DetectSyn: быстрый, непредвзятый флуоресцентный метод обнаружения изменений плотности синапсов

Summary

DetectSyn - это непредвзятый, быстрый флуоресцентный анализ, который измеряет изменения относительного числа синапсов (до- и постсинаптического взаимодействия) между методами лечения или болезненными состояниями. Этот метод использует технику бесконтактной лигации, которая может быть использована как в культивируемых нейронах, так и в фиксированной ткани.

Abstract

Синапсы являются местом связи между нейронами. Сила нейронной цепи связана с синаптической плотностью, а разрушение синапсов характерно для таких болезненных состояний, как большое депрессивное расстройство (MDD) и болезнь Альцгеймера. Традиционные методы исследования чисел синапсов включают генетическую экспрессию флуоресцентных маркеров (например, зеленого флуоресцентного белка (GFP)), красителей, которые заполняют нейрон (например, карбоцианиновый краситель, DiI), и иммунофлуоресцентное обнаружение маркеров позвоночника (например, постсинаптическая плотность 95 (PSD95)). Основным предостережением к этим прокси-методам является то, что они идентифицируют только постсинаптические изменения. Тем не менее, синапс является связью между пресинаптическим терминалом и постсинаптическим позвоночником. Золотой стандарт для измерения образования/элиминации синапсов требует трудоемкой электронной микроскопии или методов массивной томографии. Эти методы требуют специализированной подготовки и дорогостоящего оборудования. Кроме того, только ограниченное количество нейронов может быть оценено и используется для представления изменений во всей области мозга. DetectSyn - это быстрый флуоресцентный метод, который идентифицирует изменения в образовании или устранении синапсов из-за болезненного состояния или активности препарата. DetectSyn использует быстрый анализ бесконтактного лигирования для обнаружения сопоставленных пре- и постсинаптических белков и стандартной флуоресцентной микроскопии, метода, легко доступного для большинства лабораторий. Флуоресцентное обнаружение полученной пункты позволяет проводить быстрый и непредвзятый анализ экспериментов. DetectSyn дает более репрезентативные результаты, чем электронная микроскопия, потому что могут быть проанализированы большие области, чем ограниченное количество флуоресцентных нейронов. Кроме того, DetectSyn работает для культивируемых in vitro нейронов и фиксированных срезов тканей. Наконец, предоставляется метод анализа данных, собранных с помощью этой техники. В целом, DetectSyn предлагает процедуру обнаружения относительных изменений плотности синапсов при лечении или болезненных состояниях и является более доступной, чем традиционные методы.

Introduction

Синапсы являются фундаментальной единицей связи между нейронами¹. Многие синапсы между нейронами в пределах одних и тех же областей порождают цепи, которые опосредуют поведение². Синапсы состоят из пресинаптического терминала от одного нейрона, который высвобождает нейротрансмиттеры или нейропептиды, которые передают информацию постсинаптическим рецепторам другого нейрона. Суммирование пресинаптических сигналов определяет, будет ли постсинаптический нейрон запускать потенциал действия и распространять сообщение на другие нейроны.

Синаптопатология, разрушение синапсов, возникает при заболеваниях и расстройствах, отмеченных уменьшением нервного объема, таких как болезнь Альцгеймера и большое депрессивное расстройство, в результате чего цепи больше не выполняют^{оптимально 3,4,5}. Восстановление плотности синапсов, вероятно, лежит в основе эффективности потенциальных методов лечения этих расстройств. Например, недавно было продемонстрировано, что увеличение синапсов лежит в основе поведенческой эффективности быстрых антидепрессантов⁶. Чтобы быстро отсеять возможные методы лечения синаптопатологии, исследователям требуются методы, которые быстро идентифицируют изменения в количестве синапсов.

Современные методологии либо трудоемки и дороги (электронная микроскопия, массивная томография), либо они исследуют только постсинаптические изменения без включения пресинаптического участия (анализ позвоночника, иммунофлуоресценция / колокализация). Красители, такие как DiI, или флуоресцентные белки, такие как GFP, помогают визуализировать нейроны и характеризуют постсинаптические шипы. Тем не менее, анализ позвоночника использует определенные исследователями соотношения для определения морфологии, которая может снизить воспроизводимость⁷. Кроме того, как различные классы позвоночника связаны с функциональными синапсами, все еще раскрывается⁸. Образование позвоночника может быть преходящим и может отражать постсинаптическую пластичность, но эти шипы могут быть устранены до стабилизации в синапс с пресинаптическим нейроном⁹.

Колокализация обеспечивает лучший показатель для синапсов, чем анализ позвоночника, потому что можно иммуноразмношить пресинаптические и постсинаптические белки. Тем не менее, синаптические белки могут давать низкие значения колокализации, потому что белки сопоставляются и могут не последовательно перекрываться. Таким образом, поскольку белки не накладываются полностью, методы колокализации могут не точно измерять изменения в образовании синапсов из-за этой недостающей информации. Наконец, хотя и электронная микроскопия (ЭМ), и массивная томография обеспечивают изображения синапсов с высоким разрешением, они отнимают много времени. ЭМ также требует специализированного оборудования, и исследователи ограничены небольшими объемами ткани для любого данного эксперимента. В то время как массивная томография элегантно обеспечивает возможность скрининга многих белков на ультратонких срезах и может сочетаться с EM¹⁰, этот метод может быть слишком трудоемким и выходить за рамки экспериментов, которые необходимо быстро сканировать на предмет изменений образования синапсов.

DetectSyn является специфическим применением анализа близости лигирования Duolink. Анализ PLA позволяет в целом обнаруживать белково-белковые взаимодействия. DetectSyn мостит прокси-постсинаптические меры путем усиления флуоресцентного сигнала, излучаемого помеченными пре- и постсинаптическими белками в пределах 40 нм друг от друга. Если синаптические белки находятся в пределах 40 нм, как в синаптической щели, то вторичные антитела, которые содержат ДНК-зонды, будут гибридизоваться в круговую ДНК. Эта гибридизированная круговая ДНК экспрессирует флуоресцентный зонд, который затем амплифицируется и обнаруживается с помощью стандартных методов флуоресцентной микроскопии (см. Рисунок 1). Важно отметить, что в отличие от ЭМ и массивной томографии, эта методика не требует специализированного оборудования и занимает примерно столько же времени, сколько и стандартная иммуногистохимия. Таким образом, доступность этого метода позволяет исследователям за пределами научно-исследовательских учреждений участвовать в исследованиях синаптопатологии. Кроме того, этот метод может исследовать изменения синаптической плотности в нескольких областях мозга в рамках одного эксперимента, предлагая более целостное представление синаптических изменений из-за болезни или лечения.

Protocol

Выделение клеток и тканей от животных было в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу за лабораторными животными и их использованию и одобрено Комитетом по уходу и использованию животных Wake Forest Institutional Animal

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол используется на образцах, уже обработанных и зафиксированных в соответствии с конкретными экспериментальными парадигмами и требованиями. В демонстрационных целях для выделения этого метода обнаружения синапсов⁶ используется образование синапсов в результате быстрого лечения антидепрессантами. Нейроны, ранее культивируемые на покровных листах, обработанные, зафиксированные в 4% параформальдегиде (PFA) и хранящиеся в 1x фосфат-буферном физиологическом растворе (PBS), будут использоваться для выделения процедур in vitro. Ранее нарезанная ткань гиппокампа (толщиной 25 мкм) у обработанных мышей, транскардиально перфузированная ледяным PBS и 4% PFA, а затем хранящаяся в криопротекторе, будет использоваться для выделения процедур среза. Пожалуйста, смотрите^11,12 для получения дополнительной информации о том, как культивировать нейроны или транскардиально перфузировать грызунов. Графическое представление этой процедуры см. на рисунке 1.

Рисунок 1: Графическое представление анализа DetectSyn. После пермеабилизации клеточных мембран первичные антитела к Synapsin1 и PSD95 связываются с этими синаптическими белками. Вторичные вещества с олигонуклеотидными метками затем связываются с первичными антителами. Если Synapsin1 и PSD95 находятся в пределах 40 нм, как у синапса, то олигонуклеотиды взаимодействуют, и флуоресцентная метка усиливается. Этот флуоресцентный сигнал затем может быть визуализирован с помощью стандартной микроскопии и проанализирован. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Образцы промывки

1. Промыть образцы 500 мкл 1x PBS + 0,75% глицина в течение 5 мин 3 раза с мягким перемешиванием на орбитальном шейкере для удаления остаточного PFA или криопротектора.

2. Блокируйте и пронизывайте образцы

1. Приготовьте блокирующий и пермеабилизирующий раствор (10% обычная ослиная сыворотка, 0,25% Tween 20) в 1x PBS. Подготовьте достаточно для использования для блокирующих, первичных и вторичных инкубаций.
2. К образцам (например, чехлам или свободно плавающим срезам) в 24 пластинах скважины добавляют 500 мкл блокирующего и пермеабилизирующего раствора. Убедитесь, что каждая скважина содержит отдельный образец и имеет соответствующую маркировку, чтобы предотвратить переключение образцов.
3. Инкубируйте образцы при комнатной температуре (RT) в течение 60 мин для культивируемых клеток или 2 ч для нарезанной ткани. Используйте орбитальный шейкер для мягкого перемешивания.

3. Инкубировать образцы в первичных антителах

1. Получают первичные антитела в блокирующем буфере:
   1. Приготовить постсинаптическую плотность 95 (PSD95; 1:500, кроличий поликлональный), Synapsin1 (1:500, мышиный моноклональный), MAP2 (1:400, куриный поликлональный)
   2. Подготовьте отрицательную контрольную аликвоту, которая опускает одну из синаптических пар (например, без PSD95)
2. Аккуратно снимите блокирующий раствор пластиковой пипеткой Пастера. Постарайтесь удалить как можно больше, не нарушая клетки и не разрывая ткани.
3. Для культивируемых клеток:
   1. Выложите большую пластиковую чашку Петри парапленкой. Аккуратно переложите крышки на парапленку с помощью щипцов.
   2. Осторожно добавьте 60 мкл раствора первичного антитела в верхнюю часть покровных пластин. Убедитесь, что раствор первичного антитела не разливается на боковую сторону крышки.
   3. Чтобы обеспечить влажность и предотвратить высыхание образцов в течение инкубационного периода, добавьте сверхчистую воду в меньшую чашку Петри и аккуратно расположите маленькую чашку Петри вокруг укрытий.
   4. Накройте большую чашку Петри и инкубируйте культивируемые клетки в течение 1 ч при РТ.
4. Для нарезанной ткани:
   1. Осторожно добавляют 250 мкл раствора первичного антитела к свободно плавающим срезам в 24-луночной пластине.
   2. Накройте пластину и инкубируйте ткань в течение ночи при 4 °C с мягким перемешиванием на орбитальном шейкере.

4. Промыть образцы, затем инкубировать вторичные антитела

1. Подготовьте вторичные антитела в блокирующем буфере:
   1. Приготовьте Ослик против мыши (1:5), Осел против кролика (1:5), Осел против курицы (1:400).
   2. На этом этапе дополнительные технические средства контроля могут быть получены путем подготовки вторичной аликвоты, которая опускает либо антимышечную, либо анти-кроликовую вторичную.
2. Для культивируемых клеток:
   1. Используя щипцы, осторожно отсоедините основной раствор с обложек на бумажное полотенце
   2. Используя щипцы, осторожно перенесите крышки обратно на их первоначальную 24-луночную пластину, заполненную 500 мкл 1x PBS.
3. Для нарезанной ткани:
   1. Осторожно удалите раствор первичного антитела пластиковой пипеткой Пастера. Постарайтесь удалить как можно больше, не разрывая ткань.
   2. Добавьте 500 мкл 1x PBS
4. Промывайте образцы в течение 10 мин 3 раза в 1x PBS с мягким перемешиванием на орбитальном шейкере. За это время принесите все промывочные буферы в RT.
   1. За это время поменяйте парапленку в большую чашку Петри
5. Для культивируемых клеток:
   1. Используя щипцы, аккуратно переложите чехлы обратно на парафильмированную большую чашку Петри
   2. Осторожно добавьте 40 мкл раствора вторичного антитела в верхнюю часть покровных пластинок. Убедитесь, что раствор вторичного антитела не разливается на боковую сторону крышки.
   3. При необходимости добавьте больше сверхчистой воды в меньшую чашку Петри и аккуратно разложите маленькую чашку Петри вокруг укрытий.
   4. Накройте большую чашку Петри
6. Для нарезанной ткани:
   1. Осторожно добавляют 250 мкл раствора вторичного антитела к свободно плавающим срезам в 24-луночной пластине.
   2. Накройте пластину
      ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента защитите образцы от света, обернув верхушки пластин фольгой.
7. Инкубация образцов при температуре 37 °C в течение 1 ч

5. Перевязка

1. Смешайте перевязочный материал 1:5 в молекулярной воде.
2. Как и в разделе 4, аккуратно перенесите обшивки и удалите вторичную смесь из нарезанной ткани.
3. Промывайте образцы в 500 мкл промывочного буфера А
   1. Для культивируемых клеток промыть 2 раза в течение 5 мин. Для нарезанной ткани промыть 2 раза в течение 10 мин. Используйте мягкое перемешивание на орбитальном шейкере для обоих.
   2. За это время поменяйте парапленку в большую чашку Петри
4. Удерживая лигазу на холодной блокаде, разбавьте лигазу 1:40 в лигативном материале со стадии 5.1. Выполните это разведение непосредственно перед добавлением лигазы в образцы.
5. Как и в разделе 4, удалите как можно больше промывочного буфера А из образцов перед добавлением лигазы.
6. Для культивируемых клеток: Перенесите крышки обратно в парафильмированную чашку Петри. Добавьте 40 мкл лигативной смеси в обшивки, разложите небольшие наполненные водой чашки Петри вокруг обложек и накройте большую чашку Петри.
7. Для нарезанной ткани: Добавьте 250 мкл лигационной смеси с этапа 5,4 в каждую лунку и накройте пластину.
8. Инкубируйте образцы в течение 30 мин при 37 °C.

6. Усиление

1. Смешайте усилительный материал 1:5 в воде молекулярного класса.
2. Как и в разделе 4, аккуратно переложите обшивки и удалите лигационную смесь из нарезанной ткани.
3. Промывка образцов в 500 мкл промывочного буфера А
   1. Для культивируемых клеток промыть 2 раза в течение 2 мин. Для нарезанной ткани промыть 2 раза в течение 10 мин. Используйте мягкое перемешивание на орбитальном шейкере для обоих.
   2. За это время поменяйте парапленку в большую чашку Петри
4. Выполняйте это разведение непосредственно перед добавлением полимеразы в образцы. Удерживая полимеразу на холодном блоке, разбавляют полимеразу
   1. Для культивируемых клеток разбавляют полимеразу 1:80 в амплификационном материале с этапа 6.1.
   2. Для нарезанной ткани разводят полимеразу 1:40 в амплификационном материале из шага 6.1.
5. Как и на этапе 4, удалите как можно больше промывочного буфера А из образцов перед добавлением полимеразы.
6. Для культивируемых клеток: Перенесите крышки обратно в парафильмированную чашку Петри. Добавьте 40 мкл амплификационной смеси из шага 6.4.1 в крышки, расположите небольшие наполненные водой чашки Петри вокруг обложек и накройте большую чашку Петри. Инкубируйте образцы в течение 100 мин при 37 °C.
7. Для нарезанной ткани: Добавьте 250 мкл амплификационной смеси из шага 6.4.2 в каждую лунку и накройте пластину. Инкубировать образцы в течение 2 ч при температуре 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого времени подготовьте и пометьте слайды.

7. Монтаж

1. Как и на шаге 4, аккуратно переложите крышки и удалите амплификационную смесь из нарезанной ткани.
2. Промыть образцы в 500 мкл промывочного буфера В 2 раза в течение 10 мин с мягким перемешиванием на орбитальном шейкере.
3. Промывайте образцы в 500 мкл 1% промывочного буфера B в течение 1 мин с мягким перемешиванием на орбитальном шейкере.
4. Для культивируемых клеток:
   1. Перетащите 3 мкл монтажного носителя на слайд
   2. Отсоедините лишний буфер промывки от крышки, а затем поместите крышку (ячейками вниз) в монтажный носитель. Запечатайте боковые стороны небольшим количеством прозрачного лака для ногтей, чтобы запечатать крышку на месте.
5. Для нарезанной ткани:
   1. Аккуратно переложите кусочек ткани на подготовленный слайд и расположите его, чтобы ломтик лежал ровно. Капля между 5-10 мкл монтажного носителя (количество будет зависеть от размера среза) на срез ткани
   2. Осторожно поместите стеклянную крышку поверх среза ткани и запечатайте небольшим количеством прозрачного лака для ногтей вдоль края, чтобы запечатать крышку на месте.
6. Подождите не менее 15 минут, прежде чем анализировать под микроскопом, или храните при -20 °C.

8. Получение цифровых изображений с помощью конфокального микроскопа

1. Оптимизируйте параметры сбора (например, мощность лазера, усиление, смещение) для всех образцов из всех методов лечения. Убедитесь, что оптимизация включает в себя уменьшение фонового шума и усиление сигнала без перенасыщения интенсивности флуоресцентных сигналов. После определения параметров примените одинаковые параметры сбора ко всем полученным изображениям.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие сведения о приобретении могут быть использованы с конфокальным микроскопом Nikon A1 и программным обеспечением Nikon NIS AR Elements.
2. Установите слайд с образцом на сцене и найдите фокальную плоскость для образца с помощью DAPI через окуляр.
3. Выключите порт глаз, щелкнув порт Eye и выбрав кнопку оптической конфигурации для настройки настроек.
4. Отрегулируйте коэффициент усиления, смещение и мощность лазера для каждого флуоресцентного канала, чтобы уменьшить фоновый шум и улучшить флуоресцентный сигнал. Убедитесь, что флуоресцентный сигнал не становится перенасыщенным, как указано в шагах 8.5-8.6.
5. Мониторинг перенасыщения с помощью псевдоцвета для флуоресцентного сигнала. В нижней части живого изображения щелкните правой кнопкой мыши вкладку, помеченную флуоресцентным каналом, используемым в данный момент.
6. Затем выберите «Раскраска канала» и выберите псевдоцвет, например «Rainbow Dark», чтобы визуализировать интенсивность флуоресценции в псевдоцвете, похожем на тепловую карту. В Rainbow Dark более холодные цвета указывают на меньшую интенсивность флуоресценции, а более горячие цвета указывают на большую интенсивность флуоресценции.
7. После оптимизации всех флуоресцентных каналов щелкните правой кнопкой мыши ранее выбранную кнопку оптической конфигурации и выберите «Назначить текущую настройку камеры» для этой кнопки.
8. Убедитесь, что выбранные параметры достаточны для случайной выборки из каждой группы лечения. Если выбранные параметры перенасыщают любой из этих образцов, повторите шаг 8.4, чтобы устранить перенасыщение.
9. Для культивируемых нейронов выполните шаги 8.10-8.16.
10. Используя глазной порт, ищите нейрон с дендритами, которые имеют минимальное перекрытие с другими дендритами.
11. Выключите глазной порт и используйте канал DAPI для визуализации клеточного тела выбранного нейрона. Дважды щелкните по центру сомы, чтобы центрировать нейрон в середине поля зрения.
12. Используя канал MAP2, найдите наилучшую плоскость фокусировки для сигнала MAP2 с помощью сканирования в реальном времени.
13. На вкладке ND Acquisition нажмите «Сохранить в файл» и выберите файл для сохранения изображения в разделе «Обзор». Затем введите имя файла.
14. На вкладке Z выберите параметр Симметричный режим, определяемый диапазоном . Установите фокус на лучшую плоскость MAP2 и нажмите кнопку Relative , чтобы установить эту фокальную плоскость в качестве середины z-стека.
15. Установите диапазон на 5 мкм с шагом 1 мкм и убедитесь, что установлен флажок Закрыть активный затвор во время движения Z. На вкладке Длина волны выберите имя оптической кнопки с ранее настроенными параметрами сбора в разделе Optical Conf. Затем нажмите «Выполнить сейчас».
16. Повторите шаги 8.1.10-8.1.15 примерно для 10 нейронов на обшивку/обработку.
17. Для нарезанной ткани выполните шаги 8.18-8.22.
18. Используя глаз-порт, найдите интересующий регион. Например, найдите CA1 гиппокампа.
19. Выключите глазной порт и используйте канал MAP2, чтобы найти наилучшую плоскость фокусировки для сигнала MAP2 с помощью сканирования в реальном времени.
20. В меню «Получение» выберите « Сканировать большое изображение». Затем выберите имя оптической кнопки с ранее настроенными параметрами сбора данных на панели «Захват» на открывшейся панели. Кроме того, убедитесь, что выбрана правильная цель в этой панели.
21. Под панелью « Область» и окуляром с помощью клавиш со стрелками установите границы интересующей области. Затем нажмите «Сохранить большое изображение в файл» и создайте путь к сохранению имени файла для изображения.
22. На панели «Настройка» убедитесь, что установлен флажок «Многоканальный захват», а затем выберите имя оптической кнопки с ранее настроенными параметрами сбора данных в разделе Optical Conf.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Z-стек для большого изображения возможен, но увеличит время сканирования.

9. Анализ

1. Подобно настройкам сбора, используйте образцы из всех методов лечения для оптимизации пороговых значений. Убедитесь, что пороговая оптимизация фокусируется на уменьшении фонового шума и улучшении сигнала без перенасытки интенсивности флуоресцентных сигналов. После определения этих настроек примените одинаковые пороговые значения ко всем изображениям, используемым для анализа, как описано в шагах 9.2-9.3.
2. В ImageJ параметр порога находится в меню Image > Adjust > Threshold. Выберите параметр «Темный фон», если изображение имеет темный фон.
3. Затем отрегулируйте верхнюю и нижнюю границы порога в соответствии с ранее определенными оптимизированными настройками порога, затем нажмите «Применить».
4. Для культивируемых клеток используйте канал MAP2 и инструмент «Область интереса от руки» (ROI), чтобы нарисовать ROI для каждого нейрона, включая дендриты и сому. Для нарезанной ткани нарисуйте свободную рентабельность инвестиций в изображение среза, которое инкапсулирует интересующую область (например, радиативный слой CA1 в гиппокампе).
5. Получите площадь ROI. В ImageJ измерьте область в меню Анализ > Мера.
6. Определите количество пункты в каждой рентабельности инвестиций с помощью автоматического инструмента обнаружения, такого как анализ частиц в ImageJ, выполнив шаги 9.7-9.9.
7. Найдите опцию Анализ частиц в меню Анализ > Анализ частиц. Во-первых, определите диаметр размера пункты, обычно 0,1-3 мкм2.
8. Затем выберите параметр «Наложенные маски» в раскрывающемся меню «Показать» и установите флажок «Результаты отображения». Затем нажмите OK.
9. Если пункта не обнаружена с выбранным диапазоном диаметров, отрегулируйте диапазон до тех пор, пока все пункты не будут обнаружены с помощью этого анализа. Убедитесь, что для всех изображений используются одинаковые настройки анализа частиц.
10. Разделите число пунктуров на область отдельной интересующей области, выполнив шаги 9.11-9.13.
11. Скопируйте и вставьте результаты для каждого изображения из всплывающего окна «Результаты» из ImageJ в электронную таблицу.
12. Во-первых, определите, из какого файла и образца были получены данные. Затем разделите площадь ROI на количество пунктуй.
13. Затем очистите данные во всплывающем окне «Результаты» и повторите шаги 9.2–9.12.
14. Нормализация результатов для контрольных образцов: Усреднение результатов (количество зон пункты/ROI) для контрольных образцов. Затем разделите полученные результаты всех образцов на среднее значение контроля для получения нормированных результатов. Новое среднее значение контрольных образцов должно быть равно 1.

Results

Данные, модифицированные из Heaney et ^al.6 , представлены для демонстрации эксперимента, в котором ожидается увеличение образования синапсов (см.⁶ для получения дополнительной информации и более подробного обсуждения механизма). Ранее было продемонстрировано, что быстрые антидепрессанты требуют активации ингибирующего метаботропного рецептора, GABAB (гамма-аминомасляный подтип B), чтобы быть^{эффективными 13}. Кроме того, предыдущие данные указывали на ...

Discussion

DetectSyn - это быстрый анализ, который использует анализ бесконтактного лигирования для обнаружения белков в пределах 40 нм друг от друга, что позволяет обнаруживать образование синапсов. Этот метод улучшает текущие флуоресцентные анализы, которые служат только в качестве прокси-измерений для образования синапсов. DetectSyn обнаруживает поддающиеся количественной оценке изменения в синаптических белках, локализованных в пределах 40 нм, то есть в синаптической щели, друг от друга. Кроме того, DetectSyn является более эко...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	Fisher Scientific	BP39920	PBS также изготовлен собственными силами.
24-луночные планшеты	Fisher Scientific	FB012929	Для срезов тканей предварительно стерилизованные пластины могут не понадобиться.
50 мл конические тубы	Fisher Scientific	14-432-22
Алюминиевая фольга	Fisher Scientific	15-078-290
Куриное антитело против MAP2	Abcam	ab5392
Прозрачный лак для ногтей	Fisher Scientific	NC1849418	Другие прозрачные лаки для ногтей также работают.
Холодный блок	Fisher Scientific	13131012
Компьютерная рабочая станция	HP
Конфокальный или флуоресцентный микроскоп	Nikon	A1R HD25
Ослик против курицы FITC	Fisher Scientific	SA1-72000
Дуолинк ослик анти-Мышь ПЛЮС	Сигма	DUO92001
Дуолинк ослик анти-Кролик МИНУС	Sigma	DUO92005
Duolink Реагенты для обнаружения in situ	Red Sigma	DUO92013	Содержит запас лигирования, амплификационный материал, лигазу и полимеразу.
Монтажная среда Duolink in situ с DAPI	Sigma	DUO82040
Duolink Буферы для промывки на месте, флуоресцентная	Sigma	DUO82049	содержит буфер промывки A и буфер промывки B; разбавьте буфер промывки B до 1% в diH20 для получения 1% буфера промывки B.
Кисть с тонким наконечником	Fisher Scientific	NC9691026	Sable hair, размер 00 или 000, также можно найти в магазинах крафта
Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12545MP	Cover glass не нужна для культивированных нейронов уже на стеклянных покровных стеклах.
Предметные стекла для микроскопа Fisherbrand Superfrost Plus	Научный	1255015	Для культивируемых нейронов, уже находящихся на стеклянных покровных стеклах, предметные стекла Superfrost могут не понадобиться.
Морозильная камера, -20°С; C	VWR	76449-108
Стеклянные покровные стекла	Fisher Scientific	125480
Глицин	Fisher Scientific	BP381-1
Программное обеспечение для обработки изображений	, например, NIS Elements, ImageJ
Инкубатор	Fisher Scientific	15-015-2633
Большая чашка Петри, 100 мм	Fisher Scientific	FB0875712
Молекулярная вода	Fisher Scientific	BP24701
Мышиное антитело к синапсину1 Synaptic	Systems	106-011
Нормальная сыворотка осла	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Орбитальный шейкер	Fisher Scientific	02-106-1013
Парапленка	Fisher Scientific	13-374-10
Наконечники для пипеток	Fisher Scientific	02-707-025
Пипетки	Fisher Scientific	14-388-100	Диапазон рабочих объемов от 3 и микро; L до 500 & микро; L
Пластиковая пастеровская пипетка	Fisher Scientific	02-708-006
Прецизионный пинцет/форцепс	Fisher Scientific	12-000-122
Антитело Rabbit anti-PSD95	Abcam	ab18258	Другие пары антител также могут работать с оптимизацией.
Холодильник	VWR	76470-402
Маленькая чашка Петри, 60 мм	Fisher Scientific	FB0875713A
Таймер	Fisher Scientific	14-649-17
Твин 20	Fisher Scientific	BP337-100