Поведенческая задача, моделирующая «повседневную память» на арене событий для формирования аллоцентрических представлений у грызунов

Краткое содержание

Цель этого оптимизированного протокола «повседневной памяти» на арене событий заключалась в том, чтобы использовать стабильную домашнюю базу, которая поощряет использование аллоцентрических пространственных представлений. Эта животная модель представляет собой эффективный испытательный полигон для будущих исследований формирования и сохранения воспоминаний о событиях с использованием поведенческих и физиологических методов.

Аннотация

Арена мероприятий обеспечивает оптимальную платформу для исследования обучения и памяти. Задача на будничную память, описанная в этой статье, представляет собой надежный протокол для исследования эпизодической и пространственной памяти у грызунов, который, в частности, способствует аллоцентрической репрезентации памяти. Крыс обучают находить и копать пищу во время фазы кодирования, и после некоторой задержки по времени крысам предоставляется выбор, чтобы найти гранулы пищи в правильном месте. Есть два ключевых элемента, которые способствуют использованию аллоцентрической стратегии в этом протоколе: 1) крысы начинают с разных стартовых точек внутри и между сессиями, 2) развертывается стабильная домашняя база, где крысы должны нести свою пищу, чтобы поесть. С помощью этих модификаций мы эффективно стимулируем грызунов использовать аллоцентрические пространственные представления для выполнения этой задачи. Кроме того, задача обеспечивает хорошую парадигму для внутрисубъектного планирования эксперимента и позволяет экспериментаторам манипулировать различными условиями для снижения изменчивости. Используемая в сочетании с поведенческими и физиологическими методами, полученная модель грызунов представляет собой эффективный испытательный полигон для будущих исследований формирования и удержания памяти.

Введение

Для исследования нейробиологии обучения и памяти требуются инвазивные методы, которые обычно невозможны у людей. Таким образом, на протяжении более ста лет для лабораторных животных разрабатывались поведенческие протоколы для моделирования различных форм человеческой памяти. Проектирование и выбор как задачи, так и устройства имеют решающее значение для успеха эффективных моделей человеческой памяти. Было разработано множество парадигм различной сложности, начиная от простых классических и инструментальных протоколов обусловливания ^1,2,3 и заканчивая лабиринтами, такими как Т-образный лабиринт⁴, радиальный лабиринт⁵, лабиринт Барнса⁶, водный лабиринт⁷ и сырный лабиринт⁸. Тем не менее, хотя эти задачи охватывают аспекты ассоциативного обучения и пространственной навигации, они не могут быть однозначно использованы для изучения репрезентации мгновенных событий в памяти (т.е. эпизодической памяти). И хотя новые методы распознавания объектов⁹ и перестановки этой задачи спонтанной памяти, такие как память на объект-место¹⁰, предоставили ценные сведения о памяти на узнавание, они не проверяют явное вспоминание событий. Для удовлетворения этого спроса была специально разработана арена событий, и ее использование позволило провести исследования в области долгосрочного кодирования и вспоминания памяти на основе парных ассоциаций 11,12,13, а также кодирования и вспоминания дискретных событий, происходящих в знакомом пространстве 14,15,16,17,18. Последняя тема находится в центре внимания данной рукописи.

Арена для соревнований представляет собой большую, квадратную, открытую площадку, где происходят мероприятия для грызунов. Размер арены может быть масштабирован для размещения крыс или мышей, а грызунам рекомендуется входить и исследовать. Типичным примером события, происходящего на арене, является нахождение и извлечение пищи из песчаного колодца в определенном месте. Для таких аппетитных заданий предназначена арена мероприятий, в которых крыс или мышей обучают искать, находить и выкапывать пищу. Это извлекает выгоду из их естественной склонности переносить пищу обратно в темную среду, которая в данном случае расположена рядом с ареной, где они затем едят ее. После минимального обучения копанию в поисках пищи грызуны естественным образом справляются с этой задачей и хорошо справляются с испытанием по кодированию, а также с испытанием выбора по отзыву, которое следует за испытанием кодирования после короткой, 30-минутной задержки. В испытании на выбор доступно несколько песчаных колодцев (т.е. мест для рытья), но только один из них вознаграждается.

В рамках событийной арены могут выполняться различные задачи (например, пространственная память, эпизодическая память и парное ассоциативное обучение). Учитывая интерес к разработке эффективных моделей эпизодической памяти, был разработан следующий протокол, в котором место, где можно найти пищу, изменяется ежедневно. В этой задаче грызуны должны помнить, где событие копания и успешного извлечения пищи произошло в последний раз на арене события. Протокол, описанный ниже, включает в себя испытание кодирования, в котором крысы каждый день ищут песчаный колодец в новом месте, а затем, после задержки, испытание по выбору отзыва, где недавно закодированное местоположение песчаного колодца вознаграждается, в то время как другие, альтернативные песчаные колодцы в других местах не содержат доступной пищи. Запоминание того, где была еда в предыдущий день, не помогает: правильное местоположение должно быть закодировано и запоминаться, по крайней мере, на некоторое время, каждый день. Соответственно, мы ввели термин «повседневная память», чтобы описать форму памяти, смоделированную в этой задаче, которую мы, как люди, используем ежедневно. Человеческим примером повседневной памяти является воспоминание о том, где человек припарковал свою машину в торговом центре (рисунок 1А) или положил очки по всему дому. В этом протоколе все интра- и внеаренные сигналы стабильны, так же как и в условиях нашей повседневной жизни (т.е. дома, в офисе, на автостоянке и т.д.). Таким образом, грызуны должны помнить, где что-то произошло в последний раз в знакомой среде (рис. 1B). Эта задача аналогична задаче с задержкой сопоставления с местом (DMP) в водном лабиринте¹⁹, но является ее улучшением. Будучи желающей задачей, она использует естественное поведение грызунов для^{поиска пищи,} а не их желание убежать из воды. Однако, как и в водном лабиринте⁷, здесь нет локальных подсказок, отличающих правильное расположение от неправильного; Животные должны использовать вспомнить, а не распознавать, чтобы найти правильное местоположение песчаного колодца после различной длительности задержки памяти.

Рисунок 1: Повседневная память. (А) Повседневная память человека. Схема, показывающая зеленый автомобиль, припаркованный на автостоянке. После некоторой задержки водитель пытается вспомнить, где именно она припарковала свою машину. (Б) Повседневная память животных. Схема, показывающая, как крыса копает и извлекает гранулу из песчаного колодца в одном из мест на арене мероприятия. После некоторой задержки крысе дается попытка выбора с несколькими неправильными песчаными колодцами (серые) и одной правильной песчаной скважиной (зеленые). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Арена событий уже успешно используется в исследованиях «повседневной памяти». Это воспоминания, которые автоматически кодируются каждый день, сохраняются в долговременной памяти, но часто забываются через относительно короткие периоды времени. Bast et ^al.14 продемонстрировали монотонную память, зависящую от задержки, которая варьируется от отличной памяти после коротких интервалов до уровня случайности через 24 часа. Тем не менее, сохранение памяти может быть успешно усилено за счет новизны после кодирования или, при нескольких попытках кодирования, при увеличенном интервале^15,17.

Арена для мероприятий универсальна и относительно ненапряженна; Аверсивные раздражители не используются. Размер арены, и задачи, которые она вмещает, могут быть адаптированы как для крыс^14,15, так и для мышей¹⁶. Кроме того, как наземная задача, он поддается физиологической регистрации и исследованиям кальция, в отличие от водного лабиринта²¹. Более того, в соответствии с принципами 3R (редукция, уточнение, замена), исследования, использующие арену событий, требуют меньшего количества животных для получения статистической мощности, поскольку возможны экспериментальные схемы внутри объекта (в которых каждое животное служит в качестве собственного контроля для фармакологических вмешательств, оптогенетической стимуляции и т. д.), и для мотивации не требуется аверсивная стимуляция. Несмотря на то, что начальное обучение требует больше времени и занимает больше сеансов, чем, например, в задачах на распознавание новизны, как только животные достигают стабильного, асимптотического уровня выполнения задач, такие манипуляции, как медикаментозное управление, управление транспортным средством или оптогенетическая стимуляция, могут перемежаться с относительно небольшим числом^{дополнительных тренировочных} сессий.. Кроме того, отдельные грани репрезентации подвергаются прямому экспериментальному контролю на арене событий, например, характер пространственного представления, используемого при решении задачи.

Вопрос репрезентации связан с ментальной структурой, используемой крысами при запоминании того, где происходят недавние события¹⁸. Помнят ли они, где находится еда, или помнят только, как добраться до еды? Крысы могут использовать аллоцентрические (картоподобные) или эгоцентрические (телесно-центрированные) пространственные представления для решения желающей задачи в пределах арены^. Однако для контроля и идентификации пространственной стратегии, используемой каждым испытуемым при выполнении задачи, существуют различные протоколы обучения, способные выборочно стимулировать использование только одного пространственного представления. Обычно эгоцентрическое представление используется, когда крысы приносят свою еду обратно в то же место, откуда они начали дневное испытание, что дает несколько возможностей запомнить место получения награды во время пробежек туда и обратно. Эта пространственная стратегия может быть использована независимо от того, меняется ли начальное местоположение изо дня в день или остается постоянным. В противоположность этому, аллоцентрическое представление предпочтительно, когда крысам необходимо переносить вознаграждение за еду в фиксированное место базы сбоку от арены, которое отличается от меняющихся стартовых локаций. Существует множество преимуществ аллоцентрических представлений в отношении емкости памяти мозга.

В этой статье мы обрисовали протокол «дом-база», который поощряет использование только аллоцентрического представления. Мы предоставили репрезентативные результаты для этой задачи, которые ясно иллюстрируют преимущества использования этой модели «повседневной памяти» грызунов в исследовании обучения и памяти и подчеркивают, как можно способствовать аллоцентрическим представлениям эпизодической пространственной памяти.

Протокол

Методы, описанные в этой статье, были одобрены Комитетом по этической экспертизе Эдинбургского университета; Они соответствуют Закону Великобритании о животных (научные процедуры) 1986 года и Директиве Совета Европейских сообществ от 24 ноября 1986 года (86/609/EEC), регулирующим содержание лабораторных животных и их использование в научных экспериментах.

ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальным объектом протокола, описанного ниже, являются крысы с капюшоном, но он может быть адаптирован для других штаммов грызунов.

1. Обращение с животными, содержание и контроль продуктов питания

1. Подождите 1 неделю, чтобы самцы крыс с капюшоном Листера поселились после прибытия. В течение этого времени ежедневно обрабатывайте их, нежно поглаживая и щекоча в клетках. Как только они уложатся, начните брать их примерно по 5 минут каждый день.
2. Записывайте вес каждой крысы по прибытии и каждые 2-3 дня в неделю. Адаптировать потребление пищи таким образом, чтобы вес каждой крысы постепенно снижался примерно до 85-90% от массы их свободно питаемого тела; Это можно оценить с помощью установленной кривой роста для свободно кормящихся крыс. Поддерживайте крыс в этом ограниченном по пище диапазоне веса на протяжении всего эксперимента.
3. Разместите крыс в световом цикле 12 часов (свет включен) / 12 часов (выключен свет) и проводите все эксперименты во время световой фазы (7 утра - 7 вечера).

2. Настройка аппарата

1. Экспериментальные помещения, диспетчерские и арена для мероприятий
   1. Экспериментальные и контрольные комнаты представляют собой либо одну комнату, разделенную на две части, либо две смежные комнаты, разделенные занавеской или дверью и необходимые для данного эксперимента.
      Примечание: Такое разделение не позволит экспериментаторам влиять на животных или мешать им, пока они выполняют и учатся этой сложной поведенческой задаче.
   2. Выделите одну комнату для арены событий, статических сигналов окружающей среды и экспериментальных процедур (т.е. экспериментальную комнату), а другую комнату используйте для записи действий крыс экспериментаторами (т.е. контрольную комнату).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Арена для проведения мероприятий представляет собой открытое поле квадратной формы, на котором можно изучать ассоциации между событием и местом проведения (Рисунок 2A). Название «арена событий» происходит от того факта, что это устройство представляет собой арену (т.е. открытое, но ограниченное пространство), в которой происходят «события» (например, выкапывание закопанных пищевых гранул в песчаных колодцах; Рисунок 2В)^17,18. Чтобы предотвратить переутомление и травмирование (т.е. растяжение спины) экспериментатора, арену приподнимают над полом (~1 м).
   3. Используя прозрачное плексиглас, постройте квадратную (160 см х 160 см) арену. Пол арены состоит из сетки 7 x 7 из 49 подвижных плиток белого плексигласа (20 см x 20 см; Рисунок 2А, В). Измените пять дополнительных плиток с центральным отверстием (диаметром 6 см): они будут удерживать песчаные колодцы внутри арены. Пять местоположений этих измененных тайлов расположены в конфигурации, указанной на карте песчаных колодцев каждого сеанса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конфигурация пяти местоположений скважин для скважин меняется с каждым новым сеансом (см. шаг 4.2).
   4. Разместите арену мероприятия в специально отведенном экспериментальном помещении. Расставьте кии внутри арены: расположите два отличительных ориентира с четко выраженными тактильными поверхностями (например, склеенную стопку мячей для гольфа (30 см (в) x 11 см (ш) x 11 см (д)) и бутылку с черной водой (22 см (в) x 9 см (г)) в двух местах на арене: ряд 4, столбец 2 и ряд 4, столбец 6 (рисунок 2В).
   5. Поддерживайте объекты, используемые для сигналов внутри арены, и их положение постоянными на протяжении всего эксперимента, но ежедневно очищайте их с помощью 70% этанола.
   6. Настройте 3D-подсказки для экстра-арены: расположите отличительные ориентиры (например, сферический фонарь с узором (40 см (d)); красный звездный фонарь (60 см (w)); синий фонарь (70 см (h) x 35 см (w)) и узоры по периметру арены для соревнований, которая расположена в центре экспериментальной комнаты (рисунок 2D).
   7. Следите за тем, чтобы объекты, используемые для подсказок за пределами арены, и их положение оставались неизменными на протяжении всего эксперимента.
2. Черные ящики
   1. Чтобы животные могли попасть на арену, постройте четыре одинаковых черных ящика из черного оргстекла (длина: 30 см, ширина: 25 см, высота: 35 см в коробке; Рисунок 2E). Каждый черный ящик должен иметь раздвижную дверь с дистанционным управлением на одной длине поверхности. Это даст экспериментатору контроль над входом крыс на арену.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Черное плексиглас создает темный интерьер, который крысы предпочитают яркой обстановке открытой арены для соревнований.
   2. Разместите эти черные ящики посередине вдоль каждой из четырех стен арены. Эти черные ящики будут определяться по их расположению относительно верхней части видеопотока в реальном времени, захваченного камерой и принятого компьютерами в диспетчерской, с использованием сторон света к северу (вверху), востоку (справа), югу (внизу) и западу (слева) от арены мероприятия.
   3. Позвольте крысам входить на арену из одного из трех черных ящиков, который называется стартбоксом (например, Восток, Юг и Запад; Рисунок 2А, оранжевые прямоугольники). Используйте оставшийся черный ящик (например, Север; Рисунок 2А, синий прямоугольник) в качестве домашней базы, на которую крысы будут входить, чтобы съесть пищу (т.е. гранулы), которую они добывают на арене.
      Примечание: Любое местоположение черного ящика (т.е. Север, Восток, Юг, Запад) может быть назначено в качестве домашней базы, но оно должно оставаться постоянным на протяжении всего эксперимента: стабильность его местоположения имеет решающее значение для успешного поощрения аллоцентрических пространственных представлений.
   4. В стартбоксы и домашнюю базу поместите два маленьких, прозрачных плоских колодца, один для воды, а другой для пищевых гранул (в случае домашней базы это используется только для вознаграждения на этапе привыкания) и поместите опилки в каждый стартовый ящик и домашнюю базу.
3. Сэндвеллс
   1. Используйте прозрачный акриловый пластик с внутренним диаметром (d) 6 см и общей глубиной (h) 6 см для создания песчаных колодцев, используемых для сокрытия пищевой награды, которую крысы добывают (т.е. находят, выкапывают и относят на домашнюю базу для еды). Вставьте сферическую перфорированную пластиковую миску на 4 см от верха. Вставьте колодцы для песка в адаптированную плитку внутри арены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластиковая миска создает доступную часть (6 см (d) x 4 см (h)) для вознаграждаемых гранул, к которым крысы имеют доступ, и недоступную часть (6 см (d) x 2 см (h)), к которой крысы не имеют доступа (рис. 3A, B).
   2. В колодцах с вознаграждением, как для кодирования, так и для проб по выбору на память, поместите четыре гранулы по 0,5 г в доступную секцию и восемь пищевых гранул в недоступную секцию (рис. 3C). В колодцах для песка без вознаграждения поместите двенадцать гранул в недоступную секцию (Рисунок 3C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как вознаграждаемые, так и невознаграждаемые песчаные колодцы содержат в общей сложности 12 гранул и заполнены специально подготовленным песком, который скрывает гранулы в песчаных колодцах.
   3. Наполните песчаные колодцы смесью песка и порошка масала (2,5 г масала/2,5 кг песка), чтобы замаскировать любой запах, исходящий от пищевых гранул. Приготовьте смесь песка и масала в начале каждого сеанса (Рисунок 3D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.3.2 и 2.3.3 предназначены для маскировки любых обонятельных артефактов, исходящих из песчаных колодцев, во время кодирования и испытаний выбора. Это гарантирует, что поиск крысами правильного места для песчаного колодца и выполнение ими задачи будут основываться исключительно на их памяти о месте, где была выкопана пища, а не на каком-либо запахе, исходящем от вознаграждаемого песчаного колодца, который мог бы выявить наличие пищи-вознаграждения.
   4. Во время пробного испытания, которое проверяет память крыс на местоположение одного песчаного колодца, который ранее был вознагражден (т.е. содержит пищевые гранулы), сделайте все пять песчаных колодцев, присутствующих на арене, невознаграждаемыми (т.е. в доступной части нет пищевых гранул); в том числе правильное расположение песчаного колодца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все песчаные колодцы, присутствующие на арене, содержат одинаковое количество дробинок (n = 12) в своей недоступной части.
4. Общая настройка и программное обеспечение
   1. Поддерживайте освещение экспериментального помещения на умеренном уровне яркости с помощью настенных галогенных ламп (115-125 люкс) и поддерживайте комнатную температуру в диапазоне от 19 до 23 °C.
   2. Установите камеру с зарядовой связью над ареной для проведения мероприятий в экспериментальной комнате, чтобы записывать и контролировать движения и поведение крыс (рис. 4A). Камера обеспечивает прямую трансляцию в соседнюю диспетчерскую как для пользовательского видеозахвата, так и для пользовательского компьютерного программного обеспечения (разработанного. А. Спунером, Эдинбургский университет).
   3. Отслеживайте движения крыс с помощью специального компьютерного программного обеспечения, используемого для измерения времени крыс (рис. 4B). Эта программа контролирует дверцу каждого черного ящика, позволяя экспериментаторам удаленно управлять доступом крыс на арену и с арены из соседней комнаты управления. Записывайте задержку каждого животного, чтобы найти правильный песчаный колодец, и время, затраченное на копание в каждом песчаном колодце во время выбора и испытания щупа.

Рисунок 2: Арена события и подсказки. (A) Схема, показывающая арену события (сокращения: N = Север, E = Восток, S = Юг, W = Запад). (B) Арена событий с подсказками внутри и за пределами арены. (C) Две 3D-подсказки внутри арены (слева направо): стек мячей для гольфа и цилиндрическая черная бутылка. (D) Несколько 3D-реплик экстра-арены (слева направо): узорчатый сферический фонарь; фонарь «Красная звезда»; Синий фонарь. (E) Один из четырех черных ящиков расположен посередине каждой стены арены. Три из этих черных ящиков служат в качестве стартовых ящиков, которые обеспечивают стартовую позицию для крыс в начале каждого испытания. Четвертый черный ящик — это домашняя база, где крысы потребляют пищу, которую они получают на арене. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Песчаные колодцы. (A) Схема, показывающая пустой песчаный колодец с надписями доступных и недоступных участков. (В) Пустой песчаный колодец с доступным и недоступным участком. (C) Схема, иллюстрирующая расположение гранул в вознаграждаемом (слева) и невознаграждаемом (справа) песчаном колодце. Как поощренные, так и невознаграждаемые песчаные колодцы содержат в общей сложности 12 гранул и заполнены специально подготовленным песком, который скрывает гранулы в песчаных колодцах. (D) Серия фотографий, показывающих подготовку скважины с вознаграждением, включая правильное размещение гранул в доступной части (шаг 1-4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Экспериментальная установка арены для проведения мероприятий. (A) Схема, показывающая экспериментальную установку экспериментальной и диспетчерской. (B) Скриншот, показывающий прямую трансляцию экспериментальной комнаты, просматриваемую с помощью пользовательского компьютерного программного обеспечения. Пользовательское компьютерное программное обеспечение позволяет экспериментаторам дистанционно управлять дверцами стартового бокса и проводить другие измерения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Протокол привыкания

ПРИМЕЧАНИЕ: Во время привыкания крыс обучают искать песчаные колодцы, копать в поисках еды в награду и исследовать арену события.

1. Учимся копать для получения награды за еду
   1. Поместите в индивидуальную клетку небольшую емкость, наполненную песком. Для первого сеанса (т.е. H1) добавьте три гранулы по 0,5 г пищи прямо под поверхностью песка и положите одну гранулу сверху. После этого поместите все четыре гранулы под поверхность (Рисунок 5).
   2. Поместите каждую крысу в индивидуальную клетку с одной песчаной колодцей, освежая песочницу для каждой крысы. Оставьте крысу в индивидуальной клетке до тех пор, пока она не выкопает и не достанет все четыре гранулы из песчаного колодца.
2. Сессия привыкания 1
   1. Поместите крысу в один из стартовых ящиков (например, на юге) на 30 секунд и положите гранулу (0,5 г) в небольшой плоский колодец для еды домашней базы (например, на севере). Размещенная гранула пищи действует как награда и побуждает крыс идти на базу, чтобы поесть.
   2. Откройте дверцу стартового ящика (например, на юг). Закройте дверь, когда крыса покинет стартовый ящик, войдет на арену и начнет исследовать эту новую среду.
   3. Если крыса не покидает стартовый ящик в течение 5 минут, вмешайтесь одним из двух способов. Либо подтолкните крысу выйти на арену, держа кисть прямо за дверью стартового ящика. Как только крыса заинтересуется, переместите щетку дальше на арену, позволяя крысе следовать за ней. Как только крыса окажется на арене и на безопасном расстоянии от двери стартбокса, закройте дверцу стартбокса.
   4. В качестве альтернативы можно вытащить крысу из стартового бокса, закрыть дверцу стартового бокса и поместить крысу на арену, прямо за дверью стартбокса, через которую она могла бы войти. Если крыса не мотивирована и плохо справляется с задачей (например, оставляет стартовый бокс без посторонней помощи, эффективно копает и т.д.), проверьте вес крысы и рассчитайте ее вес при свободном кормлении (%).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вес при свободном кормлении значительно превышает 85%, крыса может не испытывать голода; В этом случае его общая суточная норма питания (g) может потребовать дополнительного ограничения.
   5. После того, как крыса исследует арену в течение 10 минут, откройте дверь черного ящика на севере (т.е. дом-базу). Если крыса не входит в течение 5 минут после открытия двери, выведите крысу с арены, закройте дверь черного ящика Севера и поместите крысу в домашнюю базу.
   6. После того, как крыса закончит есть гранулу, помещенную в домашнюю базу в начале сеанса, верните крысу в ее домашнюю клетку.
3. Сеанс привыкания 2
   1. Поместите колодец для песка со всеми четырьмя пищевыми гранулами (0,5 г/гранула), закопанными под поверхность песка, на арене мероприятия. В дальнейшем изменяйте местоположение этой вознаграждаемой песчаной скважины каждый сеанс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Имея большие гранулы пищи (0,5 г), крысы предпочитают переносить их в среду, которую они считают безопасной (т.е. в темную среду), чтобы есть их^.
   2. Поместите одну гранулу кия в лунку с плоским дном, предназначенную для еды, в выбранный стартбокс (т.е. на востоке), а затем крысу.
   3. Когда крыса закончит есть дробинку кия, примерно через 45 секунд откройте дверцу стартового ящика (например, восточную).
   4. Закройте дверцу стартового ящика, как только крыса войдет на арену и окажется на безопасном расстоянии от двери. Если крыса не выходит из стартового ящика, обратитесь к шагам 3.2.3-3.2.4.
   5. Пусть крыса ищет первую дробинку в песчаном колодце. Чтобы успешно получить награду за еду, он должен копаться в единственном песчаном колодце, который теперь есть на арене.
   6. Как только крыса достанет первую гранулу, откройте дверь домашней базы (т.е. Северную). Затем крыса должна найти и войти на домашнюю базу, чтобы съесть свою награду. Если крыса начинает есть гранулу в пределах арены, осторожно направьте ее обратно на базу, чтобы съесть гранулу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень важно, так как каждую крысу необходимо поощрять к питанию на домашней базе; Без надлежащей подготовки они имеют тенденцию возвращаться в стартовый ящик испытания, из которого они вышли на арену, чтобы поесть.
   7. После того, как крыса съест первую дробину на домашней базе, позвольте ей покинуть домашнюю базу и вернуться на арену, чтобы забрать вторую дробину.
   8. После того, как вы достаете вторую гранулу, позвольте крысе снова найти домашнюю базу, чтобы съесть награду за еду. Как только крыса войдет на домашнюю базу, закройте дверцу черного ящика Севера.
   9. После того, как крыса закончит съедать вторую гранулу на домашней базе, осторожно выньте ее из домашней базы и верните крысу в ее домашнюю клетку.
4. Секции 3-7
   1. Повторите сеанс привыкания 2 (шаги 3.3.1-3.3.9) пять раз, с каждым сеансом закапывая гранулы в песчаный колодец все глубже (рисунок 5). К концу приучения предложите всем крысам быстро бежать к вознаграждаемому песчаному колодцу, находящемуся на арене, последовательно собирая доступные гранулы пищи и перенося их обратно на домашнюю базу, чтобы поесть.

Рисунок 5: Дизайн сеансов привыкания. С левой колонки на правую колонку: сеанс привыкания (H1-H7); стартбокс, используемый для каждой сессии (например, H1: Южный стартбокс (SB)); место, где крысы должны есть свою пищу (т.е. домашняя база на Севере); расположение доступных гранул в вознаграждаемом песчаном колодце (как в письменном, так и в иллюстрированном виде; p = гранула), которые будут размещены в указанном месте для каждого сеанса; Положение гранул в колодце с плоским основанием в одной клетке (как в письменной, так и в иллюстрированной форме), которое направлено на стимулирование поведения при рытье и усиление ассоциации крыс между рытьем в колодце и получением пищевого вознаграждения. Последние две колонки относятся к песчаным колодцам в одиночных клетках (за пределами арены). Аббревиатура: N/A = не применимо Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Основной протокол тренировки

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая основная тренировочная сессия состоит из двух попыток кодирования памяти (E1, E2), за которыми следует, после короткой задержки (~30 минут), одна попытка выбора на повторение (C1). Во время всех испытаний крысы должны последовательно извлечь две гранулы из вознаграждаемого песчаного колодца. После обнаружения каждой гранулы, крысы должны найти ее и войти на домашнюю базу, чтобы съесть эту пищу. Расположение правильной (т.е. вознаграждаемой) скважины уравновешивается между сессиями для всех крыс (рис. 5).

1. Меры по уравновешиванию
   1. Тщательно уравновесьте последовательность расположения песчаных скважин и порядок начальных ящиков, используемых между сеансами (рис. 6). Перед каждым сеансом подготавливайте карту местности (рисунок 6А); определить правильное расположение песчаной скважины для каждой крысы, которое должно заметно меняться от сеанса к сеансу (рисунок 6B); и создать противовесовый лист (рис. 6B,C) и лист учета (дополнительный рис. 1).
   2. Изготовьте три набора колодцев для песка, по пять колодцев для песка в каждом наборе (Рисунок 6C). Для каждого набора требуется пять колодцев с песком, потому что во время каждого испытания на арене используются пять колодцев (одно правильное и четыре неправильных), а для того, чтобы колодцы, используемые для каждой пробы, можно было чередовать в каждой сессии.
   3. Во время каждого сеанса используйте один набор песчаных колодцев для испытаний кодирования крысы (Рисунок 6B,C; Кодировка 1: Набор 1, скважина А; Кодировка 2: Набор 1, скважина B) и другой, другой набор песчаных колодцев (Рисунок 6B,C; Recall Choice: Set 2, Well C) для их испытания по отзыву выбора.
   4. В течение каждого сеанса используйте разные комбинации наборов песочных колодцев для каждой крысы (рис. 6B, C), а между сеансами чередуйте комбинации наборов песочных колодцев, используемые для каждой крысы.
2. Пробные версии кодирования
   1. Поставьте вознаграждаемый песчаный колодец в правильном месте в соответствии с картой местоположения и противовесом (Рисунок 7). Никогда не используйте места для киев внутри арены, центральную плитку или три плитки прямо перед четырьмя стартовыми ящиками в качестве места для колодца из песка.
   2. Поместите одну дробинку, за которой следует крыса, в стартовый бокс (например, Восток), предназначенный для кодирования испытания 1 (Е1); Дробина будет выступать в качестве подсказки для выполнения задания. Дайте крысе достаточно времени (~30 с), чтобы съесть эту гранулу кия, прежде чем начать испытание.
   3. Нажмите кнопку «Пуск » на экране, чтобы записать судебный процесс на собственную систему видеозахвата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно вести учет испытаний кодирования на крысах для (1) прозрачности исследований (т.е. получения необработанных доказательств выполнения задач каждым животным), (2) повторного подсчета баллов и (3) для будущего использования (т.е. для изучения и сбора данных для других показателей производительности).
   4. Откройте дверцу стартбокса дистанционно с помощью специального компьютерного программного обеспечения (рис. 4B).
   5. Запустите таймер в пользовательском компьютерном программном обеспечении, когда крыса войдет на арену, и закройте дверь стартового ящика.
   6. Дайте крысе 200 секунд на поиски нужной песчаной скважины, выкопайте и достаньте ее первую дробину. Если через 200 с крыса все еще не нашла нужную песчаную скважину или свою первую гранулу, достаньте одну из гранул из-под песка и положите ее сверху. Если крыса не смогла посетить правильный песчаный колодец и достать эту гранулу еще через 200 секунд, используйте щетку, чтобы аккуратно направить ее к нужному песчаному колодцу.
   7. Как только награда за еду найдена, крыса должна отнести ее на домашнюю базу (например, в черный ящик Севера) и съесть ее внутри. Если крыса не находит и не проникает на домашнюю базу, а вместо этого решает съесть свою первую гранулу на арене, быстро заберите крысу с арены и поместите ее на домашнюю базу.
   8. Съев первую гранулу на домашней базе, позвольте крысе войти на арену с домашней базы и найти вторую гранулу из подходящего песчаного колодца.
   9. После того, как вы достаете вторую гранулу, позвольте крысе найти ее и войти на домашнюю базу, чтобы съесть ее.
   10. Закройте дверь дома, как только крыса окажется в безопасности, и дайте ей достаточно времени, чтобы съесть вторую гранулу.
   11. Остановите запись и таймер пользовательской видеосъемки в пользовательском компьютерном программном обеспечении. Нажмите кнопку «Стоп » на экране в пользовательском программном обеспечении для захвата видео. Затем нажмите кнопку «Стоп » на экранном таймере пользовательского компьютерного программного обеспечения.
   12. Пока крыса ест, протрите пол арены тряпкой, смоченной в 70% растворе этанола. Делайте это между каждым испытанием.
   13. Подготовьте правильный песчаный колодец для кодирования испытания 2 (E2) и разместите его в правильном месте на арене события.
   14. Возьмите крысу с домашней базы и поместите ее в стартовый ящик (например, Запад), предназначенный для Е2.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Использование альтернативного стартового ящика имеет решающее значение для эффективного поощрения крыс использовать только аллоцентрическое пространственное решение для выполнения задачи, поскольку крысы не могут полагаться на статическую точку обзора арены или следовать своему предыдущему пути, чтобы успешно найти правильный песчаный колодец. Вместо этого они должны обращать внимание на подсказки внутри и за пределами арены, что способствует аллоцентрическому кодированию.
   15. Повторите шаги с 4.3.2 по 4.3.12, а затем верните крысу в ее домашнюю клетку.
3. Отзыв пробной версии выбора
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая проба по выбору вызова крысы проводится через 30-40 минут после второй попытки кодирования (E2) и представляет крысам арену с пятью песчаными колодцами.
   1. Поместите скважину с вознаграждением в правильное место, назначенное для сеанса, в то время как четыре скважины без вознаграждения будут размещены в четырех неправильных местах, выделенных для сеанса и крысы, о которой идет речь (Рисунок 8A). Карта расположения песчаных скважин для пяти песчаных скважин в пробном варианте отзыва изменяется для каждого сеанса и уравновешивается между сеансами.
   2. Поставьте песочницу, содержащую четыре доступные гранулы, в нужное место. Поставьте четыре дополнительных колодца - каждый без вознаграждения и без гранул в доступной части - в неправильных местах, указанных на карте расположения колодцев сеанса.
   3. Положите битку и крысу в стартовый ящик для пробного выбора (например, Юг). Убедитесь, что это начальное местоположение (например, C1: Запад) отличается от тех, которые использовались в двух испытаниях кодирования (например, E1: Восток, E2: Юг).
   4. Начните запись судебного разбирательства с помощью собственной системы видеозахвата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно вести учет испытаний выбора на основе отзыва крыс для (1) прозрачности исследований (т.е. необработанных доказательств выполнения задания каждым животным, которые могут быть представлены как часть дополнительного материала статьи), (2) повторного подсчета баллов и (3) для будущего использования (т.е. для изучения и сбора данных для других показателей эффективности).
   5. В пользовательском компьютерном программном обеспечении выберите таймеры, соответствующие сэндвеллам (таймерам сэндвелла), которые будут использоваться в данном конкретном сеансе (рис. 4B).
   6. Как только крыса съест гранулу кия (~30 с), откройте дверь с помощью пользовательского компьютерного программного обеспечения. Когда крыса покинет стартбокс, закройте дверцу стартбокса и запустите таймер в пользовательском компьютерном программном обеспечении.
   7. Когда крыса копается в колодце для песка, нажмите на значки колодца на экране, чтобы записать время, затраченное на копание в каждой скважине. Продолжайте записывать время копания крысы в каждой посещенной песчаной скважине до окончания испытания по выбору по отзыву.
   8. Затем позвольте крысе найти и войти на домашнюю базу, чтобы съесть эту еду.
   9. Используйте ту же процедуру, что и для испытаний по кодированию (см. шаг 4.2) для извлечения второй гранулы из правильного песчаного колодца в испытании выбора по отзыву.
   10. Не нажимайте и не записывайте время рытья крысы в каждой песчаной скважине, которую она посетила во время поиска второй гранулы. Запишите только порядок посещенных песчаных колодцев (используя номера от 1 до 5, присвоенные каждому местоположению песчаного колодца), прежде чем крыса успешно найдет вознагражденный песчаный колодец и достанет его вторую гранулу. Для этого нужна концентрация.

Рисунок 6: Репрезентативное уравновешивание. (A) Схема, иллюстрирующая, как карта расположения песчаного колодца и правильное расположение песчаного колодца, с которым сталкиваются крысы (например, Крыса 1), меняются в течение сеанса. (B) Пример таблицы противовесов для одного сеанса (например, сеанса 1). Для каждого испытания в рамках одного сеанса используется отдельный стартбокс (т.е. кодирование испытания 1 (E1) началось с южного стартбокса (SB)), но порядок их использования был одинаковым для каждого животного (например, крысы 1-3). Песчаные колодцы, использованные для правильного местоположения (например, местоположения 2, 4, 3), и связанные с ними наборы, использованные в полном объеме во время испытания выбора по отзыву, были уравновешены между испытаниями каждого сеанса (например, кодирование 1, кодирование 2, выбор по отзыву) и животными, выполняющими задачу (например, крыса 1-3). (C) Таблица с описанием наборов песчаных колодцев, уравновешенных внутри и между сессиями. Всего имеется 15 песчаных колодцев и три комплекта (набор 1-3) песчаных колодцев, каждый из которых содержит пять скважин (A-E). Каждая крыса использует разные лунки в каждом испытании кодирования и выбора по вспомнить. Например, как показано на рисунке 6B, крыса 1 будет использовать Sandwell 1A в испытании кодирования 1, Sandwell 1B в испытании кодирования 2 и Sandwell 2C в испытании выбора по отзыву. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

5. Тест с помощью пробника по отзыву

1. Используйте ту же установку, что и для испытания с выбором выбора, за исключением того, что ни в одном из пяти песчаных колодцев нет доступных гранул, включая ранее полученное вознагражденное правильное местоположение песчаного колодца (рис. 8A, B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в испытании по выбору отзыва, все пять песчаных колодцев доступны во время пробного испытания, и крысы могут свободно копать в любых песчаных колодцах по своему выбору; однако ни один из песчаных колодцев не содержит доступного пищевого вознаграждения - вместо этого все 12 гранул присутствуют в недоступной части каждого песчаного колодца (Рисунок 3C).
2. Разместите пять песчаных колодцев, не содержащих доступных гранул, на арене в местах, указанных на карте песчаных колодцев сеанса (Рисунок 8).
3. Поместите крысу в стартовый ящик с помощью кия. Используйте начальную позицию, которая не использовалась ни в одном из двух испытаний кодирования в одном и том же сеансе.
4. Установите таймеры песчаных колодцев в пользовательском компьютерном программном обеспечении в соответствии с картой песчаных колодцев сеанса (рис. 4B). Убедитесь, что таймеры песочного колодца, установленные в пользовательском компьютерном программном обеспечении, правильно соответствуют карте песчаных колодцев сеанса.
5. Начните запись пробного процесса в собственной системе видеозахвата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно вести учет пробных испытаний на крысах для (1) прозрачности исследований (т.е. необработанных доказательств выполнения задания каждым животным, которые могут быть представлены как часть дополнительного материала статьи), (2) повторного подсчета баллов и (3) для будущего использования (т.е. для изучения и сбора данных для других показателей эффективности).
6. После того, как крыса съест гранулу, откройте дверцу стартового ящика дистанционно с помощью специального компьютерного программного обеспечения (Рисунок 4B).
7. Как только крыса войдет на арену и окажется на безопасном расстоянии от двери, закройте дверцу стартбокса и запустите таймер в пользовательском компьютерном программном обеспечении.
8. Запишите время рытья крысы и задержку до каждого из песчаных колодцев, посещенных во время 120-секундного пробного испытания, щелкнув по каждому посещенному песчаному колодцу и удерживая его до тех пор, пока крыса продолжает копать. Обратный отсчет 120 секунд начинается, когда крыса копает в первом песчаном колодце.
9. Запишите время копания и задержки на отметках 60 с и 120 с, сделав снимок экрана пользовательского компьютерного программного обеспечения на временных отметках 60 с и 120 с.
10. По истечении 120-секундной пробной пробки поместите три гранулы в правильную песчаную скважину (т.е. в местоположение вознаграждаемой песчаной скважины в пробной версии кодирования), чтобы предотвратить ухудшение памяти. Крыса должна достать две из этих трех гранул. Как только гранула найдена, крыса должна найти и войти на домашнюю базу, чтобы съесть ее.
11. Нажмите экранную кнопку «Стоп » в пользовательском компьютерном программном обеспечении после проверки пробником в течение 120 с. Очистите имя файла и обратите внимание только на задержку крысы при извлечении первой и второй гранул, помещенных в теперь уже вознаграждаемом, правильном местоположении песчаного колодца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительное копание в правильном месте используется в качестве индекса памяти: хорошая память на повседневное событие, испытанная в испытаниях кодирования (т.е. нахождение правильного местоположения песчаного колодца сеанса), указывается на большее время, затраченное на копание в правильном месте, чем среднее время, затраченное на копание в неправильных местах.
12. Запланируйте тест с помощью пробника отзыва в начале обучения, чтобы проверить, находится ли производительность на уровне случайности. После этого планируйте зондовые тесты через определенные промежутки времени (например, каждый шестой сеанс) или планируйте только тогда, когда крысы достигают стабильной производительности задачи: чтобы гарантировать зондовый тест, их средний индекс производительности (%) должен составлять 60% или выше в течение трех последовательных сеансов. Средний индекс производительности определяется на шаге 7.3.1.

6. Контрольный тест без кодирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Испытание без кодирования — это контрольная мера, используемая для определения того, используют ли крысы обонятельные артефакты, а не память о правильном местоположении песчаного колодца, для выполнения задачи. Как следует из названия, «контрольный тест без кодирования» означает, что перед испытанием выбора по отзыву не было проведено никаких испытаний кодирования; Проводится только пробное испытание по выбору отзыва. Ожидается, что без возможности закодировать местоположение события повседневной памяти, результаты крыс в испытании выбора будут на уровне случайности. Если это не так, и крысы хорошо справляются с контрольным тестом без кодирования, может потребоваться перепроектирование песчаных колодцев и их доступных и недоступных отсеков.

1. Проведите пробное испытание по выбору отзыва, как описано в разделе 4.3 (шаги с 4.3.1 по 4.3.10).

7. Оценка эффективности

ПРИМЕЧАНИЕ: Измеряется несколько параметров, и на дополнительном рисунке 1 показан пример таблицы.

1. Выбор колодцев для песка
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор определяется как количество песчаных колодцев, в которых крысы копают, вплоть до правильного песчаного колодца, во время испытаний по выбору и отзыву зонда. Максимально возможное значение выбора – 5, так как всего здесь пять песчаных колодцев.
   1. Во время каждой попытки эксперимента (проба по вспоминанию выбора и пробная проба на вспоминание) определите, сколько выборов сделала крыса: кладет ли она свои передние лапы на колодец или опускается в него. Если крыса пробежала мимо или просто быстро обнюхала в непосредственной близости от песчаного колодца, это не считается выбором.
   2. В редких случаях, когда по видеомониторам трудно определить, делают ли крысы выбор (как определено выше), проверьте в конце испытания, нет ли следов рытья: то есть, не смещен ли песок вокруг песчаного колодца (колодцев). Если есть признаки копания, какими бы незначительными они ни были, считайте это выбором. Остановка у песчаного колодца и отказ от копания считается только посещением и не должна считаться выбором.
2. Ошибки
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ошибка определяется как количество неправильных колодцев (не вознаграждаемых), которые крысы посещают, прежде чем найти нужную скважину. Выбор определяется как количество песчаных колодцев, в которых крысы копают, вплоть до правильного песчаного колодца, во время испытаний по выбору и пробнику для отзыва. Максимальное количество ошибок — четыре, так как всего существует пять песчаных колодцев.
   1. Вычислим погрешность по следующей формуле:
      Ошибка = (Выбор - 1)
   2. Когда крыса повторно посещает неправильный колодец, не считайте это еще одной ошибкой, так как максимальное количество ошибок равно четырем из-за того, что всего существует пять колодцев.
3. Индекс эффективности (PI)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Индекс производительности определяется как количество ошибок, допущенных до того, как крысы найдут правильный песчаный колодец в испытании по выбору отзыва. При работе с пятью песчаными колодцами может произойти до четырех ошибок. Таким образом, уровень вероятности среди пяти песчаных колодцев составляет две ошибки (т.е. 50%).
   1. Рассчитайте индекс производительности по следующей формуле:
      
   2. Когда крыса повторно посещает неправильный колодец, не считайте это еще одной ошибкой, так как максимальное количество ошибок равно четырем из-за того, что всего существует пять колодцев.
4. Скрытое состояние
   ПРИМЕЧАНИЕ: Задержка определяется как время, прошедшее до начала земляных работ в правильных песчаных колодцах.
   1. Измерьте задержку с момента, когда крыса покидает стартовый ящик, до того момента, когда она достигнет нужного песчаного колодца. Отслеживайте и записывайте задержки с помощью пользовательского программного обеспечения.
5. Время копания
   1. Измерьте время рытья крыс в каждой скважине (как правильной, так и неправильной) в пробном испытании.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая память на повседневные события определяется тем, что крысы копаются в правильном колодце (n = 1) в течение большей части 120-секундного пробного испытания, чем среднее время, которое они тратят на копание в неправильных колодцах (n = 4).
   2. Рассчитайте правильное и неправильное с помощью следующих формул:
      
      

8. Избежание непреднамеренной предвзятости

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие меры контроля реализованы по всему протоколу для обеспечения воспроизводимости и надежности этой повседневной задачи памяти.

1. Уравновешивайте расположение песчаных колодцев между сеансами. Это позволяет избежать предвзятого отношения к наградам в пользу определенной стороны арены событий.
2. Уравновесьте наборы колодцев для песка, а также колодцы для песка в этих наборах, используемые в правильном положении, между сеансами и крысами в каждом сеансе. Это отбивает у крыс охоту пытаться следить за какими-либо испытаниями остаточного запаха, оставшимся после испытаний предыдущей крысы (крыс).
3. Протирайте пол арены мероприятия между каждым испытанием тряпкой, смоченной в 70% растворе этанола; Это предотвратит влияние пути предыдущего RAT (RAT) на последующее выполнение задачи.

Результаты

Этот стабильный протокол домашней базы был использован для успешного обучения крыс этой повседневной задаче памяти с использованием аллоцентрических представлений. В этом протоколе есть два важных элемента. Во-первых, животные начинают с разных черных ящиков (например, с Востока, Юга и Запада) во время сеансов и между ними (рис. 7А). В каждом сеансе есть две попытки кодирования и одна проба выбора по отзыву (или пробная проба вместо пробной попытки в некоторых случаях), все они начинаются с ...

Обсуждение

Люди автоматически кодируют отдельные события в повседневной жизни. Мы с готовностью вспоминаем одни события и забываем другие. Описанный выше протокол эпизодической повседневной памяти представляет собой надежный метод для исследователей, желающих исследовать этот тип памяти (эпизодическую память) у грызунов. Поскольку эта задача включает в себя ежедневный акт поиска и извлечения гранул пищи из определенного места, используется естественный инстинкт грызунов добывать пищу. Задача основы...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Камера	CCTVПерст	Н/Д
Арена для мероприятий	Университет Эдинбурга (спроектирован и построен в доме)	Университет Эдинбурга (спроектирован и построен в доме)	Арена для повседневных задач памяти
Крысы в капюшоне	Чарльз Ривер Великобритания	603
Multitimer Labview	Университет Эдинбурга (спроектирован и построен в доме)	Университет Эдинбурга (спроектирован и построен в доме)
Пневматика, рамы, винты арены для мероприятий	RS Components Ltd.	Университет Эдинбурга (. Спунер)	Инструменты для строительства арены
для мероприятий Sandwells	Adam Plastics (http://www.adamplastics.co.uk)	Университет Эдинбурга (P. Spooner)	Sandwells для арены
Startbox	Adam Plastics (http://www.adamplastics.co.uk)	Университет Эдинбурга (P. Spooner)
Запись видео	на компьютерах Windows 10 с программным обеспечением OBS, Blackmagic Decklink Mini Карты регистраторов	Н/Д