Методическая статья

Визуализация воспалительных каспаз, индуцированных близостью в макрофагах, полученных из моноцитов человека

DOI:

10.3791/63162

⸱

6 апреля 2022 г.

 , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Department of Molecular and Cellular Biology, Texas Children’s Hospital William T. Shearer Center for Human Immunobiology, Baylor College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает рабочий процесс получения макрофагов, полученных из моноцитов (MDM) из образцов крови человека, простой метод эффективного введения воспалительной каспазы бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC) в MDM человека без ущерба для жизнеспособности и поведения клеток, а также основанный на визуализации подход к измерению активации воспалительной каспазы в живых клетках.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Воспалительные каспазы включают каспазу-1, -4, -5, -11 и -12 и относятся к подгруппе инициаторных каспаз. Каспаза-1 необходима для обеспечения правильной регуляции воспалительной сигнализации и активируется бесконтактно-индуцированной димеризацией после рекрутирования в воспаленные. Каспаза-1 в изобилии присутствует в моноцитарной клеточной линии и индуцирует созревание провоспалительных цитокинов интерлейкина (IL)-1β и IL-18 до активных секретируемых молекул. Другие воспалительные каспазы, каспаза-4 и -5 (и их мышиный гомолог каспаза-11) способствуют высвобождению IL-1β, индуцируя пироптоз. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) - это инструмент, используемый для измерения воспалительной близости, вызванной каспазой, в качестве показания активации каспазы. Продомен каспазы-1, -4 или -5, который содержит область, которая связывается с воспалением, сливается с нефлуоресцентными фрагментами желтого флуоресцентного белка Venus (Venus-N [VN] или Venus-C [VC]), которые связываются с реформой флуоресцентного комплекса Венеры, когда каспазы подвергаются индуцированной близости. Этот протокол описывает, как вводить эти репортеры в первичные человеческие моноцитарные макрофаги (MDM) с использованием нуклеофекции, обрабатывать клетки, чтобы индуцировать воспалительную активацию каспазы, и измерять активацию каспазы с помощью флуоресценции и конфокальной микроскопии. Преимущество такого подхода заключается в том, что его можно использовать для выявления компонентов, требований и локализации комплекса активации воспалительной каспазы в живых клетках. Тем не менее, необходимо учитывать тщательный контроль, чтобы избежать ущерба жизнеспособности и поведению клеток. Этот метод является мощным инструментом для анализа динамических взаимодействий каспазы на уровне воспалительных сигналов, а также для опроса воспалительных сигнальных каскадов в живых МДМ и моноцитах, полученных из образцов крови человека.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Каспазы представляют собой семейство цистеиновых аспартатных протеаз, которые могут быть сгруппированы в инициирующие каспазы и каспазы палача. Каспазы палача включают каспазу-3, -6 и -7. Они естественным образом обнаруживаются в клетках в виде димеров и расщепляются инициаторами каспаз для выполнения апоптоза1. К каспазам-инициаторам относятся человеческие каспазы-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 и -12. Они обнаруживаются в виде неактивных зимогенов (прокаспасов), которые активируются бесконтактно-индуцированной димеризацией и стабилизируются автопротеолитическим расщеплением 2,3. Воспалительные каспазы являются подмножеством инициирующих каспаз2 и охватывают каспазу-1, -4, -5 и -12 у людей и каспазу-1, -11 и -12 у мыши 4,5. Вместо апоптотической роли, они играют центральную роль в воспалении. Они опосредуют протеолитическую обработку и секрецию про-интерлейкина (IL)-1β и про-IL-18 6,7, которые являются первыми цитокинами, высвобождаемыми в ответ на патогенные захватчики 8,9. Caspase-1 активируется при наборе на его платформу активации; большой молекулярно-массовый белковый комплекс, называемый инфламмасомой (рисунок 1А)10. Димеризация каспазы-4, -5 и -11 происходит независимо от этих платформ через неканонический воспалительный путь11,12.

Канонические инфламмасомы представляют собой цитозольные многомерные белковые комплексы, которые состоят из белка датчика воспаления, адапторного белка ASC (апоптоз-ассоциированный спекоподобный белок, содержащий CARD) и эффекторного белка каспазы-110. Наиболее хорошо изученными каноническими инфламмасомами являются NOD-подобное семейство рецепторов, содержащее пириновый домен (NLRP), NLRP1 и NLRP3, семейство NLR, содержащее CARD (NLRC), NLRC4 и отсутствующее в меланоме 2 (AIM2). Каждый из них содержит пириновый домен, CARD или оба домена. Домен CARD опосредует взаимодействие между CARD-содержащими каспазами и их восходящими активаторами. Поэтому молекула каркаса ASC, которая состоит из N-концевого пиринового домена (PYD) и мотива C-концевой CARD 13,14, необходима для рекрутирования каспазы-1 в воспалительные модели NLRP110, NLRP315 и AIM216.

Каждая инфламмасома названа в честь своего уникального сенсорного белка, который распознает различные провоспалительные стимулы (рисунок 1B). Активаторы этого пути называются каноническими стимулами. Инфламмасомы служат датчиками микробных компонентов и тканевого стресса и собираются, чтобы вызвать сильную воспалительную реакцию путем активации воспалительных каспаз17. Сборка инфламмасом инициирует активацию каспазы-1 для опосредования созревания и секреции ее основных субстратов pro-IL-1β и pro-IL-18. Этот процесс происходит с помощью двухэтапного механизма. Во-первых, прайминговый стимул повышает экспрессию определенных белков инфламмасомы и про-IL-1β путем активации пути NF-κB. Во-вторых, внутриклеточный (канонический) стимул индуцирует сборку и набор прокаспазы-1 6,7.

Каспаза-4 и каспаза-5 являются человеческими ортологами мышиной каспазы-1111. Они активируются инфламмасомно-независимым образом внутриклеточным липополисахаридом (ЛПС), молекулой, обнаруженной во внешней мембране грамотрицательныхбактерий 18,19,20, и внеклеточным гемом, продуктом гемолиза эритроцитов21. Было высказано предположение, что ЛПС связывается непосредственно с мотивом CARD этих белков и индуцирует их олигомеризацию20. Активация каспазы-4 или каспазы-5 способствует высвобождению IL-1β путем индуцирования воспалительной формы гибели клеток, называемой пироптозом, путем расщепления порообразующего белка гасдермина D (GSDMD)18,19. Кроме того, отток ионов калия, образующийся в результате каспазы-4 и GSDMD-опосредованной пироптотической смерти, индуцирует активацию воспалительной системы NLRP3 и последующую активацию каспазы-122,23. Поэтому каспаза-4, -5 и -11 считаются внутриклеточными датчиками для ЛПС, которые способны индуцировать пироптоз и активацию каспазы-1 в ответ на специфические стимулы11,24.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Анализ воспалительных каспаз и каспазо-бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC). (A) Диаграмма, показывающая систему каспазы-BiFC, где два продомена каспазы-1 (C1-pro), связанные с каждым нефлуоресцентным фрагментом Венеры (Venus-C или Venus-N), набираются на платформу активации NLRP3, заставляя Венеру пересворачиваться и флуоресцентировать. Этот комплекс появляется в виде зеленого пятна под микроскопом и служит считыванием для воспалительной близости, вызванной каспазой, что является первым шагом в активации инициатора каспазы. (B) Схема, показывающая доменную организацию компонентов воспаления и воспалительных каспаз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Измерение активации конкретных инициирующих каспаз затруднено, и существует не так много методов, доступных для этого с помощью подходов к визуализации. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) может быть использована для визуализации воспалительной активации каспазы непосредственно в живых клетках (Рисунок 1A)25. Этот метод был недавно адаптирован для использования в макрофагах человека, полученных из моноцитов (MDM)21. Caspase BiFC измеряет первый шаг в воспалительной активации каспазы, индуцированной близостью для облегчения димеризации. Использована экспрессия плазмид, кодирующих CARD-содержащий каспазный продомен, слитый с нефлуоресцентными фрагментами фотостабильного желтого флуоресцентного белка Venus (Venus-C [VC]) и Venus-N [VN]). Когда два продомена каспазы набираются на их платформу активации или подвергаются индуцированной близости, две половины Венеры приближаются в непосредственной близости и вынуждены переворачиваться и флуоресцентировать (см. Рисунок 1A, B). Это обеспечивает считывание в режиме реального времени специфической активации воспалительной каспазы.

Человеческий МДМ обильно экспрессирует гены воспаления и рецепторы распознавания образов, которые идентифицируют сигналы опасности и патогенные продукты. Это обеспечивает идеальный тип клеток для опроса воспалительных путей каспазы. Кроме того, они могут быть получены из периферической крови и даже из образцов пациентов для оценки активации воспалительной каспазы в определенном болезненном состоянии. Этот протокол описывает, как вводить репортеры каспазы BiFC в MDM с использованием нуклеофекции, метода трансфекции на основе электропорации, как обрабатывать клетки для индуцирования активации воспалительной каспазы и как визуализировать активные комплексы каспазы с использованием подходов микроскопии. Кроме того, эта методология может быть адаптирована для определения молекулярного состава этих комплексов, субклеточной локализации, кинетики и размера этих высокоупорядоченных структур 25,26,27.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол следует руководящим принципам комитета по этике исследований человека Медицинского колледжа Бейлора по манипулированию человеческими образцами. Образцы крови обрабатываются в соответствии с институциональными руководящими принципами безопасности для образцов человека. Образцы крови получают в региональном банке крови, где они собираются с помощью раствора цитратфосфат декстрозы (CPD). Однако кровь, собранная с другими антикоагулянтами, такими как гепарин натрия, гепарин лития или ЭДТА, также может быть использована для этого протокола28,29.

1. Выделение моноцитов человека и дифференцировка в макрофаги

  1. Получите антикоагулянтированную кровь от деидентифицированных здоровых людей в региональном банке крови и изолируйте мононуклеарные клетки периферической крови (PBMCs), как указано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги в ламинарной проточной вытяжке культуры тканей. Используйте только стерильные трубки и надевайте перчатки. Добавьте 10% отбеливателя ко всем продуктам, связанным с кровью, при утилизации. Стерильный PBS (1x) или DPBS (без Ca2+ и Мг2+) может использоваться взаимозаменяемо.
    1. Подготовьте буфер разбавления: Добавьте 1x стерильный PBS с 2% FBS и 0,5 мМ ЭДТА.
    2. Подготовьте культуральную среду: добавьте среду RPMI-1640 с FBS (10% (v/v)), глутамаксом (2 мМ) и пенициллином/ стрептомицином (50 I.U./50 мкг/мл)
    3. Предварительно охладите работающий буфер (Таблица материалов) в соответствии с протоколом производителя.
    4. Разбавьте цельную кровь двумя объемами разбавляющего буфера. Используя серологический пипет, переведите 15 мл антикоагулянтной крови в пробирку объемом 50 мл, содержащую 30 мл буфера разведения. Осторожно перемешайте путем инверсии.
    5. На каждые 10 мл цельной крови или 30 мл разбавленной крови добавляют 15 мл среды градиента плотности в пустую пробирку объемом 50 мл.
    6. Слой среды градиента плотности со стадии 1.1.5 на 30 мл разбавленной крови медленно и неуклонно с использованием серологического пипета объемом 25 мл. Держите наконечник пипетки прижатым к стенке трубки и трубки под наклонным углом.
    7. Аккуратно переложите трубки на центрифугу с качающимся ковшом. Избегайте нарушения двух фаз. Центрифугирование трубок при 400 х g при комнатной температуре (RT) в течение 25 мин с ускорением и замедлением, установленными на минимальное значение.
    8. Аккуратно снимите верхний (прозрачный) плазменный слой с помощью пипетки объемом 10 мл и утилизируйте в емкость с отбеливателем (10%).
    9. Собрать межфазный (белый) слой мононуклеарных клеток периферической крови (НБМК, рисунок 2) пипеткой объемом 10 мл и перенести в свежую трубку объемом 50 мл. Соедините белый слой из разных трубок одного и того же донора в трубку объемом 50 мл до 30 мл.
    10. Доведите каждый тюбик до общего объема 50 мл с буфером разбавления со стадии 1.1.1 и центрифугой при 300 х г и 4 °C в течение 10 мин. Удалите супернатант пипеткой объемом 10 мл и утилизируйте его в контейнер с отбеливателем (10%).
    11. Повторно суспендируйте каждую ячейку гранулы в 1 мл предварительно охлажденного рабочего буфера с шага 1.1.3 с помощью микропипетки p1000. Объедините клеточные суспензии от того же донора в новой пробирке объемом 15 мл. Доведите объем каждой трубки до 15 мл с предварительно охлажденным рабочим буфером и хорошо перемешайте путем инверсии.
    12. Возьмите 20 мкл аликвоты клеточной суспензии со стадии 1.1.11 и подготовьте разведение 1:100 с использованием 1x стерильного PBS. Определите номер ячейки с помощью гемоцитометра.
    13. Центрифугируют клеточную суспензию со стадии 1.1.11 при 300 х г и 4 °C в течение 10 мин и удаляют супернатант пипеткой объемом 10 мл. При необходимости используйте микропипетку p200, чтобы полностью удалить супернатант.
    14. Повторно суспендируйте изолированные НБМК в 80 мкл предварительно охлажденного MACS-буфера для каждого 1 x 107 ячеек, добавляя максимум 800 мкл буфера.
    15. Добавьте 20 мкл античеловеческих CD14 MicroBeads на каждый 1 х 107 клеток или до 100 мкл на образец крови (~ 100 мл неразбавленной крови). Хорошо перемешать путем инверсии и поместить на трубчатый ротатор на 20 мин с непрерывным перемешиванием при 4 °C.
    16. Извлеките образцы из ротатора трубки, добавьте 10 мл предварительно охлажденного рабочего буфера в каждую трубку и центрифугу при 300 x g (ускорение = 5, замедление = 5) и 4 °C в течение 10 мин.
    17. Удалите супернатант пипеткой объемом 10 мл и повторно суспендируйте до 1 х 108 ячеек в 500 мкл предварительно охлажденного рабочего буфера (2 х 108/мл).
    18. Выполните изоляцию CD14-положительных ячеек методом сортировки магнитных элементов с помощью ручной или автоматизированной системы (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
    19. Возьмите 20 мкл аликвоты клеточной суспензии со стадии 1.1.18 после CD14-положительного отбора и приготовьте разведение 1:100 с использованием 1x стерильного PBS. Определите номер ячейки, подсчитав клетки на гемоцитометре.
    20. Центрифугируйте CD14-положительные клетки при 300 х г и RT в течение 10 мин. Удалите супернатант с помощью пипетки 10 мл или вакуумной системы.
    21. Повторное суспендирование клеточной гранулы со стадии 1.1.20 в предварительно подогретой питательной среде со стадии 1.1.2 до конечной плотности клеток 1 х 107 клеток/мл.
  2. Засейте выделенные CD14-положительные моноциты при плотности клеток 5 х 106 клеток.
    1. На чашку для культивирования тканей объемом 10 см добавляют 10 мл питательной среды со стадии 1.1.2, дополненную гранулоцитарно-макрофаговым колониестимулирующим фактором 50 нг/мл (GM-CSF).
    2. Добавьте 0,5 мл клеточной суспензии со стадии 1.1.21 к культуральной среде по каплям и осторожно закрутите пластину. Инкубировать клетки в инкубаторе культуры увлажненной ткани (37 °C, 5% CO2) в течение ночи.
    3. На следующий день аспирируйте среду, используя вакуумную систему, чтобы удалить клетки, которые не прикреплялись в течение ночи. Добавьте 10 мл свежей питательной среды, дополненной GM-CSF (50 нг/мл), и инкубируйте клетки в инкубаторе культуры увлажненной ткани (37 °C, 5% CO2) в течение 7 дней, чтобы обеспечить полную дифференцировку (см. Рисунок 3A для появления моноцитов CD14+ на различных стадиях дифференцировки в GM-CSF). Обменивайте культуральную среду каждые 2-3 дня и каждый раз добавляйте свежую ГМ-ликвор (50 нг/мл).

figure-protocol-1
Рисунок 2: Схематический обзор экспериментального рабочего процесса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Приготовление компонентов электропорации

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для 10 мкл-неонового наконечника (Таблица материалов). Для каждой трансфекции используйте 1-2 х 105 клеток. Рекомендуется сеять трансфектированные клетки на 48-луночную пластину или 8-луночную камерную чашку (10 мкл-трансфектированных клеток на лунку). Вместо PBS можно использовать 1x стерильный DPBS (без Ca2+ и Mg 2+).

  1. На 7-й день готовят среду без антибиотиков, добавляя rpmI-1640 среду с FBS (10 % (v / v)) и глутамаксом (2 мМ).
  2. Поместите безмывороточную среду RPMI-1640, трипсин-ЭДТА (0,25%) раствор, 1x стерильный PBS (без Ca2+ и Mg2+) и полную питательную среду со стадии 1.1.2 на водяную баню 37 °C.
  3. При использовании посуды со стеклянным дном (для конфокальной микроскопии) покрывают посуду поли-D-лизином гидробромидом.
    1. Покрыть 8 хорошо камерных блюд 200 мкл поли-D-лизина гидробромида (0,1 мг/мл в 1x стерильном PBS) и инкубировать в течение 5 мин при РТ.
    2. Аспирировать раствор поли-D-лизина и промыть стекло один раз 1x стерильным PBS. Аспирируйте PBS и переходите к шагу 2.4.
  4. Добавьте 200 мкл среды без антибиотиков на лунку 48-луночной пластины или 8 хорошо камерной чашки и предварительно инкубируйте в инкубаторе увлажненной культуры тканей (37 °C, 5% CO2) до готовности к покрытию трансфектированных клеток.

3. Подготовка ячеек к электропорации

ПРИМЕЧАНИЕ: Выход МДМ из 10 см тарелки в конце 7-дневного периода дифференцировки составляет примерно 1,5 х 106 клеток. Вместо PBS можно использовать 1x стерильный DPBS (без Ca2+ и Mg 2+). Этот протокол был оптимизирован таким образом, что большинство макрофагов отделяются от пластины с поддержанием жизнеспособности и целостности клеток. МДМ трудно отсоединить от пластин клеточной культуры. Поэтому может потребоваться выполнить шаги 3.2 и 3.3 дважды, чтобы диссоциировать клетки. Убедитесь, что каждое время инкубации с трипсином-ЭДТА (0,25%) не превышает 5 мин.

  1. Аспирировать среду из полностью дифференцированных макрофагов на посуде 10 см и промыть клеточный монослой теплой безымянной средой RPMI-1640. Обязательно полностью удалите среду.
  2. Собирают клетки, добавляя 2 мл теплого раствора трипсина-ЭДТА (0,25%) на чашку 10 см и инкубируют в инкубаторе культуры увлажненной ткани (37 °C, 5% CO2) в течение 5 мин.
  3. Завершите отсоединение клетки, осторожно пипетировав раствор трипсина-ЭДТА (0,25%) вверх и вниз по всей площади тарелки с помощью микропипетки p1000. Перенесите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 5 мл теплой полной питательной среды со стадии 1.1.2.
  4. Поднесите блюдо к яркому полевому микроскопу и проверьте на отслоение клеток в различных полях зрения. Если все еще прикреплено значительное количество клеток, повторите шаги 3.2-3.3.
  5. Центрифугируют клеточную суспензию при 250 х г в течение 5 мин при РТ.
  6. Аспирировать среду и повторно суспендировать клетки в 10 мл 1x стерильного PBS, предварительно нагретого до 37 °C. Возьмите аликвоту 20 мкл для определения номера клеток с помощью гемоцитометра.
  7. Возьмите 1-2 х 105 клеток на предполагаемую трансфекцию и поместите в пробирку объемом 15 мл. Доведите до конечного объема 15 мл с предварительно нагретым 1x стерильным PBS. Центрифуга при 250 х г в течение 5 мин при РТ.
  8. Аспирировать PBS и центрифугу еще раз в течение 1 мин при 250 х г. Удалите все остатки PBS из гранулы ячейки с помощью микропипетки p200.

4. Нуклеофекция компонентов caspase BiFC в макрофаги моноцитового происхождения человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел протокола выполняется с использованием системы неоновой трансфекции (Таблица материалов). Этот протокол описывает шаги по трансфекции 1-2 x 105 клеток с использованием неонового наконечника объемом 10 мкл (Таблица материалов). При использовании неонового наконечника объемом 100 мкл соответственно увеличьте масштаб. Избегайте воздействия на клетки буфера ресуспенсии R в течение более 15 минут, так как это может снизить жизнеспособность клеток и эффективность трансфекции.

  1. Разбавьте репортерную плазмиду (т.е. mCherry или dsRedmito при 100 нг/мкл) в воде без нуклеазы или 0,5x TE-буфере для визуализации трансфектированных клеток.
  2. Разбавляют плазмиды Caspase BiFC до соответствующей концентрации в воде без нуклеазы или 0,5x TE-буфере, чтобы общий объем плазмид не превышал 30% от общего трансфекционного объема 10 мкл (т.е. 300 нг/мкл C1 Pro-VC и 300 нг/мкл C1 Pro-VN).
  3. Готовят 1,5 мл стерильной микротрубки на предполагаемую трансфекцию и добавляют соответствующее количество репортерной плазмиды (т.е. 50 нг или 0,5 мкл) и плазмид Caspase BiFC (т.е. 300 нг или 1 мкл C1 Pro-VC и 300 нг или 1 мкл фрагмента C1 Pro-VN). Держите микротрубки в капоте в любое время.
  4. Поместите пипетку, устройство, наконечники, электропорационные трубки и пипетку в стерильный ламинарный вытяжной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пипеточная станция, устройство, наконечники, электропорационные трубки и пипетка включены в систему неоновой трансфекции.
  5. Подключите разъем высокого напряжения и датчика на пипетке к задним портам устройства в соответствии с инструкциями производителя. Держите станцию пипетки близко к устройству.
  6. Подключите кабель питания к заднему входу переменного тока и перейдите к подключению устройства к электрической розетке. Нажмите выключатель питания, чтобы включить устройство.
  7. Введите параметры трансфекции на экране запуска, отображаемом при включении и соответствующем подключении устройства. Нажмите на Voltage, введите 1000 и нажмите Done , чтобы установить напряжение на 1000 В. Нажмите на Width, введите 40 и нажмите Done , чтобы установить длительность импульса на 40 мс. Наконец, нажмите на # Импульсы, введите 2 и нажмите Готово , чтобы установить число электрических импульсов равным 2.
  8. Возьмите одну из электропорационных трубок (входит в комплект) и заполните ее 3 мл электролитического буфера E (для наконечников 10 мкл и прилагается в комплекте) на RT. Вставьте электропорационную трубку в держатель пипетки на пипетке. Убедитесь, что электрод на боковой стороне трубки обращен внутрь и что при вставке трубки слышен звук щелчка.
  9. Возьмите гранулу ячейки со стадии 3.8 и добавьте 10 мкл предварительно нагретого ресуспенсионного R-буфера (входит в комплект) на каждые 1-2 х 105 клеток. Аккуратно перемешайте с микропипеткой p20. Добавьте 10 мкл клеточной суспензии в каждую трубку, установленную на этапе 4.3, и аккуратно перемешайте с микропипеткой p20.
  10. Возьмите пипетку и вставьте наконечник, нажав кнопку Push до второй остановки. Убедитесь, что зажим полностью поднимает крепежный шток поршня в наконечнике и что в верхней головке пипетки не наблюдается зазора.
  11. Чтобы аспирировать образец, нажмите кнопку push на пипетке до первой остановки и окунитесь в первую трубку, содержащую смесь ДНК клетки и плазмиды. Медленно аспирируйте смесь в кончик пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пузырьков воздуха, так как они могут вызвать дугу во время электропорации, и при обнаружении устройством могут предотвратить доставку электрического импульса. Если наблюдаются пузырьки воздуха, отпустите содержимое в трубку и попробуйте аспирировать снова.
  12. Вставьте пипетку с образцом очень осторожно в держатель пипетки. Убедитесь, что пипетка щелкает и что она правильно размещена.
  13. Нажмите кнопку Пуск на сенсорном экране и подождите, пока не подадутся электрические импульсы. Сообщение на экране будет означать завершение.
  14. Медленно извлеките пипетку со станции и немедленно добавьте трансфектированную клеточную суспензию в соответствующий колодец с предварительно нагретой средой без антибиотиков с этапа 2.4, медленно нажав кнопку до первой остановки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот наконечник может быть повторно использован до трех раз для одной и той же плазмиды; в противном случае выбросьте его в контейнер для биологически опасных отходов, нажав кнопку Push до второй остановки.
  15. Повторите шаги 4.10-4.14 для каждой трубки, содержащей смесь ДНК клетки/плазмиды.
  16. Аккуратно раскачивают пластину трансфектированными клетками и инкубируют в течение 1-3 ч в инкубаторе культуры увлажненной ткани (37 °C, 5% CO2).
  17. Добавьте к каждой лунке 200 мкл предварительно подогретой питательной среды (полной среды) со стадии 1.1.2. Поместите блюдо в инкубатор культуры увлажненной ткани (37 °C, 5% CO2) снова. Подождите не менее 24 ч для экспрессии генов.
  18. На следующий день осмотрите жизнеспособность клеток и эффективность трансфекции с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.
    1. Включите эпифлуоресцентный микроскоп и блок источника флуоресцентного света в соответствии с инструкциями производителя и поместите чашку для культивирования на ступень микроскопа.
    2. Выберите объектив 10x или 20x и фильтр 568 нм (RFP).
    3. Чтобы оценить жизнеспособность ячейки, нажмите кнопку Transmission Light LED (TL), чтобы визуализировать все ячейки в выбранном поле. Глядя в окуляр микроскопа, поверните ручку фокусировки до тех пор, пока клетки не будут замечены, и проверьте прикрепление клеток в выбранном поле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полностью прикрепленные клетки представляют жизнеспособные клетки, в то время как плавающие клетки представляют собой нежизнеспособные клетки. Если слияние лунки высокое, наличие неприсоединенных клеток может быть результатом переоценки количества клеток, а не результатом низкой жизнеспособности. Однако низкая сливаемость, сопровождаемая высоким содержанием плавающих клеток, означает низкую жизнеспособность, которая может возникнуть в результате дуги во время электропорации, плазмидной токсичности или чрезмерного воздействия на реуспензионный R-буфер. Не используйте колодцы, которые отображают последнее поведение.
    4. Чтобы оценить эффективность трансфекции, сосредоточьтесь на ячейках в выбранном поле при проходящего свете, как описано выше. Подсчитайте общее количество ячеек в выбранном поле. Выключив индикатор пропускаемого света (TL), нажмите кнопку «Отраженный свет» (RL), чтобы включить его.
    5. Тонко сосредоточьтесь на репортерной флуоресценции гена (красных клетках) и подсчитайте общее количество красных флуоресцентных клеток. Повторите эти шаги (4.18.4-4.18.5) по крайней мере еще для двух полей на скважину.

5. Лечение трансфектированного сбора данных MDM и caspase BiFC

ПРИМЕЧАНИЕ: Если планируется визуализировать клетки с помощью эпифлуоресцентного или конфокального микроскопа, рекомендуется лечение qVD-OPh (20 мкМ) в течение 1 ч до лечения выбранным стимулом для предотвращения каспазозависимой гибели клеток (преимущественно апоптоза). Это используется в визуализации, чтобы предотвратить взлет клеток из-за апоптоза, что делает их очень трудными для изображения, когда они выходят из фокальной плоскости. Обратите внимание, что набор каспазы в платформу активации и связанную с ней каспазу BiFC не зависит от каталитической активности каспазы, и, следовательно, ингибирование каспазы не повлияет на этот этап.

  1. Обрабатывают выбранным стимулом примерно через 24 ч после трансфекции и инкубируют столько, сколько необходимо для каждого препарата.
    1. Готовят среду визуализации, дополняя культуральную среду со стадии 1.1.2 гепесом (20 мМ, рН 7,2-7,5) и 2-меркаптоэтанолом (55 мкМ).
    2. Добавьте желаемую концентрацию стимула в предварительно нагретую среду визуализации и аккуратно перемешайте.
    3. Осторожно удалите среду из клеток микропипеткой p1000 и добавьте 500 мкл стимулирующего раствора со стадии 5.1.2 вниз по боковой стороне лунки.
    4. Чтобы запустить необработанные контрольные скважины, добавьте среду визуализации без стимула.
    5. Инкубируют клетки в инкубаторе культуры увлажненной ткани (37 °C, 5% CO2) до тех пор, пока это показано для каждой обработки.
  2. Визуализируйте клетки с помощью эпифлуоресценции или конфокального микроскопа.
    1. Включите микроскоп и источник флуоресцентного света, следуя инструкциям производителя.
    2. Выберите объектив 10x или 20x и поместите чашку культуры на ступень микроскопа.
    3. Используя окуляр микроскопа, найдите клетки под фильтром 568 нм и сосредоточьтесь на клетках, экспрессирующих репортер dsRedmito/mCherry (красные клетки).
    4. Подсчитайте все красные ячейки в поле зрения и запишите число.
    5. Находясь в том же поле зрения, перейдите на фильтр 488 или 512 (GFP или YFP), перейдите к подсчету количества красных клеток, которые также являются зелеными (Венера-положительные или BiFC-положительные) и запишите число.
    6. Подсчитайте не менее 100 dsRedmito/mCherry-положительных ячеек как минимум из трех отдельных полей зрения.
    7. Рассчитайте процент венеро-положительных трансфектированных клеток на поле зрения и усредните результирующие проценты для каждого лечения (колодца), чтобы получить стандартное отклонение.
  3. Изображение клеток с помощью эпифлуоресцентного или конфокального микроскопа
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения конфокальных изображений с использованием 20-кратного объектива или большего увеличения клетки должны быть покрыты стеклянными тарелками, если микроскоп не оснащен длиннопроходным объективом.
    1. Выполните шаги 5.2.1-5.2.3. При использовании конфокального микроскопа с масляным объективом 40x, 60x или 63x поместите каплю масла на объектив.
    2. Визуализируйте живое изображение ячеек на экране компьютера, полученное камерой. Используйте эпифлуоресцентный источник света для флуоресцентных изображений или переключите источник света на лазеры для конфокальных изображений.
    3. Тонкая настройка фокуса и положения ячеек с помощью джойстика управления и колеса фокусировки.
    4. Установите процент мощности лазера и время экспозиции для лазеров 512 нм или 488 нм (YFP или GFP) и 568 нм (RFP) таким образом, чтобы сигнал на изображении выглядел хорошо и не достигал насыщения.
    5. Включите запись в реальном времени и изучите полученное изображение. Убедитесь, что для каждого флюора в гистограммах дисплея для обоих каналов виден отдельный пик.
    6. При необходимости отрегулируйте мощность лазера и время экспозиции. Держите эти значения как можно ниже, сохраняя при этом возможность обнаруживать как флуоресцентные сигналы (RFP, так и GFP / YFP).
    7. При визуализации живого изображения ячеек сделайте несколько репрезентативных изображений поля, содержащего одну или несколько ячеек, экспрессирующих репортер mCherry/dsRedmito для каждого колодца пластины, и сохраните данные.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схема, показанная на рисунке 2, дает обзор того, как получить, трансфектировать и изобразить МДМ человека. После инкубации выбранных моноцитов CD14+ с GM-CSF в течение 7 дней морфология клеток изменяется в течение периода дифференцировки (рисунок 3A), переходя от сферических суспензионных клеток к веретенообразным и полностью присоединенным (дни 3 и 4), и, наконец, к большему распространению клеток при полной дифференцировке (день 7). Полностью дифференцированн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает рабочий процесс получения макрофагов из моноцитов, выделенных из образцов крови человека, и метод эффективного введения воспалительной каспазы Репортеров BiFC в МДМ человека без ущерба для жизнеспособности и поведения клеток.

Этот протокол использует методBiFC 35 для маркировки воспалительных каспаз в домене набора каспазы (CARD) с нефлуоресцентными фрагментами расщепленного флуоресцентного белка Венеры. Воспалительные каспазы кодируют каталитиче...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим членов лаборатории LBH в прошлом и настоящем, которые внесли свой вклад в разработку этой техники. Эта лаборатория поддерживается NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). Рисунок 2 был нарисован с помощью программного обеспечения Biorender.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
48 лунок для культуры тканей2:34 планшетыGenesee Scientific25-108
10 см Чашки для культуры тканейVWR25382-166
2 меркаптоэтанол 1000xThermo Fisher Scientific21985023
8 хорошо камерных покровных стекол с покровным стеклом 1,5 HPCellvisc8-1.5H-N
AutoMACS колонныMiltenyi (Biotec)130-021-101Для автоматизированного сепарирования только с помощью сепаратора AutoMACS Pro
Сепаратор AutoMACS ProMiltenyi (Biotec)130-092-545Для автоматизированного сепарации только с помощью только сепаратора AutoMACS
Pro Моющий раствор AutoMACSPro Miltenyi (Biotec)130-092-987Для автоматического сепарации только с помощью сепаратора AutoMACS
Pro Промывочный растворMiltenyi (Biotec)130-091-222Для автоматического разделения с помощью AutoMACS Pro Separator только
AutoMacs работает буферMiltenyi (Biotec)130-091-221Для ручного или автоматизированного разделения с помощью QuadroMACS или AutoMACS pro Separator
Axio Observer Z1 моторизованный инвертированный микроскоп, оснащенный блоком вращающегося диска CSU-X1A 5000ZeissЛюбой конфокальный микроскоп, оснащенный лазерным модулем, оснащенным лазерными линиями длиной волны 568 нм (RFP) и 488 или 512 нм (GFP или YFP) может быть использован
AxioObserver A1, Research Grade Inverted MicroscopeZeissЛюбой эпифлуоресцентный микроскоп с флуоресцентными фильтрами, способными возбуждать 568 нм (RFP) и 488 или 512 нм (GFP или YFP) длины волн
CD14+ MICROBEADSMiltenyi (Biotec)130-050-201Для ручного или автоматизированного разделения с помощью QuadroMACS или AutoMACS pro Сепаратор
DPBS без хлорида кальция и хлорида магнияSigmaD8537-6x500ML
DsRed mito плазмидаClontech632421Аналогичные плазмиды, которые можно использовать в качестве флуоресцентных репортеров, можно найти на Addgene
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mLSigmaGE17-1440-02
Добавка GlutaMAX (100x)Thermo Fisher Scientific35050079
GM-CSFThermo Fisher ScientificPHC2011
Hemin BioXtra, от Porcine, ≥ 96,0% (ВЭЖХ)Sigma51280-1G
HEPESThermo Fisher Scientific15630106
Воспалительные каспазы BiFC ПлазмидыДоступны по запросу в лаборатории
LBH LPS-EB UltrapureInvivogenTLRL-3PELPS
LS КолонкиMiltenyi (Biotec)130-042-401Для ручного разделения только с использованием сепаратора QuadroMACS
MACS 15 мл Штатив для пробирокMiltenyi (Biotec)130-091-052Для ручной сепарации только с помощью QuadroMACS Separator
MACS MultiStandMiltenyi (Biotec)130-042-303Для ручного разделения с помощью только QuadroMACS Separator
mCherry plasmidYungpeng Wang LabАналогичные плазмиды, которые можно использовать в качестве флуоресцентных репортеров, можно найти на
Addgene Neon Transfection SystemThermo Fisher ScientificMPK5000включает в себя устройство электропорации Neon, пипетку и пипетную станцию
Neon Transfection System 10 & микро; L KitThermo Fisher ScientificMPK1096включает в себя буфер для ресуспензии R, буфер для ресуспендирования T, электролитический буфер E, 96 x 10 и микро; L Неоновые наконечники и неоновые электропорационные трубки
Нигерицин натриевая соль, готовый растворSigmaSML1779-1ML
Пенициллин-стрептомицин (10,000 Ед/мл)Thermo Fisher Scientific15140122
поли-D-лизина гидробромидSigmaP7280-5mg
QuadroMACS SeparatorMiltenyi (Biotec)130-090-976Для ручного разделения с использованием Сепаратор QuadroMACS только
qVD-OPhFisher (ApexBio)50-101-3172
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875119
Trypsin-EDTA (0,25%), феноловый красныйThermo Fisher Scientific25200072
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific15575020
программное обеспечение Zeiss Zen 2.6 (blue edition)ZeissЛюбое программное обеспечение, используемое для работы с конфокальным микроскопом по вашему выбору

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
  2. Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
  3. Boice, A., Bouchier-Hayes, L. Targeting apoptotic caspases in cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (6), 118688(2020).
  4. Bolívar, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease. The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).
  5. Martinon, F., Tschopp, J. Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases. Cell. 117 (5), 561-574 (2004).
  6. Lamkanfi, M., Vishva, M. D. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157 (5), 1013-1022 (2014).
  7. Viganò, E., et al. Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes. Nature Communications. 6, 8761(2015).
  8. Cerretti, D. P., et al. Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme. Science. 256 (5053), 97(1992).
  9. van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. Inflammasome activation and IL-1β and IL-18 processing during infection. Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).
  10. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
  11. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11. Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).
  12. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
  13. Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).
  14. Bertin, J., DiStefano, P. S. The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins. Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).
  15. Agostini, L., et al. NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder. Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).
  16. Bürckstümmer, T., et al. An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome. Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).
  17. Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. Activation and regulation of the inflammasomes. Nature Reviews Immunology. 13 (6), 397-411 (2013).
  18. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  19. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  20. Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
  21. Bolívar, B. E., et al. Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1β Release and Cell Death. The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).
  22. Schmid-Burgk, J. L., et al. Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells. European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).
  23. Baker, P. J., et al. NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5. European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).
  24. Cullen, S. P., Kearney, C. J., Clancy, D. M., Martin, S. J. Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1β secretion by triggering necrosis. Cell Reports. 11 (10), 1535-1548 (2015).
  25. Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death & Disease. 6, 1813(2015).
  26. Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316(2018).
  27. Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Molecular Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
  28. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, Freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).
  29. Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Current Pathobiology Reports. 7 (2), 17-27 (2019).
  30. Perregaux, D., et al. IL-1 beta maturation: evidence that mature cytokine formation can be induced specifically by nigericin. The Journal of Immunology. 149 (4), 1294-1303 (1992).
  31. Cheneval, D., et al. Increased mature interleukin-1β (IL-1β) secretion from THP-1 cells induced by nigericin is a result of activation of p45 IL-1β-converting enzyme processing. Journal of Biological Chemistry. 273 (28), 17846-17851 (1998).
  32. Fernandes-Alnemri, T., et al. The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation. Cell Death and Differentiation. 14 (9), 1590-1604 (2007).
  33. Lu, A., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
  34. Muller-Eberhard, U., Javid, J., Liem, H. H., Hanstein, A., Hanna, M. Brief report: Plasma concentrations of hemopexin, haptoglobin and heme in patients with various hemolytic diseases. Blood. 32 (5), 811-815 (1968).
  35. Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
  36. Thornberry, N. A., et al. A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1βprocessing in monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
  37. Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation. Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).
  38. Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions. Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).
  39. Bhowmik, P., et al. Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 8 (1), 6502(2018).
  40. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).
  41. Kurokawa, M., Kornbluth, S. Caspases and kinases in a death grip. Cell. 138 (5), 838-854 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BiFC

Похожие статьи