестирования.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Острый панкреатит (АП) – острое воспаление поджелудочной железы, характеризующееся обструкцией главного протока поджелудочной железы с последующим растяжением протоков и аутоперевариванием поджелудочной железы ее аномально активированными ферментами. Его клинические проявления включают местное или системное воспаление, боль в животе и повышение уровня амилазы в сыворотке крови1,2. Согласно классификации тяжести3, АП может присутствовать в легких, умеренных и тяжелых формах, и среди них тяжелый острый панкреатит (САП) является наиболее тревожным состоянием из-за его высокой смертности более 30%4. В Соединенных Штатах AP является одной из наиболее распространенных причин госпитализации, затрагивающей более 200 000 пациентов5. Кроме того, АП, особенно САП, ежегодно увеличивается и затрагивает младшие возрастные группы6. Однако в современной клинической практике отсутствуют эффективные варианты лечения6,7. Поэтому необходимо исследовать молекулярные механизмы, участвующие в АП, тем самым способствуя улучшению лечения.

Хорошо зарекомендовавшие себя экспериментальные модели на животных необходимы для изучения механизмов, участвующих в АП, и оценки эффективности различных методов лечения. Благодаря легкой доступности трансгенных и нокаутных штаммов и их небольшому размеру, что сводит к минимуму дозы препаратов, необходимых для оценки in vivo, мыши предпочтительны для исследования AP. Поэтому на мышах было разработано несколько моделей АП8,9.

Работая с моделью крыс с легким панкреатитом, индуцированной путем внутривенного введения caerulein10, Niederau et al. разработали модель мыши SAP, представленную с некрозом ацинарных клеток, индуцированным с использованием того же препарата и инъекционного маршрута11. Хотя эта модель обладает рядом преимуществ, включая неинвазивность, быструю индукцию, широкую воспроизводимость и применимость, основным недостатком является то, что в большинстве случаев развивается только легкая форма АП, тем самым ограничивая ее клиническую значимость. Алкоголь считается одним из основных этиологических факторов АП; Однако Foitzik et al. сообщили, что он вызывает повреждение поджелудочной железы только в сочетании с другими факторами, такими как экзокринная гиперстимуляция12. Более того, хотя модели АП, индуцированные алкоголем, разработанные с помощью различных путей введения, и дозы лекарств были зарегистрированы13,14,15, их основным недостатком является трудность их воспроизведения. Внутрибрюшинное введение L-аргинина также может индуцировать AP у мышей16; однако его низкая клиническая значимость препятствует его применению. Таурохолат, желчная соль, был впервые предложен Creutzfeld et al. в 1965 году для индуцирования состояния, напоминающего человеческий AP, посредством инфузии протоков поджелудочной железы17. Хотя существуют споры относительно его клинической значимости в патофизиологии18,19, панкреатит, вызванный таурохолатом, остается незаменимой моделью для SAP.

Поскольку эта модель проста в реализации, а также эффективна на мышах, в настоящее время она является одной из наиболее часто используемых моделей AP для исследований на мелких животных in vivo. Perides et al. использовали таурохолат натрия (TC) для индуцирования SAP у мышей20, предоставляя понимание для понимания его патологии. В сочетании с методами генетической модификации эта модель позволила нам подтвердить несколько конкретных генов, участвующих в AP. Например, Bicozo et al. показали, что нокаут гена CD38 защищает от модели панкреатита TC-инфузии и приписывает механизмы изменениям во внутриклеточной передаче сигналов Ca2+21. Fanczal et al. исследовали физиологическое значение экспрессии TRPM2 в плазматической мембране ацинарных и протоковых клеток поджелудочной железы мыши и продемонстрировали снижение тяжести TC-индуцированного SAP у нокаутирующих мышей TRPM22. Кроме того, эта модель также обеспечивает простой и эффективный способ тестирования многих новых лекарств in vivo. Например, этот метод позволил валидировать терапевтические эффекты кофеина23, дегидрохолевой кислоты24 и различных антиоксидантов и антикоагулянтов25,26. Эти данные демонстрируют универсальность модели SAP, индуцированной TC. Хотя Wittel et al. описали аналогичную модель мыши27, отсутствие подробностей о процедурах реализации может привести к невозможности воспроизвести результаты. В этой статье мы сосредоточимся на методах с использованием простого самодельного микрошприца и исследуем TC-индуцированный SAP, тем самым предоставляя возможное руководство не только для дальнейшего изучения патогенеза и лечения АП, но и для идеально адаптируемого экспериментального метода для многих других веществ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты с участием животных были одобрены Комитетом по этике животных Университета Сучжоу. Все хирургические процедуры проводились под полным наркозом. Анальгетики не применялись, чтобы избежать вмешательства в естественное течение болезни согласно предыдущим литературам28,29. Одобрение отсутствия анальгезии было также предоставлено Комитетом по этике животных Университета Сучжоу.

1. Подготовка

  1. Голодайте мышь дикого типа C57BL/6 за 8-12 ч до операции.
  2. Готовят 5% (мас./об.) раствор ТС (93 мМ), разбавленный в 0,9% натрия хлорида. Процедите раствор через фильтр 0,22 мкм.
  3. Автоклав хирургических инструментов и материалов, включая щипцы, ножницы, держатель лезвия, держатель иглы, гемостатический зажим, сосудистые зажимы и стерильные шторы, используя стерилизатор давления при температуре 121 °C в течение 30 мин.
  4. Приготовьте самодельный микрошприц. Для этого вручную установите одноразовый инсулиновый наконечник и удлиненный пластиковый наконечник пипетки на шприц Microliter с плоским наконечником объемом 25 мкл. Стерилизуют путем облучения.

2. Анестезия и предоперационная подготовка

  1. Весите от 6 до 8 недель самцов C57BL/6 мышей дикого типа (примерно 21-23 г). Индуцируют общую анестезию внутрибрюшинной инъекцией 1% пентобарбитала раствором натрия в дозе 50 мг/кг.
  2. Зафиксируйте мышь в положении лежа на спине на плоской пластине из анирадиированной пены с помощью ленты.
  3. Подготовьте область операции каждого животного, удалив его шерсть с кремом для депиляции от уровня мечевидного отростка вниз до соединительной линии двустороннего переднего верхнего подвздошного отдела позвоночника, с левой и правой сторонами, параллельными передней подмышечной линии.
  4. Подготовьте стерильное хирургическое поле с особым акцентом на хирургическую область, состоящую из области, подготовленной на животном и передней части хирурга.
    1. Продезинфицируйте столешницу.
    2. Очистите место разреза с помощью многократных применений раствора хирургического скраба. Протрите кожу два-три раза 0,5% йодофором и каждый раз давайте ей высохнуть в течение 1-2 мин.
    3. Накройте мышь стерильными шторами.

3. Хирургическая процедура

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 изображена анатомия и морфология поджелудочной железы мыши до и после ретроградной инъекции ТК в билиопанкреатический проток путем микроинъекции.

  1. Сделайте средний разрез брюшной полости длиной от 2 до 3 см.
  2. Расположите двенадцатиперстную кишку слева направо вдоль желудка. Осторожно вытяните двенадцатиперстную кишку наружу и в левую сторону, используя хирургические щипцы и пропитанный дезинфицирующим средством ватный тампон, чтобы обнажить поджелудочную железу, билиопанкреатический проток и дуоденальный сосочек. Позаботьтесь о том, чтобы не повредить стенку кишечника или связанные с ней сосуды.
  3. Использование 8-0 Швы проходят через соединение между двенадцатиперстной кишкой и поджелудочной железой вокруг сосочка, и натягивают их на левую сторону тела мыши, чтобы зафиксировать двенадцатиперстную кишку.
  4. Аккуратно оттяните кожу и нижний край печени в сторону. Зажмите общий печеночный проток, следя за тем, чтобы не зажимать воротную вену или поджелудочную железу. Зажмите проксимальный билиопанкреатический проток.
  5. Ретроградно проткните микроинъектор в дистальный билиопанкреатический проток. Зафиксируйте кончик иглы возле двенадцатиперстной кишки с помощью зажима. Вводят 10 мкл 5% ТК в проток поджелудочной железы со скоростью 5 мкл/мин.
  6. Держите билиопанкреатический проток закрытым в течение 5 минут для достижения стабильного давления. Затем вытащите микроинжектор и снимите зажимы.
  7. Восстановить двенадцатиперстную кишку до исходного анатомического положения и проверить кровотечение.
  8. Закройте рану 6-0 швами и продезинфицируйте 0,5% йодофором.

4. Восстановление и послеоперационное ведение

  1. Извлеките животных из анестезии на термопрокладке с температурой 37 °C. Не отправляйте прооперированных животных во временное послеоперационное помещение, пока все животные не проснутся.
  2. Вводят 0,8 мл 0,9% физиологического раствора подкожно и медленно для приема жидких добавок.
  3. Следите за животными после операции на предмет их общего состояния и признаков инфекций или болезни.

5. Серологическое тестирование и оценка гистологии

  1. Через 24 ч после операции обезболивают мышей пентобарбиталом натрия, используя ту же дозу и инъекционный путь.
  2. Соберите всю кровь из брюшной аорты (около 0,8 мл на мышь) и вращайтесь при 1 500 х г в течение 15 мин, чтобы изолировать сыворотку для дальнейшего тестирования.
  3. Соберите ткани поджелудочной железы.
  4. Откройте грудную полость для сбора легочных тканей.
  5. Измерьте показатели биохимической функции сыворотки, включая амилазу, липазу, функцию печени (аланинтрансаминазу (АЛТ) и аспартаттрансаминазу (АСТ)) и функцию почек (мочевина и креатин), используя коммерческие наборы в соответствии с инструкциями производителей.
  6. Гомогенизировать ткани легких и поджелудочной железы и измерить уровень миелопероксидазы (МПО) с помощью коммерческого комплекта в соответствии с инструкциями производителя.
  7. Вскройте грудную полость и дважды продуйте 20 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), затем соберите поджелудочную железу. Погрузить в 4% раствор параформальдегида на 24 ч. Обезвоживают в серии концентраций алкоголя и встраивают в парафин.
  8. Используйте микротом для подготовки участков ткани поджелудочной железы толщиной 5 мкм.
  9. Выполните окрашивание H&E для гистологической оценки поджелудочной железы.
  10. Оцените патологические оценки в соответствии с критериями, предложенными Schmidt et al.30.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тщательно следуя приведенным выше инструкциям, мы получили среднюю продолжительность операции около 40 минут. Мыши были слегка неактивны и потеряли примерно 0,5-1,75 г, 0,85-1,85 г и 0,5-4,73 г веса через 24 ч, 48 ч и 72 ч после операции соответственно (рисунок 2).

С момента завершения операции до 24 ч после операции, по мере развития заболевания, мыши становились неактивными и демонстрировали медленные реакции и действия.

Выживаемость ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модель SAP, индуцированная TC, является отличным инструментом исследования. Как показано в этом исследовании, эта модель очень легко реализуется в общих лабораториях без использования конкретных устройств. При использовании в сочетании с гистологическим и биохимическим анализом он обеспечивает затратный (недорогие реагенты) и экономящий время (24-часовое временное окно) подход для индуцирования и оценки АП. Корректировка концентрации ТС также дает возможность получения легкого и умеренного АП. Перидес и др. также использ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны за поддержку со стороны следующих грантов: грант на трансляционные исследования NCRCH [2020WSA01], научный грант KJXW от Комиссии по здравоохранению Сучжоу для молодых ученых [KJXW2020002], План науки и техники города Сучжоу (SKY2021038 и SKJY2021050), грант от Приоритетной академической программы развития высших учебных заведений Цзянсу (PAPD) и План первичных исследований и социального развития провинции Цзянсу (BE2018659).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,5% йодофорShanghai Likang Disinfectant3101024 мл/мышь
0,9% хлорид натрияSinopharm Group Co., Ltd.100193180,8 мл/мышь
1% пентобарбитал натрияSigmaP37610,2 -0,25 мл/мышь
25 μ L Шприц с плоским наконечником МикролитрGaoge, ШанхайA124019
4% параформальдегидаBeyotime, Наньтун, КитайP0099-500мл
5% таурохолат натрия (TC)АладдинS100834-5г10 μ L/SAP мышь
6-0 Стерильный нейлоновый микрошовный материал с иглой с резьбой (1/2 круга)Cheng-He20093
75% спиртSinopharm Group Co., Ltd.100092184 мл/мышь
8-0 Стерильный нейлоновый микрошовный материал с иглой с резьбой (3/8 круга)Cheng-He19064
Набор для анализа активности ALTEPNK, Аньхой, КитайALT0012
Набор для анализа амилазыEPNK, Аньхой, КитайAMY0012
Угловой маленький бульдожий зажим с челюстью 12 мм (3 см)Cheng-HeHC-X022
осиновая стружка или измельчения для подстилки для мышейBeijing Vital River Laboratory Animal TechnologyVR03015
AST Activity Assay KitEPNK, Аньхой, КитайAST0012
Набор для анализа азота мочевины крови (BUN)EPNK, Аньхой, КитайBUN0011
C57BL/6 мышьBeijing Vital River Laboratory Animal Technology213
Набор для анализа креатинаEPNK, Аньхой, Китай
Характеристика микротомного лезвияBeyotime, Наньтун, КитайE0994
Гемостатические щипцы (9,5 см, изогнутые)JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.JC3901
Набор для анализа липазыJiancheng, Нанкин, КитайA054-2-1
MicrotomeLeica biosystem, ГерманияRM2245
Биохимический анализаторMindray Mindray, Шэньчжэнь, КитайBS-420
MPO Jiancheng, Нанкин, КитайA044-1-1
Нормальный мышиный чауТрофик, Наньтун, КитайLAD 1000
Фосфат буферный физиологический растворBeyotime, Nantong, КитайC0221A
Прямой зажим микробульдога с губкой 5 мм (1,5 см)JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.W40130
Прямые или изогнутые щипцы (11,0 см)Cheng-HeHC-X091A или HC-X090A
Прямые ножницы (10,0 см)Cheng-He, Нинбо, КитайHC-J039102
Центрифуга Thermo ScientificThermo Scientific, СШАMultifuge X1R
CRE0012 Набор для анализа

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, P. J., Papachristou, G. I. New insights into acute pancreatitis. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (8), 479-496 (2019).
  2. Mandalia, A., Wamsteker, E. J., DiMagno, M. J. Recent advances in understanding and managing acute pancreatitis. F1000Research. 7, 959(2018).
  3. Banks, P. A., et al. Classification of acute pancreatitis-2012: revision of the Atlanta classification and definitions by international consensus. Gut. 62 (1), 102-111 (2013).
  4. Munir, F., et al. Advances in immunomodulatory therapy for severe acute pancreatitis. Immunology Letters. 217, 72-76 (2020).
  5. Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143 (5), 1179-1187 (2012).
  6. Hines, O. J., Pandol, S. J. Management of severe acute pancreatitis. BMJ. 367, 6227(2019).
  7. James, T. W., Crockett, S. D. Management of acute pancreatitis in the first 72 hours. Current Opinion in Gastroenterology. 34 (5), 330-335 (2018).
  8. Silva-Vaz, P., et al. Murine models of acute pancreatitis: a critical appraisal of clinical relevance. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2794(2019).
  9. Hyun, J. J., Lee, H. S. Experimental models of pancreatitis. Clinical Endoscopy. 47 (3), 212-216 (2014).
  10. Renner, I. G., Wisner, J. R., Rinderknecht, H. Protective effects of exogenous secretin on ceruletide-induced acute pancreatitis in the rat. Journal of Clinical Investigation. 72 (3), 1081-1092 (1983).
  11. Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5), 1192-1204 (1985).
  12. Foitzik, T., et al. Exocrine hyperstimulation but not pancreatic duct obstruction increases the susceptibility to alcohol-related pancreatic injury. Archives in Surgery. 129 (10), 1081-1085 (1994).
  13. Schneider, L., Dieckmann, R., Hackert, T., Gebhard, M. M., Werner, J. Acute alcohol-induced pancreatic injury is similar with intravenous and intragastric routes of alcohol administration. Pancreas. 43 (1), 69-74 (2014).
  14. Huang, W., et al. Fatty acid ethyl ester synthase inhibition ameliorates ethanol-induced Ca2+-dependent mitochondrial dysfunction and acute pancreatitis. Gut. 63 (8), 1313-1324 (2014).
  15. Sun, J., et al. NRF2 mitigates acute alcohol-induced hepatic and pancreatic injury in mice. Food and Chemical Toxicology. 121, 495-503 (2018).
  16. Kui, B., et al. New insights into the methodology of L-arginine-induced acute pancreatitis. PLoS One. 10 (2), 0117588(2015).
  17. Creutzfeldt, W., Schmidt, H., Horbach, I. Studies on the effects of a trypsin inhibitor (Trasylol) on Enzyme activities and morphology in taurocholate and calciphylaxis pancreatitis of the rat (a contribution to the pathogenesis of pancreatitis). Klin Wochenschr. 43, 15-22 (1965).
  18. Liu, Z. H., et al. A simple taurocholate-induced model of severe acute pancreatitis in rats. World Journal of Gastroenterology. 15 (45), 5732-5739 (2009).
  19. Cavdar, F., et al. Controversial issues in biliary pancreatitis: when should we perform MRCP and ERCP. Pancreatology. 14 (5), 411-414 (2014).
  20. Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
  21. Orabi, A. I., et al. Cluster of differentiation 38 (CD38) mediates bile acid-induced acinar cell injury and pancreatitis through cyclic ADP-ribose and intracellular calcium release. Journal of Biological Chemistry. 288 (38), 27128-27137 (2013).
  22. Fanczal, J., et al. TRPM2-mediated extracellular Ca(2+) entry promotes acinar cell necrosis in biliary acute pancreatitis. Journal of Physiology. 598 (6), 1253-1270 (2020).
  23. Huang, W., et al. Caffeine protects against experimental acute pancreatitis by inhibition of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-mediated Ca2+ release. Gut. 66 (2), 301-313 (2017).
  24. Zhang, X., et al. Dehydrocholic acid ameliorates sodium taurocholate-induced acute biliary pancreatitis in mice. Biology and Pharmaceutical Bulletin. 43 (6), 985-993 (2020).
  25. Hagiwara, S., et al. Antithrombin III prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Pancreas. 38 (7), 746-751 (2009).
  26. Hagiwara, S., et al. Danaparoid sodium prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Shock. 32 (1), 94-99 (2009).
  27. Wittel, U. A., et al. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 36 (2), 9-21 (2008).
  28. Barlass, U., et al. Morphine worsens the severity and prevents pancreatic regeneration in mouse models of acute pancreatitis. Gut. 67 (4), 600-602 (2018).
  29. Wu, D., et al. A systematic review of NSAIDs treatment for acute pancreatitis in animal studies and clinical trials. Clinical Research in Hepatology and Gastroenterology. 44, 100002(2020).
  30. Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Annals in Surgery. 215 (1), 44-56 (1992).
  31. Junyuan, Z., et al. Quercetin protects against intestinal barrier disruption and inflammation in acute necrotizing pancreatitis through TLR4/MyD88/p38MAPK and ERS inhibition. Pancreatology. 18 (7), 742-752 (2018).
  32. Waldron, R. T., et al. The Orai Ca(2+) channel inhibitor CM4620 targets both parenchymal and immune cells to reduce inflammation in experimental acute pancreatitis. Journal of Physiology. 597 (12), 3085-3105 (2019).
  33. Petersen, O. H., Gerasimenko, J. V., Gerasimenko, O. V., Gryshchenko, O., Peng, S. The roles of calcium and ATP in the physiology and pathology of the exocrine pancreas. Physiological Reviews. 101 (4), 1691-1744 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

pancreatitis

Похожие статьи