Методическая статья

Выделение специфических для клеток РНК из замороженных образцов гетерогенных тканей без сортировки клеток

DOI:

10.3791/63143

⸱

8 декабря 2021 г.

 , 
1Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол направлен на изоляцию специфических для клеточного типа транслирующих рибосомных мРНК с использованием мышиной модели NuTRAP.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточная гетерогенность создает проблемы для понимания функции сложных тканей на уровне транскриптома. Использование специфических для клеточного типа РНК позволяет избежать потенциальных ловушек, вызванных неоднородностью тканей, и высвобождает мощный анализ транскриптома. Протокол, описанный здесь, демонстрирует, как использовать метод трансляционной рибосомной аффинной очистки (TRAP) для выделения рибосомно-связанных РНК из небольшого количества EGFP-экспрессирующих клеток в сложной ткани без сортировки клеток. Этот протокол подходит для выделения специфических для клеток РНК с использованием недавно доступной мышиной модели NuTRAP , а также может быть использован для выделения РНК из любых EGFP-экспрессирующих клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высокопроизводительные подходы, включая секвенирование РНК (RNA-seq) и микрочипы, позволили исследовать профили экспрессии генов на уровне всего генома. Для сложных тканей, таких как сердце, мозг и яичко, специфические для клеточного типа данные предоставят более подробную информацию, сравнивающую использование РНК из всей ткани 1,2,3. Чтобы преодолеть влияние клеточной гетерогенности, с начала 2010-х годов был разработан метод трансляционной рибосомной аффинной очистки (TRAP)4. TRAP способен изолировать рибосомно-связанные РНК из определенных типов клеток без диссоциации тканей. Этот метод был использован для анализа транслейлома (мРНК, которые набираются в рибосому для трансляции) в различных организмах, включая нацеливание на чрезвычайно редкую популяцию мышечных клеток в эмбрионах дрозофилы5, изучение различных корневых клеток в модельном растении Arabidopsis thaliana6 и выполнение транскриптомного анализа эндотелиальных клеток у млекопитающих7.

TRAP требует генетической модификации для маркировки рибосомы модельного организма. Эван Розен и его коллеги недавно разработали модель мыши под названием Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse8, которая доступна через Лабораторию Джексона с 2017 года. Пересекаясь с линией мыши Cre, исследователи могут использовать эту модель мыши NuTRAP для выделения рибосомных РНК и клеточных ядер из Cre-экспрессирующих клеток без сортировки клеток. В cre-экспрессирующих клетках, которые также несут аллель NuTRAP , рибосома с меткой EGFP / L10a позволяет изолировать транслирующие мРНК с использованием аффинных вытягивающих анализов. В той же клетке ядерная мембрана, помеченная пептидом распознавания биотин-лигазы (BLRP), которая также является mCherry положительной, позволяет ядерную изоляцию с использованием аффинной или флуоресцентной очистки. Та же исследовательская группа также создала аналогичную линию мышей, в которой ядерная мембрана помечена только mCherry без биотина8. Эти две генетически модифицированные линии мыши дают доступ к характеристике парных эпигеномных и транскриптомных профилей конкретных типов клеток, представляющих интерес.

Сигнальный путь ежа (Hh) играет решающую роль в развитии тканей9. GLI1, член семейства GLI, действует как транскрипционный активатор и опосредует передачу сигналов Hh. Клетки Gli1+ можно найти во многих гормон-секретирующих органах, включая надпочечники и яичко. Чтобы изолировать специфические для клеток ДНК и РНК из клеток Gli1+ с использованием мышиной модели NuTRAP , мышей Gli1-CreERT2 скрещивали с мышами NuTRAP . Мышей Shh-CreERT2 также скрещивали с мышами NuTRAP с целью выделения клеток, экспрессирующих звукового ежа (Shh). Следующий протокол показывает, как использовать Gli1-CreERT2; Мыши NuTRAP для выделения рибосомно-связанных РНК из клеток Gli1+ во взрослых мышах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все проведенные эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Обернском университете.

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол использует одно яичко (около 100 мг) при P28 от Gli1-CreERT2; Мыши NuTRAP (Mus musculus). Объемы реагентов, возможно, потребуется скорректировать в зависимости от типов образцов и количества тканей.

1. Сбор тканей

  1. Усыпляют мышей с помощью камеры CO2 , дезинфицируют поверхность брюшка 70% этанолом.
  2. Откройте нижнюю часть живота ножницами и удалите яички. Используйте жидкий азот (LN2), чтобы немедленно заморозить яички.
  3. Храните образцы в паровой фазе LN2 до использования.

2. Подготовка реагентов и бисера

  1. Приготовьте раствор для гомогенизации: добавьте 50 мМ Tris (рН 7,4), 12 мМ MgCl2, 100 мМ KCl, 1% NP-40 и 1 мг/мл гепарина. Хранить раствор при 4 °C до использования (до 1 месяца).
  2. Подготавливают рабочий буфер гомогенизации из исходного раствора (стадия 2.1) сразу перед применением: добавляют ДТТ (конечная концентрация: 1 мМ), циклогексимид (конечная концентрация: 100 мкг/мл), рекомбинантную рибонуклеазу (конечная концентрация: 200 единиц/мл) и коктейль ингибитора протеазы (конечная концентрация: 1x) в раствор для гомогенизации, чтобы сделать необходимое количество рабочего буфера гомогенизации. Храните свежеприготовленный рабочий буфер на льду до использования.
  3. Приготовьте буферы для промывки с низким содержанием соли и высоким содержанием соли:
    1. Для приготовления низкосолевой промывки смеют буферную смесь 50 мМ Tris (рН 7,4), 12 мМMgCl2, 100 мМ KCl и 1% NP-40. Перед использованием добавляют DTT (конечная концентрация: 1 мМ) и циклогексимид (конечная концентрация: 100 мкг/мл).
    2. Для приготовления высокосолевой промывочной буферной смеси 50 мМ Tris (рН 7,4), 12 мМMgCl2, 300 мМ KCl, 1% NP-40. Перед использованием добавляют DTT (конечная концентрация: 2 мМ) и циклогексимид (конечная концентрация: 100 мкг/мл).
  4. Приготовьте белковые шарики G (Таблица материалов):
    1. Для каждого образца потребуется 50 мкл белковых шариков G. Поместите необходимое количество бусин в центрифужную трубку объемом 1,5 мл и отделите бусины от раствора с помощью магнитной стойки, оставив трубку на стойке на 30-60 с.
    2. Удалите супернатант путем пипетирования. Вымойте бусины три раза с 1 мл ледяного буфера для промывки с низким содержанием соли каждый раз.

3. Лизис и гомогенизация тканей

  1. Добавьте 2 мл рабочего буфера гомогенизации ледяного холода (свежеприготовленного на этапе 2.2) в комплект измельчителя стеклянной ткани. Быстро поместите замороженный образец в мясорубку и гомогенизируйте ткань 30 ударами по льду с помощью рыхлого пестика.
  2. Переложите гомогенат в трубку круглого дна объемом 2 мл и центрифугу при 12 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  3. Перенесите супернатант в новую трубку объемом 2 мл. Сохраните 100 мкл в трубке 1,5 мл в качестве «входа».
  4. Инкубировать супернатант в трубке 2 мл с антителом против GFP (5 мкг/мл; 1:400) при 4 °C на торцевом ротаторе (24 об/мин) в течение ночи.

4. Иммунопреципитация

  1. Перенесите смесь гомогената/антитела в новую трубку круглого дна объемом 2 мл, содержащую промытые белковые шарики G со стадии 2.4. Инкубировать при 4 °C на торцевом ротаторе (24 об/мин) в течение 2 ч.
  2. Отделите магнитные шарики от супернатанта с помощью магнитной стойки. Сохраните супернатант как «отрицательную фракцию». Отрицательная фракция содержит (1) РНК в EGFP-отрицательных клетках и (2) РНК в EGFP-положительных клетках, которые не связаны с рибосомами.
  3. Добавьте 1 мл буфера для промывки с высоким содержанием соли в бусины и ненадолго вихрете трубку, чтобы промыть бусины. Поместите трубку в магнитную стойку.
  4. Снимите буфер стирки. Повторите этап стирки еще два раза. Бусины теперь содержат комплекс бусин-рибосома-РНК из EGFP-положительных клеток.

5. Экстракция РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги адаптированы из комплекта изоляции РНК (Таблица материалов). Рассматривайте каждую фракцию (т.е. входную, положительную и отрицательную) как независимую выборку и независимо изолируйте РНК.

  1. Инкубируйте шарики со стадии 4.4 с 50 мкл экстракционного буфера (из комплекта изоляции РНК) в термомиксоре (42 °C, 500 об/мин) в течение 30 мин для высвобождения РНК из шариков.
  2. Отделите бусины с помощью магнитной стойки, перенесите супернатант, который содержит комплекс шарики-рибосома-РНК, в трубку объемом 1,5 мл.
  3. Центрифугируйте трубку при 3000 х г в течение 2 мин, затем пипетку супернатанта в новую трубку объемом 1,5 мл. Эта трубка содержит «положительную фракцию» стадии TRAP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для входных и отрицательных фракций извлекайте РНК из 25 мкл образцов, используя 1 мл экстракционного буфера. Инкубировать в термомикшере (42 °C, 500 об/мин) в течение 30 мин.
  4. Предварительно обусловите колонну очистки РНК: Пипетку 250 мкл кондиционирующего буфера на колонну очистки. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Центрифугировать колонну при 16 000 х г в течение 1 мин.
  5. Пипетировать равный объем 70% EtOH в супернатант со стадии 5.3 (около 50 мкл 70% EtOH для положительной фракции и 1 мл 70% EtOH для входных и отрицательных фракций). Хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз.
  6. Пипетка смеси в колонну с этапа 5.4.
  7. Центрифугируют колонну при 100 х г в течение 2 мин, чтобы обеспечить связывание РНК с мембраной в колонке, затем продолжают центрифугу при 16 000 х г в течение 30 с немедленно. Отбросьте сквозной поток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для входных и отрицательных фракций каждый раз добавляйте в колонку 250 мкл смеси. Повторяйте шаги 5.6 и 5.7 до тех пор, пока не будут использованы все смеси.
  8. Пипетка 100 мкл Wash Buffer 1 (W1) в колонну и центрифугу при 8 000 х г в течение 1 мин. Отбросьте сквозной поток.
  9. Пипетку 75 мкл раствора ДНКазы смешивают непосредственно с мембраной очистительной колонны. Инкубировать в RT в течение 15 мин.
  10. Пипетка 40 мкл W1 в колонну и центрифугу при 8 000 х г в течение 30 с. Отбросьте сквозной поток.
  11. Пипетка 100 мкл Wash Buffer 2 (W2) в колонну и центрифугу при 8 000 х г в течение 1 мин. Отбросьте сквозной поток.
  12. Пипетка 100 мкл W2 в колонну и центрифугу при 16 000 х г в течение 2 мин. Отбросьте сквозной поток. Повторно центрифугируйте ту же колонну при 16 000 х г в течение 1 мин, чтобы удалить все следы промывочного буфера до стадии элюирования.
  13. Перенесите колонку в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
  14. Пипетка 12 мкл рваазной воды непосредственно на мембрану очистительной колонны. Наконечник пипетки не должен касаться мембраны. Инкубировать на RT в течение 1 мин и центрифугу при 1000 х г в течение 1 мин. Затем продолжают центрифугирование при 16 000 х г в течение 1 мин для элюирования РНК.

6. Концентрация и качество РНК

  1. Используйте биоанализатор для оценки качества и количества экстрагированной РНК10.

7. Хранение и дальнейший анализ

  1. Храните РНК при -80 °C (до 1 года) до дальнейшего анализа (например, микрочип, количественная ПЦР (qPCR) и РНК-seq и т. Д.).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации об анализе qPCR, включая синтез кДНК, обратитесь к Lyu et al.11. Грунтовки для qPCR перечислены в Таблице материалов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мыши Gli1-CreERT2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) были впервые скрещены с мышью-репортером NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) для генерации двухмутантных мышей. Мышам, несущим оба генно-инженерных аллеля генов (то есть Gli1-CreERT2 и NuTRAP), вводили тамоксифен один раз в день, через день, в течение трех инъекций. Образцы тканей собирали на7-й день после1-го дня инъекции. Иммунофлуоресцентный анализ показал, что EGFP экспрессировался в интер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полезность анализа транскриптома всей ткани может быть ослаблена, особенно при изучении сложных гетерогенных тканей. Как получить специфические для клеток РНК становится насущной необходимостью для высвобождения мощной техники РНК-seq. Выделение специфических для клеток РНК обычно основывается на сборе определенного типа клеток с использованием микроманипуляции, флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) или микродиссекции лазерного захвата (LCM)18. Другие современные высокопроизводител...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана NIH R00HD082686. Мы благодарим Летнюю исследовательскую стипендию Эндокринного общества H.S.Z. Мы также благодарим доктора Юань Кана за разведение и поддержание колонии мышей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ActbeurofinsqPCR праймерыATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (прямой праймер/обратный праймер)
БиоанализаторAgilent2100 Биоанализатор Инструмент
cOmplete Mini EDTA-free Protease-Inhibitor CocktailMillipore11836170001
циклогексимидMillipore239764-100MG
Cyp11a1eurofinsqPCR праймерыCTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTTT (прямой праймер/обратный праймер)
dNTPThermo Fisher ScientificR0191
DTT, DithiothreitolThermo Fisher ScientificP2325
DynaMag-2 магнитThermo Fisher Scientific12321D
Falcon пробирки 15 млVWR89039-666
GFP антителоAbcamab290
Набор стеклошлифовальных машинDWK Life Sciences357542
гепаринаBEANTOWN CHEMICAL139975-250MG
Hsd3beurofinsпраймеры qPCR праймерыGACAGGAGCAGGAGGGTTTG / CACTGGGCATCCAGAATCTC (прямой праймер/обратный праймер)
KClBiosciencesR005
MgCl2BiosciencesR004
Микроцентрифужные пробирки 2 млThermo Fisher Scientific02-707-354
Мышиные микрочипы Clariom S AssayThermo Fisher ScientificMicroarray service
NP-40Millipore492018-50 Ml
oligo (dT)20Набор для выделения РНК Invitrogen18418020
PicoPureThermo Fisher ScientificKIT0204
Protein G DynabeadThermo Fisher Scientific10003D
РНКазные водныегроуклелыNUPW-0500
RNaseOUT Рекомбинантный ингибитор рибонуклеазыThermo Fisher Scientific10777019
Sox9eurofinsqPCR праймерыTGAAGAACGGACAAGCGGAGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (прямой праймер/обратный праймер
Superscript IV обратная транскриптазаInvitrogen18090050
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4309155
Sycp3eurofinsпраймеры для количественной ПЦР праймерыGAATGTGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTTTGA (прямой праймер/обратный праймер)
TrisAlfa AesarJ62848

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
  2. Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
  3. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
  4. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
  5. Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985(2015).
  6. Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919(2020).
  7. Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624(2019).
  8. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  9. Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
  10. Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).
  11. Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
  12. King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
  13. Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
  14. Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
  15. Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
  16. Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
  17. Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481(2009).
  18. Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  19. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  20. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108(2018).
  21. Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693(2020).
  22. Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
  23. Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

EGFPNuTRAP

Похожие статьи