Стабильные водные суспензии ферритовых кластеров марганца с настраиваемым наноразмерным размером и составом

Включение марганца в качестве легирующего вещества в решетку оксида железа может при соответствующих условиях увеличить намагниченность материала при высоких полях прикладывания по сравнению с чистыми оксидами железа. В результате наночастицы марганцевого феррита (MnxFe3-xO4) являются очень желательными магнитными наноматериалами из-за их высокой намагниченности насыщения, сильной реакции на внешние поля и низкой цитотоксичности1,2,3,4,5. Как однодоменные нанокристаллы, так и кластеры этих нанокристаллов, называемых многодоменными частицами, были исследованы в различных биомедицинских приложениях, включая доставку лекарств, магнитную гипертермию для лечения рака и магнитно-резонансную томографию (МРТ)^6,7,8. Например, группа Hyeon в 2017 году использовала однодоменные наночастицы феррита марганца в качестве катализатора Фентона для индуцирования гипоксии рака и использовала _T2contrast материала для отслеживания ^МРТ9. В свете этих и других положительных исследований ферритовых материалов удивительно, что существует мало демонстраций in vivo по сравнению с чистыми наноматериалами оксида железа (_Fe3O4) и нет зарегистрированных применений у ^{людей9,10}.

Одной из огромных проблем, с которыми приходится сталкиваться при переводе особенностей ферритовых наноматериалов в клинику, является создание однородных, неагрегирующих, наноразмерных кластеров11,12,13,14. В то время как традиционные синтетические подходы к монодоменным нанокристаллам хорошо развиты, мультидоменные кластеры типа интереса к этой работе нелегко получить единообразным и контролируемым ^{образом15,16}. Кроме того, ферритовая композиция обычно не является стехиометрической и не просто связана с начальной концентрацией предшественников, и это может еще больше затемнить систематическую структурно-функциональную характеристику этих материалов9,12,13,17. Здесь мы решаем эти проблемы, демонстрируя синтетический подход, который дает независимый контроль как над размером кластера, так и над составом наноматериалов марганцевого феррита.

Эта работа также предоставляет средства для преодоления плохой коллоидной стабильности ферритовых наноматериалов18,19,20. Магнитные наночастицы, как правило, склонны к агрегации из-за сильного притяжения частиц-частиц; Ферриты больше страдают от этой проблемы, поскольку их большая чистая намагниченность усиливает агрегацию частиц. В соответствующих биологических средах эти материалы дают достаточно большие агрегаты, которые материалы быстро собирают, тем самым ограничивая их пути воздействия на животных или людей20,21,22. Hilt et al. обнаружили еще одно последствие агрегации частиц-частиц в своем исследовании магнитотермического нагрева и деградации ^{красителя23}. При несколько более высоких концентрациях частиц или увеличенном времени воздействия на поле эффективность материалов снижалась по мере агрегирования материалов с течением времени и уменьшения площадей поверхности активных частиц. Эти и другие приложения выиграли бы от кластерных поверхностей, предназначенных для обеспечения стерических барьеров, исключающих взаимодействия частиц с ^{частицами24,25}.

Здесь мы сообщаем о синтетическом подходе к синтезу ферритовых кластеров марганца (MFC) с контролируемыми размерами и составом. Эти многодоменные частицы состоят из сборки первичных нанокристаллов феррита марганца, которые жестко агрегированы; тесная ассоциация первичных нанокристаллов усиливает их магнитные свойства и обеспечивает общий размер кластера, 50-300 нм, хорошо соответствующий оптимальным размерам для наномедицины. Изменяя количество воды и предшественника хлорида марганца, мы можем самостоятельно контролировать общий диаметр и состав. Метод использует простые и эффективные гидротермальные реакции с одним горшком, которые позволяют часто экспериментировать и оптимизировать материал. Эти МФУ могут быть легко очищены в концентрированный раствор продукта, который дополнительно модифицируется сульфированными полимерами, которые придают коллоидную стабильность. Их настраиваемость, однородность и стабильность фазы раствора имеют большое значение для применения наноматериалов в биомедицинской и экологической инженерии.

1. Синтез МФЦ с контролем общего диаметра и ферритового состава МФЦ

1. Вымойте и тщательно высушите всю стеклянную посуду, которая будет использоваться в синтезе. Количество воды в синтезе влияет на размеры MFC, поэтому крайне важно обеспечить, чтобы в стеклянной посуде не было остаточной ^{воды16,26}.
   1. Чтобы вымыть стеклянную посуду, промойте водой и моющим средством и потрите щеткой для удаления мусора. Тщательно промойте, чтобы удалить все моющее средство и закончите полосканием деионизированной водой.
   2. Чтобы высушить стеклянную посуду, стряхните капли воды с поверхности стеклянной посуды и поместите в духовку при 60°C до полного высыхания.
   3. Промыть реакторы с полифениленовой футеровкой (PPL) 37% соляной кислотой, чтобы удалить любой мусор из предыдущего использования. Для этого поместите реакторы и их колпачки в большой стакан и засыпьте соляной кислотой до тех пор, пока реакторы полностью не будут погружены. Оставьте на 30 минут, прежде чем вылить соляную кислоту. Непрерывно промывайте стакан, содержащий реакторы, водой в течение 1-2 мин, а затем поместите реакторы в печь для сушки.
2. Используйте автоматическую пипетку для переноса 20 мл этиленгликоля в стакан емкостью 50 мл с магнитным перемешивателем.
3. Взвесьте необходимое количество хлорида железа (III) (_FeCl3·_6H2O, твердое вещество) для достижения конечной концентрации 1,3 мМ и добавьте его в стакан. Положите стакан на перемешиваемую пластину и включите его при 480 оборотах в минуту, чтобы начать непрерывное перемешивание стакана.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку это гидрат, его необходимо быстро измерить и добавить, чтобы избежать нежелательного поглощения воды из окружающего воздуха.
4. Взвесьте 250 мг полиакриловой кислоты (PAA, Mw ~ 6000, порошок) и добавьте ее в стакан. После добавления ПАА раствор становится непрозрачным и немного светлее по цвету.
5. Взвесьте 1,2 г мочевины (CO(_NH2)₂, порошок) и добавьте ее в стакан.
6. Используя пипетку, добавьте в стакан 0,7 мМ хлорида марганца(II) (_MnCl2·_6H2O aq, 3,5 М, 0,2 мл).
7. Наконец, с помощью пипетки добавьте в стакан необходимое количество (0,5 мл) сверхчистой воды.
8. Дайте раствору помешиваться в течение 30 минут и обратите внимание на изменение цвета. Он будет представлен в виде полупрозрачного, темно-оранжевого цвета.
9. Перенесите реакционную смесь в реактор с полифениленовой футеровкой (PPL). Обратите внимание, что после того, как раствор перемешался, некоторые твердые вещества могли скопиться по бокам стакана.
   1. Используйте магнит (кубический постоянный редкоземельный магнит, 40 x 40 x 20 мм, далее именуемый «магнитом» для всех процедур разделения и магнитного сбора), чтобы перетащить перемешивание вокруг стенок стакана, чтобы гарантировать, что любые твердые вещества, которые накопились по бокам, диспергируются в реакционном растворе.
   2. Как только раствор будет перемешан и готов, перенесите его в реактор с ППЛ объемом 50 мл.
   3. Используйте зажим и рычаг, чтобы как можно плотнее запечатать реактор в автоклаве из нержавеющей стали. Зажмите корпус реактора к стабильной поверхности и, используя стержень, вставленный в колпачок в качестве рычага, подтолкните реактор к уплотнению. Обратите внимание, что герметичный реактор не должен быть открыт вручную. Это имеет решающее значение, поскольку среда высокого давления в печи требует плотного уплотнения на реакторе.
10. Поместите реактор в духовку на 20 ч при температуре 215 °C.
11. После того, как гидротермальная реакция завершена, извлеките реактор из печи и дайте ему остыть до комнатной температуры. Давление в печи позволит открыть реактор вручную. Отметим, что в этот момент реактор будет содержать продукт MFC, диспергированный в этиленгликоле с другими примесями, такими как непрореагировавший полимер, и будет представлять собой непрозрачный черный раствор. Продукт будет изолирован на следующих этапах.

2. Магнитная сепарация и очистка МФУ

1. Поместите 200 мг стальной ваты в стеклянный флакон. Заполните стеклянный флакон наполовину реакционной смесью из реактора. Наполните оставшуюся часть флакона ацетоном и хорошо встряхните. Отметим, что стальная вата увеличивает напряженность магнитного поля во флаконе и поможет магнитному отделению нанокластеров от раствора.
2. Поместите флакон на магнит для магнитного сбора. В результате получится полупрозрачный раствор с осадком внизу.
   1. Вылейте раствор супернатанта, в то время как MFC магнитно захвачены стальной ватой, удерживая магнит на дне флакона во время заливки. Этиленгликоль будет в основном удален на этом этапе.
   2. Начинайте промывку с низким соотношением ацетона к воде и увеличивайте соотношение в последующих смывах до чистоты. Сделайте это 3-4 раза.
3. Извлеките флакон из магнита и наполните его водой. Хорошо встряхните, чтобы растворить МФЦ. Теперь продукт будет полностью диспергироваться в воде.
4. Повторите предыдущие два шага несколько раз, пока водный раствор MFC не произведет пузырьков при встряхивании. В результате получится темная, непрозрачная ферромагнитная жидкость, которая будет сильно реагировать на магниты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При типичном синтезе с 20 мл этиленгликоля будет получено приблизительно 80 мг продукта MFC.

3. Поверхностная функционализация МФУ в сторону сверхвысокой коллоидной стабильности

ПРИМЕЧАНИЕ: Синтез нитродофамина и поли(AA-co-AMPS-co-PEG) можно найти в нашей предыдущей ^{работе16}. Сополимер производится путем свободнорадикальной полимеризации. Добавьте 0,20 г 2,2'-Азобиса (2-метилпропионитрила) (AIBN), 0,25 г акриловой кислоты (AA), 0,75 г 2-акриламидо-2-метилпропансульфоновой кислоты (AMPS) и 1,00 г поли(этиленгликоля) метилового эфира акрилата (PEG) в 10 мл N,N-диметилформамида (DMF). Нагрейте смесь на водяной бане при температуре 70 °C в течение 1 ч и переложите ее в диализный мешок (целлюлозная мембрана, 3 кДа) в воде. Весовое соотношение AA, AMPS и PEG составляет 1:3:4. Полимеризация для этих мономеров имеет 100% коэффициент конверсии, подтвержденный сублимационной сушкой и взвешиванием.

1. Смешайте 10 мл очищенных наночастиц (около 100 мг) во флаконе объемом 20 мл с 10 мл насыщенного раствора N-[2-(3,4-дигидроксифенил)этил]нитрамида (нитро-дофамина) (~1 мг/мл). Подождите 5 мин.
2. Промывайте МФУ с нитродофаминовым покрытием с помощью магнитной сепарации. Вылейте бледно-желтый супернатант. Добавьте воды и энергично встряхните. Затем вылейте воду, используя магнит, чтобы сохранить продукт. Повторите эту промывку несколько раз, оставив темно-коричневый сбор во флаконе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Готовят водный раствор с концентрацией 20 мг/мл, буферный раствор с концентрацией 100 мг/мл и поли(AA-co-AMPS-co-PEG) полимерный раствор с концентрацией 20 мг/мл.
3. Смешайте 1 мл раствора EDC, 1 мл буфера MES и 3 мл раствора полимера. Слегка перемешайте, покрутив смесь, и дайте ей постоять примерно 5 минут. Это должен быть прозрачный и бесцветный раствор при полном сочетании.
4. Добавьте эту смесь в коллекцию MFC и поместите флакон в ледяную ванну. Опустите зондовый ультразвуковой аппарат в раствор, а затем включите его (мощность 250 Вт при 20 кГц).
   1. После 5-минутной обработки ультразвуком добавьте примерно 5 мл сверхчистой воды во флакон, пока ультразвуковой аппарат все еще работает. Продолжайте следить за судном, чтобы убедиться, что продукт не разливается. Поддерживайте лед в смеси льда и воды, так как часть исходного льда растает из-за интенсивности и тепла обработки ультразвуком.
   2. Дайте смеси настояться ультразвуком в течение дополнительных 25 минут, в общей сложности 30 минут.
5. Поместите флакон поверх магнита, чтобы отделить MFC и вылить раствор супернатанта.
6. Промыть модифицированные МФУ деионизированной водой несколько раз.
7. Наполните флакон, содержащий МФУ, сверхчистой водой. Пипетка этой жидкости в вакуумную систему фильтрации с мембранным фильтром полиэфирсульфона 0,1 мкм для удаления любых необратимо агрегированных МФУ. Обязательно промывайте стенки воронки, чтобы свести к минимуму потерю продукта.
8. Вакуумная фильтрация раствора. Повторите этот процесс 2-3 раза. В результате получится очищенный водный раствор монодисперсных МФУ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Примерно 10% продукта будет необратимо агрегировано, и этот материал останется на фильтре и должен быть выброшен.

После гидротермической обработки реакционная смесь превращается в вязкую черную дисперсию, как видно на рисунке 1. Что получается после очистки, так это высококонцентрированный раствор MFC, который ведет себя как ферромагнитная жидкость. Жидкость во флаконе реагирует в течение нескольких секунд при размещении рядом с ручным магнитом (<0,5 Тл), образуя макроскопическую черную массу, которую можно перемещать, когда магнит размещается в разных местах.

Этот синтез дает продукты, размер и состав которых зависят от количества добавленной воды и соотношения марганца к предшественнику железа в реакционной смеси. На рисунке 2 показано, как морфология кластера зависит от концентрации воды и прекурсоров; в нем также подробно описываются условия реакции, используемые для получения образцов, перечисленных в таблице 1. Мы находим, что диаметр MFC зависит от количества добавленной воды, а состав MFC зависит от соотношения железа и марганца в предшественниках. Таким образом, оба параметра могут независимо контролироваться, чтобы создать библиотеку MFC с различными размерами и содержанием марганца.

Хотя это очень простая синтетическая процедура, ошибки в выполнении метода могут привести к сбоям продуктов. На рисунке 3 показаны образцы с неправильной морфологией MFC. На рисунке 3А МФУ нечетной формы получаются, если вода полностью исключена из реакционной среды. Нехватка воды препятствует динамической сборке первичных нанокристаллов и приводит к очень широкому распределению нанокластерных размеров и несферических форм16. Образцы, показанные на рисунке 3B , имели недостаточное время реакции (6-12 ч) и, как следствие, не имели достаточного роста первичных нанокристаллов. Эти плохие результаты демонстрируют, что для достижения последовательных и однородных кластеров необходимо соответствующее количество реагента, а также время реакции.

После завершения гидротермального синтеза ферритовые МФЦ отделяли и очищали с помощью магнитной сепарации. Магнит помещали под раствор, чтобы заставить их собирать на дне сосуда. Примеси и немагнитные побочные продукты, образующиеся в синтезе, наряду с избыточным растворителем, затем могут быть декантированы с получением чистых и монодисперсных MFC27. На рисунке 4 показано время, необходимое для почти полного магнитного сбора МФУ с добавлением и без добавления стальной ваты. Стальная вата, помещенная во флакон во время магнитной сепарации, увеличивает градиент магнитного поля внутри флакона, что позволяет гораздо быстрее отделять28.

МФУ, очищенные с помощью магнитной сепарации, демонстрируют высокую степень однородности по сравнению с теми, которые очищаются с использованием более традиционного процесса ультрацентрифугирования. На рисунке 5 показано распределение по размерам МФУ, полученных с помощью магнитной сепарации (A и B), по сравнению с теми, которые используют ультрацентрифугирование (5000 г в течение 30 мин) (C и D). Магнитная сепарация приводит к более узкому распределению диаметра кластера по сравнению с ультрацентрифугированием и является предпочтительной стратегией очистки для MFC.

Ас-синтезированные MFC покрыты полиакрилатом (PAA), который обеспечивает отрицательно заряженную поверхность и некоторую степень отталкивания межчастиц, что предотвращает агрегацию межчастиц (рисунок 6A). Однако, выполняя реакцию замены лиганда нитродоамином (рисунок 6B), мы можем заменить покрытие PAA сополимерным покрытием P(AA-co-AMPS-co-PEG), которое обеспечивает большую стабильность в растворах с более высокой ионной прочностью. На рисунке 7 показана схема этого процесса функционализации поверхности. Коллоидная стабильность MFC, диспергированных в буфере PBS, показана на рисунке 8. Синтезированные АСФК, покрытые ПАА, быстро агрегируются и отделяются от раствора в течение 30 мин и мало используются в биологических применениях. Напротив, МФУ, функционализированные полисульфонатным покрытием, оставались хорошо диспергированными в этом растворе в течение более 2 дней без каких-либо признаков агрегации. Описанная здесь модификация поверхности постсинтеза обеспечивает путь формирования однородных растворов МФУ, пригодных для интродукции в биологические среды.

Рисунок 1: Схема синтеза нанокластеров марганцевого феррита. Реагенты, хлорид железа (III), хлорид марганца (II), полиакриловая кислота (PAA), мочевина, вода и этиленгликоль объединяются в гидротермальных условиях для получения нанокластеров марганцевого феррита. Этот продукт образует стабильный коллоидный раствор в чистой воде, как показано посередине. Количество воды, добавляемой при синтезе, и отношение марганца к железу в прекурсорах используется для настройки размера кластера и ферритового состава соответственно. После магнитного разделения нанокластеры образуют ферромагнитную жидкость, как показано справа, что указывает на то, что они очень чувствительны даже к небольшим приложенным магнитным полям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Попередающий электронный микроскоп (ТЭМ) изображения нанокластеров марганцевого феррита и их распределения диаметров. На изображениях A-D диаметр кластера (Dc) увеличивается в результате уменьшения количества воды, добавляемой в синтез. Средний диаметр кластера составляет 31, 56, 74 и 120 нм для A, B, C и D соответственно с постоянным составом Mn0.15Fe2.85O4. На изображениях E-H ферритовая композиция монотонно изменяется пропорционально соотношению Mn/Fe предшественников. Несмотря на их различный состав, достигается почти эквивалентный диаметр кластера. Наш синтез позволяет независимо контролировать как диаметр кластера, так и состав феррита, оба признака, которые важны для магнитных свойств наноразмерных ферритов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Условия реакции синтеза образцов нанокластеров, показанных на рисунке 2. Другими параметрами синтеза являются: 20 мл этиленгликоля, 250 мг ПАА и 1,2 г мочевины. Реакционные смеси гидротермически нагревают при 200 °C в течение 20 ч. Для A, B, C и D уменьшение содержания воды при сохранении других параметров постоянным приводило к образованию кластеров большего диаметра. Для E, F, G и H увеличение отношения MnCl2 к FeCl3 в исходной реакционной смеси привело к образованию кластеров с более высокими пропорциями марганца в кластерной структуре. Изменение количества воды E, F, G и H одновременно позволяет создавать кластеры различного состава, но близкие к эквивалентным диаметрам.

Рисунок 3: Изображения ТЭМ неудачных и неполных реакций. Небольшие, низкоконтрастные особенности, наблюдаемые на этих изображениях, являются первичными нанокристаллами, которые не развились в нанокластеры. Образец на фиг.3А готовили без дополнительной воды, в то время как материал, показанный на фиг.3В , имел недостаточное четырехчасовое время реакции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Сравнение магнитной сепарации нанокластеров. Сравнение магнитной сепарации нанокластеров без (А) и с (В) добавлением стальной ваты в контейнер. Стальная вата увеличивает градиент магнитного поля внутри флакона, чтобы обеспечить более быстрое магнитное разделение нанокластеров. В результате можно эффективно масштабировать производство нанокластеров без ущерба для качества образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Сравнение ультрацентрифугирования и магнитной сепарации. Сравнение ультрацентрифугирования (А,В) и магнитной сепарации (С,D) и их влияние на однородность очищенных кластеров. A и C - это изображения ТЕА очищенных кластеров, а B и D - распределения размеров кластеров в A и C, соответственно. Ось y представляет собой количество подсчитанных кластеров, и для каждой выборки было обследовано в общей сложности 150 кластеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Структура поли(акриловой кислоты) (PAA) (A) и нитродофамина (B), используемых на стадии модификации поверхности. Исходное покрытие PAA, используемое в синтезе, не является идеальным в биологических или кислых средах из-за того, что карбоновая кислота легко протонируется. Нитро-дофамин используется для замены покрытия PAA, создавая функциональную группу для закрепления сульфированного сополимера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Схемы процесса модификации поверхности кластера. (A) оригинальное покрытие PAA, (B) промежуточное нитродофаминовое покрытие и (C) конечное P(AA-co-AMPS-co-PEG) покрытие. В (C) синяя, красная и зеленая кривые представляют единицы AA, AMPS и PEG соответственно. Состав кластера может быть либо Fe3O4, либо MnxFe3-xO4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Поверхностная функционализация нанокластеров полисульфонатом приводит к материалам, которые коллоидно стабильны во многих различных водных условиях. Кластеры с двумя различными поверхностными покрытиями, как синтезированные PAA с покрытием (A) и P(AA-co-AMPS-co-PEG) поверхностно функционализированные (B), растворяются в буферном растворе PBS, который имеет отношение к биологическим условиям и наблюдается за их коллоидной стабильностью с течением времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторам нечего раскрывать.