Подготовка липидных бислоев, поддерживаемых бисером, для изучения выхода твердых частиц иммунных синапсов Т-клеток

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол поэтапного восстановления синтетических антигенпрезентирующих клеток с использованием липидных бислоев, поддерживаемых бисером, и их использование для опроса синаптического выхода из активированных Т-клеток.

Аннотация

Антигенпрезентирующие клетки (АПК) представляют три активирующих сигнала для Т-клеток, участвующих в физическом контакте: 1) антиген, 2) костимуляция / корепрессия и 3) растворимые цитокины. Т-клетки высвобождают два вида эффекторных частиц в ответ на активацию: транссинаптические везикулы (tSV) и частицы супрамолекулярной атаки, которые переносят межклеточные мессенджеры и опосредуют цитотоксичность соответственно. Эти сущности быстро усваиваются БТП, участвующими в физическом контакте с Т-клетками, что делает их характеристику сложной. В этой статье представлен протокол для изготовления и использования липидных бислоев с поддержкой бисера (BSLB) в качестве антигенпрезентирующих клеточных (APC) миметиков для захвата и анализа этих транссинаптических частиц. Также описаны протоколы абсолютных измерений плотности белка на клеточных поверхностях, восстановления BSLB с такими физиологическими уровнями и процедуры проточной цитометрии для отслеживания высвобождения синаптических частиц Т-клетками. Этот протокол может быть адаптирован для изучения влияния отдельных белков, сложных смесей лигандов, детерминант вирулентности патогенов и лекарств на эффекторный выход Т-клеток, включая хелперные Т-клетки, цитотоксические Т-лимфоциты, регуляторные Т-клетки и химерные антиген-рецептор-экспрессирующие Т-клетки (CART).

Введение

Иммунологический синапс (ИС) представляет собой ключевую молекулярную структуру, образованную на границе раздела клеток, участвующих в физическом контакте, которая облегчает регулируемый обмен юкстракриновой информацией. Различные ИС были описаны в литературе, и растущее количество доказательств предполагает, что эти молекулярные центры являются сохраненной особенностью клеточных сетей. Различные иммунные клетки, включая В-клетки, естественные клетки-киллеры, дендритные клетки, макрофаги и Т-клетки, обмениваются информацией посредством сборки короткоживущих ^{контактов1}. Мультиомные исследования продвигают понимание новых подмножеств лейкоцитов и стромальных клеток, управляющих патогенными клеточными сетями и экспрессирующих поверхностные белки с неизвестными функциями. Как синтетические ПТР, BSLB позволяют непосредственно исследовать функциональную роль отдельных белков в интеграции активирующих сигналов, а именно антигенов и костимуляции/корепрессии, Т-клетками и результирующего высвобождения эффекторных частиц, называемых сигнальной четверкой.

В этом документе описываются протоколы и критические технические моменты, которые следует учитывать при использовании BSLB для имитации состава поверхности модельных БТР. Протоколы количественного измерения иммунных рецепторов и других поверхностных белков на АПК представлены вместе с протоколом восстановления синтетических АТР, содержащих эти измеренные количества. Затем этапы, необходимые для кокультурирования Т-клеток и BSLB, представлены вместе с протоколом количественного измерения транссинаптического переноса частиц с помощью проточной цитометрии. Наиболее примечательно, что BSLB облегчают изучение популяции tSV, полученных из плазматической мембраны, называемых синаптическими эктосомами (SE). Т-клеточные антигенные рецепторы (TCR⁺) SE выделяются в ответ на триггер ^TCR2 и эффективно захватываются BSLBs3, представляя собой отличное считывание для оценки агонистических свойств антигенов и смоделированного состава мембраны. CD63⁺ экзосомы и частицы супрамолекулярной атаки (SMAP) также высвобождаются стимулированными Т-клетками и захватываются BSLB. Они могут быть использованы в качестве дополнительных показаний активации и результирующей экзоцитарной и литической секреции гранул Т-клетками. Мобилизация экзоцитарных везикул к взаимодействующему полюсу Т-клетки также облегчает направленное высвобождение цитокинов, таких как IL-2, IFN-γ и IL-10 в ответ на активацию4,5,6,7,8. Хотя Т-клеточные высвобождаемые цитокины также могут быть обнаружены на BSLB, в настоящее время разрабатывается более специализированное исследование для подтверждения количественного анализа высвобождения цитокинов в иммунологическом синапсе.

Чтобы выяснить, как специфические мембранные композиции влияют на синаптический выход Т-клеток, необходимо определить физиологическую плотность компонента мембраны-мишени. Количественные оценки белков клеточной поверхности на основе проточной цитометрии являются важным шагом в этом протоколе и требуют: 1) использования антител с известным количеством фторхромов на антитело (F / P) и 2) эталонных шариков, обеспечивающих стандартную ссылку для интерполяции молекул фторхрома из измеренных средних интенсивностей флуоресценции (MFI).

Эти эталонные стандарты состоят из пяти популяций шариков, каждая из которых содержит все большее число эквивалентных растворимых флуорохромов (MESF), которые охватывают динамический диапазон произвольного обнаружения флуоресценции. Эти стандартные популяции дают дискретные пики флуоресценции, облегчая преобразование произвольных флуоресцентных единиц в MESF путем простой линейной регрессии. Полученные MESF затем используются вместе со значениями F/P антител для расчета среднего числа связанных молекул на клетку (или BSLB на более поздних этапах). Применение оценочных площадей поверхности клеток к среднему числу обнаруженных молекул позволяет рассчитать физиологические плотности в виде молекул/^мкм2. Этот протокол количественной оценки также может быть адаптирован для измерения плотности белка на Т-клетках и биохимического восстановления мембранных композиций, опосредующих образование гомотипических синапсов Т-клеток (т.е. Т-Т-синапсов9). При необходимости валентность связывания антител может быть дополнительно оценена с помощью рекомбинантных мишеней, меченных известным количеством фторхромов на молекулу. Затем валентность, связывающая антитела, может быть рассчитана для одной и той же популяции BSLB путем одновременного сравнения количества связанных флуоресцентных белков и количественных антител (с использованием двух различных стандартов количественной оценки фторхромов и MESF).

Восстановление мембран APC требует сборки поддерживаемых липидных бислоев (SLB) на бисерах кремнезема1. Запасы липосом, содержащие различные виды фосфолипидов, могут быть использованы для формирования универсальной липидно-двухслойной матрицы, позволяющей закреплять рекомбинантные белки с различной химией связывания (получение липосом подробно описано в ¹⁰). Как только физиологическая плотность (или плотности) соответствующего лиганда «на клетках» определена, тот же протокол проточной цитометрии адаптируется для оценки концентрации рекомбинантного белка, необходимой для покрытия BSLB целевой физиологической плотностью. Две различные анкерные системы могут использоваться как в комбинации, так и по отдельности.

Во-первых, SLB, содержащий конечные 12,5 моль% ^Ni2+-содержащих фосфолипидов, достаточен для обеспечения примерно 10 000 сайтов связывания His-tag на квадратный ^{микрон10} и хорошо работает для украшения BSLB большинством коммерчески доступных белков, физиологическая плотность которых не превышает эту максимальную нагрузочную способность. Вторая система загрузки использует биотинсодержащие фосфолипиды (в виде моля%) для загрузки биотинилированных анти-CD3e Fab (или мономеров HLA / MHC) через мосты стрептавидина. Комбинация этих двух методов декорирования BSLB позволяет гибко адаптировать BSLB как синтетические БТР. Для очень сложных поверхностных композиций APC моль% фосфолипидов и белков может быть увеличен для загрузки столько белков, сколько требуется для рассматриваемого вопроса. После определения рабочих концентраций белков и моль% биотинилированных фосфолипидов BSLB могут быть собраны для опроса синаптического выхода Т-клеток с помощью многопараметрической проточной цитометрии.

Протокол

1. Измерение плотности белков поверхности клеток с помощью количественной проточной цитометрии

1. Получают 0,22 мкм-фильтрованный буфер проточной цитометрии человека (hFCB), добавляя ЭДТА (к конечной концентрации 2 мМ) и сыворотку AB человека (до последних 10%) к стерильному фосфат-буферному физиологическому раствору (PBS), pH 7,4 (см. Таблицу 1). Отфильтруйте раствор с помощью порового фильтра 0,22 мкм для удаления сывороточных примесей и храните при температуре 4 °C.
2. Восстанавливают клетки и откладывают их центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
3. Дважды промыть ячейки PBS. На каждой стадии промывки повторно суспендируйте ячейки в PBS до исходного объема (до центрифугирования) и открутите вниз при 300 × g в течение 5 мин при RT.
4. Подсчитайте суспензии клеток трипана, окрашенных синим цветом, в ^{гемоцитометре11}. В качестве альтернативы можно подсчитывать ячейки, используя исключение электрического тока. Для последнего следуйте инструкциям производителя CASY-TT (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Счетчик клеток CASY-TT позволяет определить процент жизнеспособных клеток, размер клеток и объем клеток.
5. Рассчитайте объем PBS, содержащий разбавление 1:1000 красителя для фиксации жизнеспособности eFluor 780 или аналогичного (см. Таблицу материалов), необходимого для повторного суспендирования клеток до концентрации окрашивания ¹⁰⁷ клеток/мл.
6. Повторно суспендируют клетки с помощью раствора жизнеспособности красителя PBS и инкубируют на льду в течение 30 мин.
7. Удалите краситель жизнеспособности, добавив один объем ледяного hFCB. Открутите при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отныне держите холодовую цепь непрерывной.
8. Промыть клетки hFCB, содержащим 1:50 разбавлением раствора для блокировки fc-рецепторов (см. Таблицу материалов). Доведите объем до конечной концентрации ¹⁰⁷ клеток/мл и инкубируйте в течение дополнительных 15 минут для достижения эффективной блокировки FcgR.
9. Распределите 100 мкл клеточной суспензии (т.е. ¹⁰⁶ ячеек) на лунку U-нижней или V-нижней 96-луночной пластины. Держите ячейки на льду и защищенными от света (накройте алюминиевой фольгой).
10. Приготовьте смесь антител в hFCB, определив оптимальные концентрации антител для каждого фторхром-конъюгированного антитела и, самое главное, для тех антител, которые используются для определения плотности поверхностного белка. Например, для количественной оценки экспрессии ICAM-1 на популяциях тонзиллярных клеток, как показано на фиг.1, готовят смесь, содержащую 1:200 разведений анти-CD4, анти-CD19 и анти-CXCR5 вместе с насыщенными концентрациями анти-ICAM-1 известными фторхромами AF647 на антитело (т.е. 10 мкг/мл, что было определено независимыми экспериментами по титрованию антител).
11. В качестве дополнительного контроля готовят мастер-смесь антител, содержащую соответствующие контрольные изотипы антител (в тех же эффективных концентрациях, что и их аналоги, конъюгированные с теми же фторхромами для фонового вычитания), т.е. используют 10 мкг/мл соответствующего контроля изотипа AF647.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенном выше примере такой элемент управления изотипом используется для вычитания фоновой флуоресценции из истинного сигнала ICAM-1 на ячейках.
12. При количественной оценке плотности белка на подмножествах клеток, присутствующих на низких частотах в тканях, подготовьте флуоресцентные минус один (FMO) контрольные элементы, содержащие все окрашивающие антитела, за исключением маркеров, представляющих интерес (см. дополнительные сведения в ¹²).
13. Раскрутите 96-луночную пластину, содержащую клетки, при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C, отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в 50 мкл либо мастер-смеси антител количественной оценки, либо смеси мастер-смеси антител изотипа.
14. Инкубируйте клетки в течение не менее 30 мин при 4 °C и 400 об/мин с помощью пластинчатого шейкера. Защитите пластины от света (накройте алюминиевой фольгой).
15. Промыть ячейки три раза с помощью hFCB и центрифуги при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C.
16. Повторно суспендировать клеточную гранулу с использованием 200 мкл PBS (т.е. до конечной концентрации 5 × ¹⁰⁶ клеток/мл).
17. Для приобретения:
    1. При использовании стандартного погрузчика BD FACS перенесите образцы на полистирольные трубки круглого дна объемом 5 мл (см. Таблицу материалов).
    2. При использовании высокопроизводительных пробоотборников (HTS, также называемых считывателями пластин), немедленно перейдите к шагу 1.19.
18. Прежде чем приступить к сбору данных для стандартов MESF, проверьте максимальную линейность интенсивности флуоресценции и минимальные пределы для каналов количественной оценки.
19. Перед компенсацией получите данные для стандартов MESF, гарантируя, что как самые тусклые, так и самые яркие популяции попадают в линейный диапазон измерений.
20. Приобретите компенсационные образцы. Сохраняйте значения напряжения фотоумножителя (PMT) для каналов количественной оценки неизменными, чтобы сохранить динамический диапазон обнаружения. Выполните небольшие корректировки напряжения PMT других каналов перед расчетом компенсационных матриц.
21. Рассчитайте и примените компенсацию.
22. Приобретите и сохраните не менее 2 × ¹⁰⁴ бусин MESF для каждого из каналов количественной оценки.
23. Выберите популяцию одиночных ячеек на основе их боковых и передних областей рассеяния света (SSC-A и FSC-A, соответственно, как показано на рисунке 1A (i)), с последующим выбором событий внутри временного континуума (рисунок 1A (ii)) и низких для времени полета (W) как в FSC, так и в SSC по сравнению с их высотой (т.е. FSC-W/FSC-H, за которым следует SSC-W/SSC-H, как показано на рисунке 1A (iii) и (iv), соответственно). Определите конечный шлюз с одним событием, содержащий события с пропорциональным распределением FSC-A и FSC-H (рисунок 1A (v)).
24. Получение контрольных образцов (isotype-labeled и FMO controls).
25. Извлекайте образцы и записывайте до тех пор, пока не будет получено не менее 10 000 клеток-мишеней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: надежное определение средней молекулярной плотности требует анализа нескольких доноров в независимых экспериментах. Это имеет решающее значение при анализе подмножеств клеток, обнаруженных на пониженных частотах или полученных из дефицитного биологического материала (например, из биопсии тканей человека).
26. Промыть работающий цитометр в течение 5 минут чистящим раствором FACS, а затем 5 минут сверхчистой водой перед выключением прибора. Если вы используете HTS, следуйте параметрам на вкладке HTS и программа Clean Plate.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить перенос пробы в образец, активируйте опции промывки сидячего (пробоотборника) или высокопроизводительного пробоотборника , которые будут автоматически промывать цитометр между трубками или скважинами. Перед началом сбора пропустите сверхчистую воду в течение 10 минут с высокой скоростью потока, чтобы удалить любые немытые биологические загрязнения из линии отбора проб цитометра.
27. Экспортируйте файлы стандарта проточной цитометрии (FCS).

2. Регрессионный анализ средней (или медианной) интенсивности флуоресценции (MFI) MESF

1. Откройте программное обеспечение для анализа проточной цитометрии и загрузите файлы FCS эксперимента. Выберите популяцию бусин на основе их боковых и передних областей рассеяния света (SSC-A против FSC-A), как показано на рисунке 1A (i).
2. Контролируйте качество данных путем проверки распределения единичных событий по времени, как указано в шаге 1.24.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки создают пробелы в распределении событий по времени; обычно это проявляется в начале приобретения с использованием HTS. Избегайте выбора событий, обрамляющих пробелы во времени сбора, поскольку они добавляют погрешности измерения из-за оптических аберраций.
3. Сосредоточьтесь на отдельных событиях.
   1. Клетки
      1. сначала определите одиночные ячейки на основе их распределения SSC-A и FSC-A (рисунок 1A (i)), а затем события низкого уровня для W в последовательных затворах FSC-W/FSC-H (синглеты-1, рисунок 1A панель (iii)) и SSC-W/SSC-H (синглеты-2; Рисунок 1А панель (iv)). Определите дополнительный затвор singlets-3, выбрав события с пропорциональными FSC-A и FSC-H (рисунок 1A, панель (v)). Наконец, идентифицируйте живые клетки как отрицательные для поправимого красителя жизнеспособности.
   2. Бусины MESF
      1. Следуйте той же дискриминации синглетов-1 к синглетам-3, что и на этапе 2.3.1.1 (рисунок 1В, панели i)-v)). Определите каждую из популяций MESF (пустые, 1, 2, 3 и 4) на основе их уровней интенсивности флуоресценции (см. Рисунок 1B, панель (vi)).
4. Извлеките из МФО фракции MESF заготовки и от 1 до 4.
5. Генерация скорректированных значений MFI (cMFI) для фракций MESF от 1 до 4 путем вычитания MFI пустой популяции бусин из каждой дроби.
6. Рассчитайте строку, наиболее подходящую для связи между cMFI и значениями MESF, предоставленными поставщиком (независимая переменная, пустая дробь равна нулю).
7. Извлеките наклон (b в уравнении ниже) линейной регрессии MESF над cMFI (на панели (viii) на рисунке 1B показана регрессия, в которой y = a + bx; с a = 0).
8. Извлеките среднюю (для бимодальных флуоресцентных распределений) или среднюю (для нормальных или логарифмических флуоресцентных распределений) интенсивность флуоресценции из интересующих популяций (TFH и B-элементы на рисунке 1A панели (vii)).
9. Как и на этапах 2.5-2.7, извлеките значения MFI из контрольных ячеек, меченных изотипом.
10. Если F/P контроля изотипа совпадает с антителами количественной оценки, исправьте МФО окрашенных клеток, вычитая МФО из клеток, меченных изотипом.
11. Если F/P изотипов отличается от F/P антител количественной оценки, извлеките MESF из изотипов путем деления МФУ меченых изотипами клеток с наклоном, рассчитанным на этапе 2.7. Вычтите изотип MESF из количественной оценки MESF перед оценкой связанных количественных антител.
12. Разделите MESF на F/P антител количественной оценки, чтобы оценить количество связанных молекул на клетку (Molec. _ячейки , как показано на блок-схеме рисунка 1С).
13. Разделите число связанных молекул с расчетной площадью поверхности клетки (CSA (^мкм2)), чтобы извлечь плотность белков в виде молекулы/^мкм2 (рисунок 1C). Для получения более подробной информации обратитесь к разделу репрезентативных результатов.

3. Функциональные виды фосфолипидов для использования при калибровке белкового покрытия BSLBs

1. Используйте 0,4 мМ DOPC (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин) в качестве основного компонента липидного матрикса, образующего поддерживаемый липидный бислой. Разбавьте все другие виды липидов в этом растворе DOPC.
2. Используйте от 0,2 до 1 моль% 0,4 мМ DOPE (1,2-диолеоил-sn-glycero-3-фосфоэтаноламина), конъюгированного с красителями, включая ATTO 390, 488 или 565 (см. Таблицу материалов), для получения BSLB с внутренней флуоресценцией.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренняя флуоресценция BSLB облегчает идентификацию отдельных BSLB и отдельных клеток в экспериментах по синаптикальному переносу.
3. Используйте 12,5 моль% от 0,4 мМ DGS-NTA(Ni) (1,2-диолеоил-sn-glycero-3-[(N-(5-амино-1-карбоксипентил) иминодиуксусная кислота) сукцинил]) для закрепления помеченных His белков. Держите моль% DGS-NTA(Ni) постоянным и выполняйте 2-кратное титрование помеченных His белков, начиная со 100 нМ в качестве самой высокой концентрации. Оставьте одно состояние без белка в качестве отрицательного контроля для абсолютных количественных показателей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вспомогательные сигналы и молекулы адгезии, такие как ICAM-1, разработаны с меткой 12-His для увеличения сродства белка к DGS-NTA(Ni).
4. Используйте Biotinyl Cap PE (1,2-диолеоил-sn-glycero-3-фосфоэтаноламин-N-(cap biotinyl)) для закрепления биотинилированных белков через мосты биотин-стрептавидин-биотин. Используйте 5-кратное последовательное титрование 0,4 мМ Biotinyl Cap PE, покрывающее от 10 моль% до 0 моль% (в качестве отрицательного контроля). Поддерживайте концентрацию стрептавидина и биотинилированных белков постоянной (200 нМ) как в калибровочных экспериментах, так и при восстановлении синтетических АТР для экспериментов по синаптикальному переносу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Регрессионный анализ эмпирических плотностей биотинилированных белков над конечным моль% биотинилового полиэтилена в липидной матрице (также содержащей DGS-NTA(Ni) для закрепления помеченных His белков) определит моль%, который будет использоваться для восстановления целевой плотности антигена.

4. Получение дополнительного буферного физиологического раствора HEPES, содержащего 1% сывороточного альбумина

ПРИМЕЧАНИЕ: Добавленный HEPES-буферный физиологический раствор, содержащий 1% сывороточного альбумина человека (HBS/HSA) или 1% бычьего сывороточного альбумина (HBS/BSA), необходим на этапах промывки и загрузки белка BSLB (таблица 1). Подготовьте 10-кратный раствор HBS и рабочий буфер как можно более свежими; хранить в холодильнике и использовать в течение одного месяца. Хотя BSA является более дешевой альтернативой HSA, он обеспечивает эффективную блокировку ni-хелатирующих ^{липидов13} и рекомендуется для экспериментов с высокой пропускной способностью.

1. Приготовьте 10-кратный запасной буферный раствор дополненного HBS, содержащий 200 мМ HEPES, 7 мМ _Na2HPO4, 1400 мМ NaCl, 50 мМ KCl, 60 мМ глюкозы, 10 мМ _CaCl2 и 20 мМ _MgCl2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Растворение _MgCl2 является высокоэкзотермическим и опасным для ожога. Добавляйте эту соль медленно и на большой объем растворителя. Избегайте приготовления концентрированных растворов (т.е. 1 М) этих солей, поскольку они имеют тенденцию выпадать в осадок с течением времени, что затрудняет их точное добавление к рабочему буферу.
2. Отфильтруйте 10-кратный раствор с помощью фильтрующего блока 0,22 мкм и держите его стерильным при 4 °C.
3. Для 500 мл HBS /has, возьмите 50 мл дополненного 10x раствора HBS, отрегулируйте рН до 7,4, если это необходимо, и увеличьте объем до 483,4 мл сверхчистой водой.
4. Добавьте 16,6 мл 30% раствора HSA к 483,4 мл HBS, рН 7,4.
5. Для 500 мл HBS/BSA растворить 5 г BSA в HBS и инкубировать при 37 °C в течение 30 мин. Затем осторожно перемешайте при RT, периодически переворачивая бутылку, пока не появятся видимые кристаллы белка или сгустки.
6. Фильтруйте полученный раствор с этапа 4,5 с помощью фильтрующего блока 0,22 мкм (см. Таблицу материалов) и храните его при 4 °C.

5. Калибровка плотности белка на BSLB

1. Перед тем, как взять нефункционализированные кварцевые шарики диаметром 5,00 ±0,05 мкм, хорошо перемешайте запасной раствор и повторно суспендируйте любые большие скопления бусин, осажденных на дне колб.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кварцевые шарики имеют тенденцию быстро оседать, что может привести к ошибкам подсчета. Энергично перемешивайте, пипетируя вверх и вниз половину максимального объема микропипетки P1000.
2. Разбавьте 1 мкл бисерного раствора в 1000 мкл PBS, подсчитайте шарики с помощью камеры гемоцитометра и рассчитайте их концентрацию на мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание трипанов в синий цвет не требуется для визуализации бисер кремнезема.
3. Рассчитайте объем кварцевых шариков, необходимых для 5 × ¹⁰⁵ конечных BSLB на точку титрования.
4. Перенесите необходимый объем шариков кремнезема в стерильную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
5. Трижды вымойте шарики кремнезема 1 мл стерильного PBS, центрифугируйте шарики в течение 15 с на настольной микроцентрифуге на RT (при фиксированных оборотах).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При удалении моющего раствора не нарушайте гранулу бусины. Небольшой буферный столбец не повлияет на распространение липосом, составляющих мастер-микс липосом, поскольку они также находятся в PBS.
6. Подготовьте три тома липосомной смеси для сборки BSLB на промытых кварцевых шариках (например, если начальный общий объем бисер кремнезема составляет 20 мкл, приготовьте минимум 60 мкл мастер-смеси липосом).
7. Для титрования биотиниловых колпачков PE моль%
   1. Приготовьте липидные мастер-смеси, содержащие 5-кратные разведения Биотинилкап ПЭ.
      1. Разбавляют 0,4 мМ биотиниловый колпачок ПЭ моль% в 100% DOPC матрице.
      2. Смешайте каждую точку титрования Biotinyl Cap PE mol% в соотношении 1:1 (об/об)с раствором 0,4 мМ 25% DGS-NTA(Ni) таким образом, чтобы во всех титровании присутствовали конечные 12,5 моль% Ni-содержащих липидов.
         ПРИМЕЧАНИЕ: 12,5 моль% (об.:об.%) Ni-содержащих липидов представляют собой смешанный липидный состав BSLB, на котором his-меченые белки также могут быть протестированы в параллельных калибровках. Например, поскольку все запасы липосом получают в одной и той же молярной концентрации, чтобы достичь целевой моль% смеси в 200 мкл окончательной смеси липосом, просто смешайте 100 мкл 25 моль% Ni-содержащего DGS-NTA со 100 мкл 100 моль% DOPC.
   2. Переложите 5 × ¹⁰⁵ промытых шариков кремнезема в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл таким образом, чтобы на каждую трубку собиралась одна точка титрования Биотинильного колпачка ПЭ моль%.
   3. Добавьте мастер-смеси для титрования Biotinyl Cap PE mol% в промытые шарики кремнезема и аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз половину общего объема. Избегайте образования пузырьков, которые в избытке разрушают липидный бислой.
   4. Добавьте газ аргон (или азот) в трубку, содержащую образующиеся BSLB, чтобы вытеснить воздух и защитить липиды от окисления во время смешивания.
   5. Добавьте аргон в запасы липидов 0,4 мМ перед хранением и манипулируйте используя стерильную технику.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подключите небольшую трубку к газовому баллону с аргоном/азотом. Перед добавлением газа в трубки отрегулируйте регулятор газового баллона так, чтобы давление было установлено не выше 2 фунтов на квадратный дюйм. Подключите стерильный наконечник пипетки к выходной трубке, чтобы направить поток газа внутрь липосомного материала на 5 с и быстро закрыть крышку. В случае липидных запасов закройте крышку трубки парафиновой пленкой перед хранением при температуре 4 °C.
   6. Переместите BSLB в вертикальный лабораторный смеситель с переменным углом наклона (см. Таблицу материалов) и перемешивайте в течение 30 минут на RT, используя орбитальное смешивание 10 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап предотвратит осаждение шариков во время образования поддерживаемого липидного бислоя.
   7. Раскрутите шарики центрифугированием в течение 15 с в RT на настольной мини-центрифуге, а затем трижды промыть 1 мл HBS / HSA (BSA), чтобы удалить лишние липосомы.
   8. Блокируют образующиеся BSLB путем добавления 1 мл 5% казеина или 5% BSA, содержащего 100 мкМ _NiSO4 для насыщения участков NTA и 200 нМ стрептавидина для равномерного покрытия всех биотиновых анкеровочных участков на BSLB. Аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз половину общего объема, и инкубируйте в вертикальном смесителе не более 20 мин при RT и 10 об/мин.
   9. Раскрутите BSLB путем центрифугирования в течение 15 с на RT на настольной миницентрифуге, а затем трижды промыть 1 мл буфера HBS/HSA (BSA).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите промытые бусины вертикально с небольшим объемом промывочного буфера, покрывающего BSLB. Избегайте обезвоживания BSLB, так как воздух разрушит липидный бислой.
8. Для титрования his-меченых белков на 12,5 моль% DGS-(Ni)NTA-содержащих BSLB
   1. Приготовьте три тома липосомной мастер-смеси, содержащей конечные 12,5 моль% DGS-NTA(Ni).
   2. Используйте липосомную смесь, чтобы повторно суспендировать промытые шарики кремнезема и аккуратно перемешать, пипетируя вверх и вниз половину общего объема. Избегайте образования пузырьков, которые в избытке повреждают липидный бислой.
   3. Добавьте газ аргон (или азот) в трубку, содержащую образующиеся BSLB, чтобы вытеснить воздух и защитить липиды от окисления во время смешивания.
   4. Добавьте аргон в запасы липидов 0,4 мМ перед хранением и манипулируйте используя стерильную технику.
   5. Переместите BSLB в вертикальный смеситель и перемешивайте в течение 30 минут на RT, используя орбитальное смешивание при 10 оборотах в минуту.
   6. Раскрутите шарики центрифугированием в течение 15 с в RT на настольной мини-центрифуге, а затем трижды промыть 1 мл HBS / HSA (BSA), чтобы удалить лишние липосомы.
   7. Блокируют образующиеся BSLB путем добавления 1 мл 5% казеина (или 5% BSA), содержащего 100 мкМ _NiSO4 , для насыщения NTA-сайтов на BSLB. Осторожно перемешайте и инкубируйте в вертикальном смесителе не дольше 20 мин при RT и 10 об/мин.
   8. Промыть три раза, используя HBS/HSA (BSA), чтобы удалить лишний блокирующий раствор.
   9. В новой U-нижней 96-луночной пластине готовят 2-кратное серийное разведение белков.
      1. Подготовьте начальную концентрацию 100 нМ для интересующего белка в общем объеме 200 мкл буфера HBS/HSA (BSA), распределите 100 мкл этого раствора в первой колонке, а оставшиеся 100 мкл поверх колонки No2, содержащей 100 мкл буфера HBS/HSA (BSA).
      2. Продолжайте последовательно передавать 100 мкл из колонки No 2 в колонку No 3 и повторяйте по мере необходимости, чтобы охватить все точки титрования. Оставьте последний столбец серии без белка, так как он будет использоваться в качестве пустой ссылки для количественной оценки.
   10. Повторно суспендировать подготовленные BSLB в объеме таким образом, чтобы 5 × ¹⁰⁵ BSLB содержались в 100 мкл буфера HBS/HSA (BSA).
   11. Перенесите 100 мкл суспензии BSLB в скважины второй U-нижней 96-луночной плиты таким образом, чтобы каждая скважина получала 5 × ¹⁰⁵ BSLB.
   12. Открутите вторую пластину, содержащую BSLB, в течение 2 мин при 300 × г и RT и выбросьте супернатант.
   13. Перенесите объемы 100 мкл с пластины титрования белка на пластину, содержащую осажденные BSLB. Осторожно перемешайте, избегайте образования избыточных пузырьков во время пипетки и инкубируйте в течение 30 мин при RT и 1000 об/мин с помощью пластинчатого шейкера. Защитите от света алюминиевой фольгой.
   14. Промыть пластину три раза буфером HBS/HSA (BSA), используя ступени осаждения 300 × г в течение 2 мин при RT.
   15. Если рекомбинантный белок, используемый при калибровке, непосредственно конъюгирован с фторхромами и имеет известные значения F/P, перейдите к шагу 5.8.20.
   16. Если рекомбинантный белок, используемый при калибровке, не маркирован или конъюгирован с фторхромами или нет стандарта MESF, используйте Alexa Fluor 488 или 647-конъюгированные антитела с известными значениями F / P для окрашивания BSLB с белковым покрытием.
   17. Окрашивание с насыщенными концентрациями количественных антител.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от целевого уровня экспрессии они варьируются от 5 до 10 мкг/мл.
   18. Окрашивание в течение 30 мин при RT и 1000 об/мин с помощью пластинчатого шейкера. Защитите от света с помощью алюминиевой фольги.
   19. Дважды промывайте буфером HBS/HSA (BSA) и один раз PBS, используя ступени осаждения 300 × г в течение 2 мин при RT.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте PBS, pH 7.4 для повторного суспендирования промытых BSLB перед приобретением. Не следует использовать буферы, содержащие белок, так как это приводит к образованию пузырьков при автоматическом смешивании образцов с высокопроизводительными пробоотборниками.
   20. Приобретите стандарты MESF, убедившись, что самые яркие пики остаются в линейном диапазоне обнаружения для детектора количественной оценки (канала), как показано на рисунке 1B (vii).
   21. Приобретайте образцы вручную или с помощью HTS. При использовании последнего повторно суспендируют BSLB в 100 мкл PBS и приобретают 80 мкл, используя скорость потока от 2,5 до 3,0 мкл/с, объем смешивания 100 мкл (или 50% от общего объема, если объем повторного суспендирования меньше), скорость смешивания 150 мкл/с и пять смесей для обеспечения монодисперсирования BSLB.
   22. Экспортируйте файлы FCS.
   23. Сосредоточьтесь на единичных событиях для анализа (рисунок 2A), так как дублеты или триплеты внесут ошибку в определение. Используйте вложенную идентификацию отдельных событий, как указано на этапе 1.2.3 протокола.
   24. Измерьте МФО каждой фракции MESF (1-4) и вычтите MFI из пустых шариков для извлечения скорректированных MFI (cMFI).
   25. Выполнить линейный регрессионный анализ для извлечения уклона (b) MESF над cMFI, рассчитанным для стандартов MESF, который будет использоваться на этапе 5.33.
   26. Извлеките МФО из каждой точки титрования и вычтите МФО бусин без белка для получения цМФИ.
   27. Разделите cMFI на наклон, рассчитанный на шаге 5.31, чтобы извлечь MESF, привязанный к BSLB для каждой точки титрования.
   28. Разделите MESF, связанный с BSLB, на значение F/P количественного антитела для извлечения среднего числа молекул, связанных на BSLB.
   29. Используя диаметр BSLB (5,00 ± 0,05 мкм), извлеките площадь поверхности шарика (SA = ^4pr2) для расчета конечной плотности белка (молек./^мкм2) на точку титрования (концентрацию белка).
   30. Выполните новый регрессионный анализ концентрации белка над плотностью белка , чтобы рассчитать наклон (b) линии наилучшего соответствия.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация 12,5 моль% DGS-NTA(Ni) обеспечивает максимальную анкерную способность приблизительно 10 000 молек/^мкм210 без индуцирования неспецифической активации Т-клеток или влияния на боковую подвижность SLB.

6. Проведение экспериментов по синаптическому переносу между Т-клетками и BSLB

1. Перед запуском эксперимента по синаптическому переносу
   1. Приобретайте нефлуоресцентные BSLB, BSLB с флуоресцентными липидами, неокрашенные клетки (или компенсационные шарики; см. Таблицу материалов) и одноцветные окрашенные ячейки (или компенсационные шарики) для идентификации взаимодействий флуоресцентного спектра прибора. Сосредоточьтесь на детекторах с высоким распространением побочных эффектов, чтобы перепроектировать полихроматическую панель, повысить чувствительность и уменьшить погрешность измерения на критических детекторах (см. ¹⁴).
   2. Титруйте антитела для обнаружения, чтобы найти оптимальную концентрацию, позволяющую обнаруживать положительные события без ущерба для обнаружения отрицательных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторяйте этот шаг всякий раз, когда изменяется партия антител, поскольку значения F / P и яркость варьируются от партии к партии.
   3. Дополнительно: Оптимизируйте напряжения PMT путем получения образца в различных диапазонах напряжения (т. Е. Напряжение идет), чтобы найти PMT, ведущие к оптимальному сигналу над шумом (т. Е. Разделение отрицательных и положительных при обеспечении того, чтобы сигнал самой яркой популяции оставался в линейном диапазоне).
2. Измерение передачи выхода Т-клеток на BSLB
   1. Готовят препарат RPMI 1640 (в настоящем описании среды R10), содержащий 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 мкМ заменимых аминокислот, 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Используйте среду R10 для культивирования и расширения Т-клеток.
   2. На 1-й день выделяют Т-клетки из камер периферической крови или системы лейкоредукции (LRS). Используйте наборы для изоляции и разделения клеток иммуноденции (см. Таблицу материалов) для обогащения человеческих CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток.
   3. Посейте клетки в конечной концентрации в диапазоне от 1,5 до 2,0 × ¹⁰⁶ клеток/мл, используя пластины из 6 лунок с общим количеством не более 5 мл на лунку.
   4. Активируйте Т-клетки, используя соотношение 1:1 активации Т-клеток человека (анти-CD3 / анти-CD28) магнитных шариков (см. Таблицу материалов) и добавьте 100 МЕ рекомбинантного человеческого IL-2 для поддержки пролиферации и выживания клеток.
   5. На 3-й день снимите активирующие магнитные шарики с помощью магнитных колонок (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что магнитные шарики прикреплены к боковым сторонам трубки, прежде чем восстанавливать ячейки для дополнительных этапов промывки.
   6. Вымойте магнитные шарики еще раз 5 мл свежей среды R10, хорошо перемешайте и положите их обратно в магнит. Восстановите этот объем и смешайте с клетками, восстановленными на шаге 6.2.5.
   7. Повторно суспендировать клетки до 1,5-2 × ¹⁰⁶ клеток/мл в свежем R10, содержащем 100 Ед/мл IL-2. Пополняют среду через 48 ч, следя за тем, чтобы последнее добавление ИЛ-2 было за 48 ч до дня экспериментирования (дни с 7 по 14 посева).
   8. В день эксперимента по синаптическому переносу подготовьте среду Synaptic Transfer Assay (см. Таблицу 1), добавив среду RPMI 1640 без фенола 10% FBS, 100 мкМ заменимых аминокислот, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Не включайте рекомбинантный человеческий IL-2.
   9. Подсчитайте клетки, используя либо окрашивание трипановым синим цветом, либо исключение электрического тока, и повторно суспендируйте их до конечной концентрации 2,5 × ¹⁰⁶ клеток/мл в среде. Если наблюдается чрезмерная гибель клеток (>10%), удалите мертвые/умирающие клетки с помощью смеси полисахарида и диатризоата натрия (см. Таблицу материалов) следующим образом:
      1. Слой 15 мл клеточной культуры поверх 13 мл раствора полисахарид-натрия диатризоата.
      2. Центрифуга на 1 250 × g в течение 20 мин при РТ с минимальным ускорением и разгоном. Соберите клеточный слой (облако) в интерфейсе между средой и раствором полисахарид-натрия диатризоата.
      3. Промыть клетки не менее двух раз предварительно расплавленной средой для анализа синаптического переноса (подготовленной на этапе 6.2.7).
      4. Подсчитайте и повторно суспендируйте клетки до конечной концентрации 2,5 × ¹⁰⁶ /мл с использованием среды Synaptic Transfer Assay. Кокультура 100 мкл этой клеточной суспензии с BSLB (см. этап 6.2.15).
   10. Рассчитайте количество BSLB, необходимое для эксперимента; рассмотрим все различные мастер-смеси белков и титрование антигенов, подлежащие тестированию (либо биотинилированные мономеры HLA/MHC-пептидов, либо монобиотинилированные анти-CD3ε Fab).
   11. Соберите BSLB, выполнив те же шаги, что и в разделе 5 протокола, но на этот раз объедините все титрования белков и липидов, необходимые для восстановления сложной мембраны APC (рисунок 3A). Сохраняйте одинаковые соотношения vol: vol между начальным объемом шариков кремнезема и объемом белковой смеси, используемой во время калибровки, а также временем и температурами, используемыми при загрузке BSLB. Например, если для первоначальной калибровки было использовано 0,5 мкл шариков кремнезема/лунка и 100 мкл/лунка белковой смеси, поддерживайте соотношение 5:1000 об/об, чтобы подготовить BSLB к кокультурированию с Т-клетками.
   12. После того, как BSLB были загружены интересующей белковой смесью, дважды промыть BSLB HBS / HSA (BSA), чтобы удалить лишние несвязанные белки. Используйте скорость осаждения 300 × г в течение 2 мин при РТ на каждом этапе промывки и выбрасывайте супернатанты.
   13. Повторное суспендирование 5 × ¹⁰⁵ BSLB на скважину в 200 мкл.
   14. Перенесите 100 мкл на скважину на новую U-донную 96-луночную пластину, чтобы сделать дубликат, так что конечное количество BSLB на скважину составляет 2,5 × ¹⁰⁵.
   15. Раскрутите BSLB при 300 × g в течение 2 мин и RT и выбросьте супернатант.
   16. Повторное суспендирование BSLB с использованием 100 мкл суспензии Т-клеток; аккуратно перемешать, чтобы предотвратить образование пузырьков.
   17. Инкубировать кокультуры в течение 90 мин при 37 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, клетки и шарики могут быть повторно суспендированы в буфере HBS/HSA (BSA) вместо Phenol-Red free RPMI для кокультуры. В этом случае инкубация должна быть выполнена в инкубаторе без _CO2 , так как этот газ будет быстро подкислять буфер в отсутствие бикарбоната.
   18. Охладите клеточные кокультуры BSLB-T, сначала инкубируя клетки в RT в течение как минимум 15 минут. Защитите их от света.
   19. Центрифугировать ячейки в течение 5 мин при 500 × г и РТ; отбросьте супернатант.
   20. Повторное суспендирование клеток в RT 2% BSA-PBS (^Ca2+ и ^Mg2+-free) для блокировки. Поместите ячейки на лед на 45 мин. Защита от света.
   21. Во время инкубации клеток приготовьте смесь антител с использованием ледяного 0,22 мкм-фильтрованного 2% BSA в PBS в качестве буфера окрашивания, который обеспечит дополнительную блокировку.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые партии антител, конъюгированных с красителями Brilliant Violet, имеют тенденцию связываться с BSLB неспецифически. Блокировка с 5% BSA-PBS помогает уменьшить этот шум. Отныне убедитесь, что холодовая цепь не нарушена.
   22. Вращайте кокультуры при 500 × г в течение 5 мин и 4 °C. Прежде чем выбрасывать супернатанты, кратко убедитесь, что гранула присутствует, осмотрев дно 96-луночной пластины с помощью подсветки.
   23. Используя многоканальную пипетку, повторно суспендируйте клетки в мастер-смеси окрашивания, содержащей оптимизированные концентрации антител.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наконечники пипеток без фильтра, чтобы предотвратить образование пузырьков и ошибок в распределении объемов окрашивания.
   24. Включают изотип-меченые клетки и BSLB, флуоресцентные и нефлуоресцентные BSLB, а также клетки и BSLB, окрашенные отдельно. Соблюдайте общее количество событий на скважину для всех контрольных групп (т.е. только BSLB, содержащих 5 × ¹⁰⁵ BSLB/well, и только клеточные элементы управления, содержащие 5 × ¹⁰⁵ клеток/скважину, чтобы избежать относительного увеличения антител на окрашенное событие).
   25. Аккуратно перемешайте, пипеткой вверх и вниз половину объема, и высиживайте в течение 30 минут на льду. Защита от света.
   26. Промывайте клетки и BSLB дважды, используя ледяной 2% BSA-PBS, pH 7,4 и стадии осаждения 500 × г в течение 5 мин при 4 °C. Повторно суспендируйте промытые сокультуры в 100 мкл PBS и немедленно приобретайте.
   27. Если требуется фиксация, исправьте, используя 0,5% мас./v PFA в PBS в течение 10 минут, промыть один раз и сохранить в PBS до приобретения. Защита от света.
   28. Перед компенсацией приобретите стандарты MESF, гарантируя, что как самые тусклые, так и самые яркие популяции попадают в линейный диапазон измерения.
   29. Получите компенсационные образцы, рассчитайте компенсацию и примените к эксперименту компенсационную матрицу (ссылку).
   30. Приобретите и сохраните не менее 2 × ¹⁰⁴ общих стандарта MESF для каждого из каналов количественной оценки.
   31. Для сбора с использованием высокопроизводительных пробоотборников установите набор прибора на стандартный уровень, установите отбор проб на 80 мкл (или 80% от общего объема), расход пробы от 2,0 до 3,0 мкл/с, объем перемешивания проб 50 мкл (или 50% от общего объема, чтобы избежать образования пузырьков во время смешивания), смешивание проб 150 мкл/с и смешивание на скважину от 3 до 5.
   32. Приобретите минимум 1 × ¹⁰⁴ одиночных BSLB на выборку (см. рисунок 3B панелей (i)-(vi) для стратегии эталонного сбора).
   33. Промыть работающий цитометр в течение 5 минут чистящим раствором, а затем 5 минут сверхчистой водой перед выключением инструмента. При использовании HTS следуйте параметрам на вкладке HTS и параметру Очистить .
   34. Экспорт файлов FCS.

7. Измерение синаптического переноса частиц в BSLB

1. Откройте FCS-файлы эксперимента. Выберите популяцию клеток и BSLB на основе их боковых и передних областей рассеяния света (SSC-A против FSC-A), как показано на рисунке 3B (i).
2. Выберите события в окне непрерывного сбора (рисунок 3B (ii)).
3. Сосредоточьтесь на единичных событиях как ячеек, так и BSLB; идентифицировать одиночные ячейки сначала на основе низкого W в последовательных затворах FSC-W/FSC-H (синглеты-1, рисунок 3B панель (iii)) и SSC-W/SSC-H (синглеты-2; Рисунок 3В панель (iv)). Определите дополнительный затвор singlets-3, выбрав события с пропорциональными FSC-A и FSC-H (рисунок 3B, панель (v)).
4. Извлеките МФО из фракций MESF заготовки и от 1 до 4 и из отдельных клеток и MESF для каждого экспериментального образца.
5. Генерация скорректированных значений MFI (cMFI) для фракций MESF от 1 до 4 путем вычитания MFI пустой популяции бусин из каждой дроби.
6. Генерация cMFI для отдельных BSLB и ячеек (см. рисунок 3C панели (i)).
7. Используйте сигнал от BSLB, окрашенный контрольными антителами изотипа, для коррекции MFI BSLB, окрашенного антителами, против соответствующих маркеров Т-клеток. Используйте cMFI для расчета нормализованного процента синаптического переноса (NST%) с помощью уравнения, показанного на рисунке 3C панели (ii).
8. Если вас интересуют частицы, специально передаваемые в ответ на срабатывание TCR, вычтите сигнал из нулевых BSLB из MFI агонистических BSLB. Используйте этот cMFI для расчета NST%, управляемого TCR , используя уравнение, показанное на рисунке 3C панели (ii).
9. Если вы заинтересованы в определении общего количества молекул, передаваемых в качестве груза частиц через интерфейс Т-клетка-BSLB, приобретите эталонные шарики MESF, используя те же настройки прибора и сеанс сбора для кокультур Т-клеток-BSLB.
10. Анализ популяций шариков MESF и извлечение их цМФИ, как указано на этапах протокола 5.8.15-5.8.17. Рассчитайте наклон линии, наиболее подходящей для регрессионного анализа MESF над cMFI.
11. Используйте рассчитанный наклон для извлечения количества MESF, нанесенных на BSLB. Используйте cMFI, рассчитанные с использованием либо элементов управления изотипом, либо нулевого BSLB в качестве пробелов, чтобы извлечь количество MESF, переданных специально стимулирующим BSLB.
12. Рассчитать количество молекул маркеров, перенесенных в BSLB, разделив рассчитанные (средние) MESF на BSLB на значение F/P количественного антитела.

Результаты

FCM для абсолютной количественной оценки белка на поверхности клетки
Восстановление BSLB, представляющих физиологические плотности лигандов, требует оценки общей плотности белка на моделируемом подмножестве клеток. Для восстановления BSLB включите любой соответствующий лиганд, который, как ожидается, будет играть роль в интересующей сигнальной оси, наряду с белками, поддерживающими адгезию и функциональное взаимодействие между BSLB и клетками, такими как ICAM-1 и костимуляторные молекулы, например, ре...

Обсуждение

BSLB являются универсальными инструментами для изучения выхода твердых частиц Т-клеток, стимулируемых модельными мембранами APC. Гибкость метода позволяет воссоздать сложные и редукционистские мембранные композиции для изучения влияния лигандов и их сигналов на секрецию tSV и частиц супрамолекулярной атаки и их компонентов. Мы протестировали эту технологию на различных Т-клетках, включая предварительно активированные TH, CTL, Tregs и ^CART15. Этот протокол также работает для измерения высвобождения...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1,2-диолеол-sn-глицеро-3-[(N-(5-амино-1-карбоксипентил)иминодиацетовая кислота)сукцинил] (соль никеля)	Avanti Polar Lipids	790404C-25mg	18:1 DGS-NTA(Ni) в хлороформе
PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 &; L	Gilson	FA10011
1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин	Avanti Polar Lipids	850375C-25mg	18:1 (и Дельта; 9-цис) PC (DOPC) в хлороформе
1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE) ATTO 390	ATTO-TEC	AD 390-165	DOPE ATTO 390
1,2-диолеол-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE) ATTO 488	ATTO-TEC	AD 488-165	DOPE ATTO 488
1,2-диолеол-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE) ATTO 565	ATTO-TEC	AD 565-165	DOPE ATTO 565
1,2-диолеол-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-(кап биотинил) (соль натрия)	Avanti Polar Lipids	870273C-25mg	18:1 Biotinyl Cap PE в хлороформе
200 &микро; L желтые наконечники 10 x 96 наконечников, Stack	Starlab	S1111-0206
5 мл полистирольные трубки с круглым дном	Falcon®
5.00 ± 0.05 &микро; m нефункционализированные гранулы диоксида кремния	Bangs Laboratories Inc.
96 Well Cell Cultture Plate, U-образное дно с крышкой, тканевая культура, обработанная, не пирогенная.	Costar®	3799	Для окрашивания FCM и совместного культивирования BSLB и клеток.
96 Well Cell Cultture Plate, V-образное дно с крышкой, обработанная культура тканей, не пирогенная.	Costar®	3894	Для окрашивания клеток или шариков в суспензии FCM.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (сукцинимидиловый эфир)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (сукцинимидиловый эфир)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A37573 и A20006
Центрифуга Allegra X-12R Beckman	Coulter		Для нормального окрашивания биологических образцов в пробирке для FCM
Алюминиевая фольга	любой марки		Для защиты клеток и BSLB от легкого
античеловеческого CD154 (CD40L), клон 24-31	BioLegend	310815 и 310818	конъюгатов Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 647 соответственно.
античеловеческий CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, клон J252D4	BioLegend	356934	Для количественного анализа FCM клеток миндалины, как показано на рис. 1E
античеловеческий CD19 Brilliant Violet 421, клон HIB19	BioLegend	302234	Для количественного анализа FCM клеток миндалины, как показано на рис. 1E
античеловеческий CD2, клон RPA-2.10	BioLegend	300202	Маркирован внутри компании с помощью Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
античеловеческого CD2, клон TS1/8	BioLegend	309218	конъюгат Brilliant Violet 421.
античеловеческий CD252 (OX40L), клон 11C3.1	BioLegend		Alexa Fluor 647 конъюгат
античеловеческий CD28, клон CD28.2	eBioscience	16-0289-85	Меченый на месте с Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
античеловеческий CD317 (BST2, PDCA-1), клон 26F8	ThermoFisher Scientific, инвитроген	53-3179-42	конъюгат Alexa Fluor 488, мы обнаружили, что этот клон чище, чем клон RS38E.
античеловеческий CD38, клон HB-7	BioLegend	356624	Alexa Fluor 700 конъюгат
античеловеческий CD38, клон HIT2	BioLegend	303514	Alexa Fluor 647 конъюгат
античеловеческий CD39, клон A1	BioLegend		меченый в доме с Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
античеловеческий CD4 Brilliant Violet 650, клон OKT4	BioLegend	317436	Для количественного FCM-анализа клеток миндалин, как показано на рисунке 1E
против человеческого CD4, клон A161A1	BioLegend	357414 и 357421	PerCP/Cyanine5.5 и Alexa Fluor 647,
античеловеческий CD4, клонирует конъюгат OKT4	BioLegend	317414 и 317422	PE/Cy7 и Alexa Fluor 647,
соответственно античеловеческий CD40, клонирует 5C3	BioLegend	334304	Маркирован внутри компании Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
античеловеческий CD40, клон G28.5	BioLegend		Меченый внутри компании с Alexa Fluor 647 NHS Ester (сукцинимидиловый эфир
античеловеческий CD45, клон HI30	BioLegend	304056 и 368516	Alexa Fluor 647 и APC/Cy7 конъюгирует
античеловеческий CD47, клон CC2C6	BioLegend	323118	конъюгат
Alexa Fluor 647античеловеческий CD54 (ICAM-1), клон HCD54	BioLegend	322702	Меченый внутри компании с помощью Alexa Fluor 647 NHS Ester (сукцинимидиловый эфир
античеловеческий CD63 (LAMP-3), клон H5C6	BioLegend	353020 и 353015	конъюгатов PerCP/Cyanine5.5 и Alexa Fluor 647,
соответственно античеловеческий CD73, клон AD2	BioLegend	344002	Меченный внутри компании с помощью Alexa Fluor 647 NHS Ester (сукцинимидиловый эфир)
античеловеческий CD80, клон 2D10	BioLegend	305216	конъюгат Alexa Fluor 647
античеловеческий CD81, клон 5A6	BioLegend	349512 и 349502	конъюгат PE/Cy7 и меченый внутри компании с Alexa Fluor 647 NHS Ester (сукцинимидиловый эфир) соответственно.
античеловеческий CD82, клон ASL-24	BioLegend	342108	Alexa Fluor 647 конъюгат
античеловеческий CD86, клон IT2.2	BioLegend	305416	Alexa Fluor 647 конъюгат
античеловеческий CD8a, клон HIT8a	BioLegend	300920	Alexa Fluor 700 конъюгат
античеловеческий CD8a, клон SK1	BioLegend	344724	Alexa Fluor 700 конъюгат
античеловеческий HLA-A/ B/C/E, клон W6/32	BioLegend	311414 и 311402	конъюгат Alexa Fluor 647 и маркированный на собственном производстве с Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
античеловеческим HLA-DR, клон L243	BioLegend	307656 и 307622	конъюгаты Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 647 соответственно.
античеловеческий ICAM-1, клон HCD54	BioLegend	322702	Маркирован внутри компании с помощью Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
античеловеческий ICOS, клон C398.4A	BioLegend	313516	армянский хомяк IgG
античеловеческий ICOSL, клон MIH12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647 конъюгат
античеловеческого ICOSL, клон MIH12	eBioscience	16-5889-82	Маркировано внутри компании Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
античеловеческий LFA-1, клон TS1/22	BioLegend	Произведено внутри компании	Маркировано внутри компании Alexa Fluor 647 NHS Ester (сукцинимидиловый эфир
античеловеческий OX40, клон Ber-ACT35 (ACT35)	BioLegend	350018	Alexa Fluor 647 конъюгат
против человека PD-1, клон EH12.2H7	BioLegend	135230 и 329902	Alexa Fluor 647 конъюгирован и маркирован внутри компании с Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L1, клон 29E.2A3	BioLegend	329702	Маркирован внутри компании с Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L2, клон 24F.10C12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647 конъюгат
против человека PD-L2, клон MIH18	BioLegend	345502	Маркировка внутри компании с помощью Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
античеловеческого TCRab, клон конъюгатов IP26	BioLegend	306712 и 306714	конъюгатов Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 647 соответственно.
antti-human CD156c (ADAM10), клон SHM14	BioLegend	352702
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), клон RS38E	BioLegend	348404	Alexa Fluor 647 конъюгированный
армянский хомяк IgG Alexa Fluor 647 контроль изотипа, клон HTK888	BioLegend	400902	Маркирован в доме с помощью Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Настройка цитометра и отслеживание шариков	Becton Dickinson & Компания (BD)	641319	Отслеживание производительности инструментов до количественного FCM
BD FACSDiva	Becton Dickinson & Компания (BD)	23-14523-00	Программное обеспечение для сбора
данных крупного рогатого скота Альбумин Merck	, Sigma-Aldrich	A3294
CaCl2, Хлорид кальция	Merck, Sigma-Aldrich	C5670	безводный, Биореагент, подходит для культуры клеток насекомых, подходит для культуры растительных клеток, ≥ 96,0%
Казеин из коровьего молока, подходит для субстрата для протеинкиназы (после дефосфорилирования), очищенный порошок	Merck, Sigma-Aldrich	C5890
Dynabeads Т-активатор человека CD3/CD28	ThermoFisher Scientific, Gibco	11132D
DynaMag-2	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12321D	Для удаления Dynabeads Т-активатор человека CD3/CD28 в объемах менее 2 мл
DynaMag™-15	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12301D	Для удаления Dynabeads & Т-активатор человека CD3/CD28 в объемах менее 15 мл
фетальной бычьей сыворотки Квалифицировано, однократное применение	ThermoFisher Scientific, Gibco	A3160801	Требуется инактивация тепла в течение 30 минут при 56 oC
Ficoll-Paque PLUS	Cytiva, GE Healthcare	GE17-1440-02	Стерильный раствор полисахарида и диатризоата натрия для выделения лимфоцитов
Корректируемая жизнеспособность красителя eFluor 780	eBiosciences	65-0865-14	Для исключения мертвых клеток во время анализов
FlowJo	Becton Dickinson & Компания (BD)	Версия 10.7.1	Программное обеспечение
для анализа Grant Bio MPS-1 Мультипланшетный шейкер	Keison Products	MPS-1	Для смешивания клеток во время окрашивания или BSLB во время стэнинга или белковой нагрузки (в качестве альтернативы орбитальному перемешиванию)
Буферный раствор HEPES (1 M)	ThermoFisher Scientific, Gibco	15630-056
HEPES, N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N′-(2-этансульфоновая кислота), 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота.	Merck, Sigma-Aldrich	H4034	Для приготовления буфера HBS/HAS или HBS/BSA. Сертификация BioPerformance, ≥ 99,5% (титрование), подходит для клеточной культуры
HERACell 150i CO2 инкубатор, 150 л, электрополированная нержавеющая сталь	ThermoFisher Scientific	51026282	Для культивирования и расширения очищенных CD4+ и CD8+ Т-клеток.
Hula Mixer® Смеситель образцов	ThermoFisher Scientific, Life Technologies	15920D	Вертикальный, лабораторный смеситель с переменным углом наклона, используемый для смешивания BSLB и мастер-смеси липидов, блокирующих растворов, мастер-смеси белков и мелкомасштабного окрашивания антител.
Сывороточный альбумин человека, 30% водный раствор	Merck, Sigma-Aldrich	12667-M
Human TruStain FcX Fc Рецептор Блокирующий	BioLegend	422302	Fc рецептор Раствор для блокировки Fc рецепторов из биологически значимых образцов
Innovatis CASY счетчик клеток и анализатор TT	Biovendis Products GmbH		Для подсчета ячеек и определения размера и объема ячеек на основе исключения электрического тока.
KCl, хлорид калия	Merck, порошок Sigma-Aldrich	P5405	, биореагент, подходит для клеточной культуры
L-глютамин 200 мМ (100x)	ThermoFisher Scientific, Gibco	25030-024
MgCl2, хлорид магесия	Merck, Sigma-Aldrich	M2393	Биореагент, подходит для клеточной культуры, подходит для культуры клеток насекомых
Микротрубка Вкладыш для 24 x 1,5/2,0 мл трубки	Keison Products	P-2-24	Вкладыш для микротрубок Grant Bio MPS-1 Мультипланшетный шейкер
Мини инкубатор	Labnet International	I5110A-230V	Для инкубации (совместного культивирования) BSLB и клеток в отсутствие CO2
Minimum Essential Medium Non-Minowance Amino Amino	Aroma Scientific, Gibco	11140-035
Контроль поликлональных антител IgG у мышей	Merck, Sigma-Aldrich	PP54	Используется в качестве положительного контроля для измерения антител, связанных со стандартами
захвата IgG у мышейМышь IgG1, k Изотип, клон MOPC-21	BioLegend	400129, 400112, 400130, 400144, 400128 и 400170	Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 и Brilliant Violet 785  конъюгаты соответственно.
Мышь IgG1, k Isotype, клон X40	Becton Dickinson & Company (BD), Horizon	562438	сопряженный Brilliant Violet 421.
мышь IgG1, κ Контроль изотипа, клон P3.6.2.8.1	eBioscience	14-4714-82	Меченый внутри компании с помощью Alexa Fluor 647 NHS Ester (сукцинимидиловый эфир)
Мышь IgG2a, k Изотип, клон MOPC-173	BioLegend	400240	Alexa Fluor 647 конъюгат
Мышь IgG2b, k Изотип, клон MPC-11	BioLegend	400330 и 400355	конъюгаты Alexa Fluor 647 и Brilliant Violet 785 соответственно
Многолуночная 6-луночная культура тканей, обработанная вакуумной газовой плазмой	Falcon	353046	Для культивирования и расширения очищенных CD4+ и CD8+ Т-клеток.
Na2HPO4, динатрийфосфат	Merck, Sigma-Aldrich	S7907
NaCl, хлорид натрия	Merck, биореагент Sigma-Aldrich	S5886	, подходит для клеточной культуры, подходит для клеточной культуры насекомых, подходит для культуры растительных клеток, ≥ 99%
NiSO<суб>4, сульфат никеля(II)	Merck, Sigma-Aldrich	656895	Для насыщения сайтов NTA; добавлен в процессе блокирования
пенициллин стрептомицин [+]10 000 единиц пенициллин; [+] 10 000 &микро; г/мл стрептомицина	ThermoFisher Scientific, Gibco	15140-122
Фосфат буферизованный физиологический раствор pH 7,4, стерильный	ThermoFisher Scientific, Gibco	10010	No Ca2+ или Mg2+ добавлен
полиэфирсульфон (PES) Фильтрующий блок	Thermo Scientific Nalgene	UY-06730-43	Гидрофильная мембрана PES с низким связыванием белка облегчает фильтрацию растворов с высоким содержанием белка
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar	BOC Ltd.	11-Y	Для защиты запасов липидов, хранящихся при температуре +4°С.
Очищенный стрептавидин	BioLegend	280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF бусины	Bangs Laboratories Inc.	488	эталонных бусин для интерполяции молекул Alexa Fluor 488, связанных с клетками и/или бусин BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF	Bangs Laboratories Inc.	647	Эталонные бусины для интерполяции молекул Alexa Fluor 647, связанных с клетками и/или BSLB
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, клон OX-20	ThermoFisher Scientific, invitrogen	SA1-25258	Меченый на месте с Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Рекомбинантный человеческий IL-2	Peprotech	200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-глютамин	ThermoFisher Scientific, Gibco	31870-025
Розочка Коктейль для обогащения В-клеток человека	STEMCELL Technologies	15064	Выделение В-клеток для измерения плотности белков в очищенных клеточных популяциях
Коктейль для обогащения человеческих CD4+ Т-клеток Rosette	STEMCELL Technologies	15022C.1
Розочка Коктейль для обогащения В-клеток человека CD4+CD127low Т-клеток	STEMCELL Технологии	15361	Предварительное обогащение CD4+ CD127Low Т-клеток для последующей изоляции Tregs с помощью FACS.
Коктейль для обогащения человеческих CD8+ Т-клеток Rosette	STEMCELL Technologies	15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red	ThermoFisher Scientific, Gibco	11835-063	Для инкубации (совместного культивирования) BSLB и клеток в отсутствие CO2. Феноловые красные среды снижают автофлуоресценцию клеток при измерениях на основе проточной цитометрии и микроскопии.
Пируват натрия (100 мМ)	ThermoFisher Scientific, Gibco	11360-070
Мини-центрифуга Sprout	FisherScientific, Heathrow Scientific LLC	120301	Настольная микроцентрифуга, используемая для промывки гранул диоксида кремния и BSLB в пробирках Eppendorf объемом 1,5 мл.
Стерильные капсулы 5 мл полистирольные трубки с круглым дном	Falcon	352058
UltraComp eBeads Компенсационные бусины	ThermoFisher Scientific, invitrogen	01-2222-42
Zeba Spin Обессоливающие колонны 7K MWCO	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	89882