Методическая статья

Микродиссекция и диссоциация мышиного яйцевода: идентификация отдельных сегментов и изоляция одиночных клеток

DOI:

10.3791/63168

⸱

4 ноября 2021 г.

 ,  ,  , 
1Division of Biomedical Sciences, School of Medicine, University of California, Riverside, 2Microscopy and Imaging Core Facility, University of California, Riverside

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен способ микродиссекции яйцевода мыши, позволяющий собирать отдельные сегменты при сохранении целостности РНК. Кроме того, описана процедура неферментативной диссоциации клеток яйцевода. Методы подходят для последующего генного и белкового анализа функционально различных сегментов яйцеводов и диссоциированных клеток яйцевода.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мышиные модельные системы не имеют себе равных для анализа процессов заболевания из-за их генетической манипулируемости и низкой стоимости экспериментального лечения. Однако из-за их небольшого размера тела некоторые структуры, такие как яйцевод диаметром 200-400 мкм, оказались относительно трудными для изучения, кроме как с помощью иммуногистохимии. В последнее время иммуногистохимические исследования выявили более сложные различия в сегментах яйцеводов, чем было признано ранее; таким образом, яйцевод делится на четыре функциональных сегмента с различным соотношением семи различных типов эпителиальных клеток. Различное эмбриологическое происхождение и соотношение типов эпителиальных клеток, вероятно, делают четыре функциональные области дифференцированно восприимчивыми к болезням. Например, поражения-предшественники серозных интраэпителиальных карцином возникают из инфундибулума в мышиных моделях и из соответствующей фимбриальной области в фаллопиевой трубе человека. Протокол, описанный здесь, детализирует метод микродиссекции для разделения яйцевода таким образом, чтобы получить достаточное количество и чистоту РНК, необходимых для последующего анализа, такого как обратная транскрипционно-количественная ПЦР (RT-qPCR) и секвенирование РНК (RNAseq). Также описан в основном неферментативный метод диссоциации тканей, подходящий для проточной цитометрии или одноклеточного анализа RNAseq полностью дифференцированных клеток яйцевода. Описанные методы будут способствовать дальнейшим исследованиям с использованием мышиного яйцевода в области репродукции, фертильности, рака и иммунологии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мышиный яйцевод похож по функциям и морфологии на человеческую фаллопиеву трубу1. Оба состоят из псевдостратифицированного реснитчатого эпителия, состоящего из двух исторически описанных эпителиальных резидентных клеток: реснитчатых клеток и секреторных клеток1,2. Яйцевод имеет три классически признанных сегмента: инфундибулум, ампулла и перешеек. В недавнем исследовании Harwalkar et al. 3 исследовали морфологию яйцеводов и экспрессию генов, что привело к расширению категоризации резидентных эпителиальных клеток до семи различных популяций. Кроме того, они установили ампуллярно-перешеечное соединение как отдельный сегмент яйцевода3. Способ, описанный в настоящем описании, который фокусируется на инфундибуле, ампуле и перешейке, может быть легко расширен, чтобы включить ампуллярно-истмическое соединение, а также2,3. Инфундибулярная область содержит остиум, или отверстие яйцевода, и включает в себя фимбриальную область, а также проксимальный стебель. Двигаясь в сторону матки, далее идет ампулла, а затем перешеек. Реснитчатые клетки наиболее заметны в дистальном конце области, проксимально к яичнику или инфундибулу, в то время как секреторные клетки наиболее заметны в проксимальном конце или сегменте перешейка1. В отличие от человеческой фаллопиевой трубы, мышиный яйцевод представляет собой спиральную структуру, поддерживаемую мезосальпинксом, продолжением широкой связки брюшины1,4. Кроме того, яйцевод мыши заключен в бурсальный мешок, что увеличивает вероятность переноса ооцитов в яйцевод4. Ампула определяется как место оплодотворения, из которого развивающиеся эмбрионы переходят в перешеек перед попаданием в матку5. Трубные сегменты имеют диаметр 200-400 мкм, а более длинные ампулярии и перешейки составляют примерно 0,5-1,0 см в длину4. Яйцевод растягивается во время эстрального цикла, а ампулы и инфундибулы более различимы, чем перешеек1.

Чрезмерная пролиферация клеток, особенно секреторных клеток, характеризует поражения предшественников серозных опухолей, обнаруженных в полости малого таза6. Эти предшественники серозных интраэпителиальных поражений возникают в эпителии яйцевода исключительно в области малоберцов; неизвестно, почему образование поражения ограничено этой областью, где обычно преобладающий тип клеток является реснитчатым, а не секреторным2,7,8. Региональность с точки зрения нормальной физиологической функции, а также повышенный интерес к яйцеводному происхождению рака яичников9,10,11,12,13 подчеркивают важность отдельной оценки сегментов яйцевода.

Метод, описанный здесь, детализирует сбор отдельных сегментов яйцевода для последующего анализа экспрессии специфических для сегмента генов и функции диссоциированных клеток. Традиционно многие ткани обрабатываются для экстракции всей РНК либо по фенолу: метод хлороформа, либо метод полной экстракции на колонке; однако мы обнаружили, что качество РНК поддерживалось при получении достаточного выхода с помощью описанного комбинированного метода. Используя этот метод, очень маленькие функциональные сегменты яйцевода могут быть обработаны для последующего анализа, а не для исследования яйцевода в целом, что может маскировать результаты, репрезентативные для различных сегментов14.

Диссоциированные мышиные клетки яйцеводов редко исследовались с помощью проточной цитометрии, скорее всего, из-за предельного выхода клеток из этой ткани. Один из подходов к преодолению этой проблемы заключался в диссоциации клеток, выращивании их в культуре, а затем стимуляции редифференцировки in vitro для получения соответствующих номеров клеток для последующего анализа клеток15,16,17,18. Ограничением этого подхода является время ex vivo и измененная микросреда в культуре, оба из которых, вероятно, изменяют экспрессию генов. Существует также предположение, что морфологическая редифференцировка имеет ту же транскрипционную и протеомную сигнатуру, что и у интактного животного. Современный метод диссоциации был разработан для достижения наибольшего количества эпителиальных клеток в гетерогенной популяции яйцеводных клеток при сохранении дифференцировки одиночных клеток. Кроме того, в основном неферментативный подход, вероятно, ограничивает потерю белков клеточной поверхности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры обращения с животными и их процедуры были одобрены Калифорнийским университетом, институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Риверсайде и соответствовали руководящим принципам Американской ассоциации по уходу за лабораторными животными, Министерства сельского хозяйства США и Национальных институтов здравоохранения. В описанном способе использовали C57BL/6 взрослых, самок мышей. Все животные были усыплены путем обезглавливания до сбора ткани.

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор протокола, в котором используется синий краситель для оказания помощи в эффективном рассечении и раскручивании яйцевода, показан на первом рисунке (рисунок 1).

Структура яйцевода: неповрежденная, окрашенная, удаление после яичников; Размотан с помощью схемы инфундибулума, ампулы, перешейка.
Рисунок 1: Обзор метода микродиссекции. (A) Левая панель показывает неповрежденную структуру, из которой была удалена большая часть жировой прокладки яичников и остатки соединительной ткани, окружающей яйцевод. После этого добавление толуидина синего помогает различить катушки яйцевода (средняя панель). Правая панель показывает структуры после удаления завязи. (B) Некрутый яйцевод с внутренними витками для определения того, где начинается и заканчивается каждый сегмент. (C) Карикатура на используемую сегментацию (не нарисованная в масштабе). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Подготовка поверхности рассечения

  1. Прикрепите кусочек зубного воска к чашке Петри с помощью клея и дайте ему высохнуть (рисунок 2А). Продезинфицируйте блюдо 70% этанолом. Поверхность готова к рассечению.

2. Макродиссекция яичника, яйцевода и матки

  1. Обездвижите чашку Петри, содержащую зубной воск, на холодной платформе по выбору (например, пакет со льдом, хранящийся при -20 °C перед использованием) под рассеченным микроскопом, когда он будет готов к рассечению (рисунок 2A).
  2. Продезинфицируйте вентральную поверхность животного 70% этанолом. Вскройте брюшную и тазовую полость стерильными ножницами для рассечения и переместите желудочно-кишечный тракт в одну сторону, чтобы найти дорсальную двурогую матку. Проследите за каждым рогом матки рострально, чтобы найти каждый яйцевод и яичник, окутанные жировой подушкой матки, расположенной чуть ниже почки (рисунок 2B, C).
  3. Иссекните оба боковых яйцевода с яичниками и часть дистального рога матки, все еще прикрепленную с помощью ножниц для рассечения. Вырежьте каждый боковой рог матки примерно 1-2 см рога, все еще прикрепленного к спиральному яйцеводу и яичнику (рисунок 2D). Погружают ткань сразу в 2 мл холодной рассеченной среды (см. Таблицу материалов).

Установка холодной платформы при процедуре ЭКО; схема иглы, чашки Петри; Иллюстрация строения завязи.
Рисунок 2: Макродиссекция яичника и установка рассечения. Яйцевод расположен дорсально в полости таза у основания почки в пределах жировой подушки яичника (В). Найдите раздвоение матки в полости таза (C) и следуйте за боковым рогом матки, чтобы найти континуум матки-яйцевод-яичник (B). Удалите эти структуры, разрезав один рог матки и грубо рассечение. Поместите на рассекающую платформу (A) и прикрепите часть матки к зубному воску иглой (A и D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте достаточно маточного рога неповрежденным и прикрепленным к яйцеводу, чтобы обеспечить прикрепление к платформе рассечения (рисунок 2D).

  1. Прикрепите ткань матки к зубному воску стерильной иглой 25 г, чтобы закрепить ткань для рассечения (рисунок 2A, D и рисунок 3A). Работая под рассеченным микроскопом, очистите и рассекните жировую прокладку яичников и соединительную ткань, чтобы обеспечить четкую визуализацию яйцевода (рисунок 3B).

Схема процесса рассечения яйцевода; включает идентификацию яичника, маточного рога, инфундибулума, ампулы.
Рисунок 3: Пошаговая микродиссекция яйцевода. После удаления остатков жира и соединительной ткани (A,B) добавляют толуидиновый синий в ткань (C), а затем смывают, чтобы облегчить визуализацию и последующее удаление яичника и раскрутку трубки (D-H). Инфундибулум можно найти рядом с проксимальным перешейком и маточно-трубным соединением (UTJ). Слегка потяните дистальный конец при разрезании на мезосальпинксе, чтобы размотать и выявить эндогенные повороты яйцевода (Н) для ориентации для соответствующей сегментации. Рисунок шкалы A-C = 500 мкм, шкала D-H = 400 мкм (I) Карикатура различных сегментов (не нарисованная в масштабе). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Используя шприц 1 мл, дозируют и инкубируют яйцевод, прикрепленный к матке, в 1-2 капли стерильного 1% раствора толуидина синего красителя в течение 30 с-1 мин. Промыть холодным фосфатно-буферным физиологическим раствором Dulbecco (DPBS) и удалить всю жидкость (рисунок 3C).
  2. Слегка вытяните яичник из свернутого яйцевода и отрежьте бурсальную мембрану и широкую связку, чтобы удалить яичник из яйцевода без ущерба для трубной ткани (рисунок 3D, E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Яичник не прикреплен к яйцеводу, а заключен в бурсальную мембрану с яйцеводом (рисунок 2D) и соединен с боковой стороной матки через широкую связку.

3. Микродиссекция и сегментация яйцевода

  1. Найдите дистальный, фимбриальный конец яйцевода, найденный латерально к маточно-трубному соединению (UTJ). Яйцевод обматывается обратно на себя; следовательно, фимбриальный конец может быть расположен латерально к проксимальному концу и является подходящей отправной точкой для ориентации для размотки яйцевода (рисунок 3F,I).
    1. Осторожно потянув трубку, отрежьте мезосальпинкс (рисунок 3I) пружинными микронарезами, чтобы размотать яйцевод (рисунок 3G).
  2. После размотки отрежьте трубку, чтобы получить инфундибулярную, ампуллярную и истмическую области (рисунок 3H).
    1. После иссечения инфундибулы (фимбриального конца и проксимального стебля) иссекают ампуллярную область путем разрезания после второго выступающего поворота трубки (разрезают между двумя и тремя витками, примерно 1 см в длину). Наконец, отрежьте оставшуюся часть до UTJ, которая является истмической областью (рисунок 3H).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Яйцевод не будет полностью раскручиваться в прямую структуру. Труба будет поддерживать свои обороты (рисунок 3H)3. На основании последующих витков, следующих за ампуллярной областью, можно дополнительно сегментировать оставшуюся трубку в ампулярно-истмический переход и перешеек3. После иссечения ампулы разрезают между пятью и шестью оборотами для получения ампулярно-истмического соединения; оставшаяся труба (поворот шесть к началу UTJ) является перешейком3.
  3. Немедленно заморозьте рассеченные сегменты ткани в жидком азоте для выделения РНК или зафиксируйте и обработайте каждый сегмент для ориентированного встраивания и иммуногистологического анализа.
    1. Добавьте 200 мкл реагента для экстракции холодной РНК и смесь шариков гомогенизации 1:1 (см. Таблицу материалов) в ткань, если вы продолжаете экстракцию РНК (см. этап 5.1).

4. Диссоциация яйцевода

  1. Продолжение этапа 3.1.1 выше) Для оптимальной диссоциации эпителия разрезают яйцевод в областях, где это возможно (т.е. инфундибулум и ампулла) для обнажения просветного эпителия (рисунок 4А).

Схема сечения маточных труб, экстракция эпителиальных образцов, установка для диссекции, лабораторное оборудование.
Рисунок 4: Диссоциация клеток яйцевода, часть 1. Мультфильм, показывающий, как обнажить дистальный эпителий для оптимальной диссоциации клеток (А) и изображение, показывающее самый простой способ использования сетки 1 мм2 (В). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Начиная с краевой области, используя щипцы в качестве рычага, разрезают трубку продольно ножницами пружинной формы.
  1. Измельчите разрезанные участки и оставшийся яйцевод на сегменты (размером ~1-2 мм) и добавьте 5 мл теплого, неферментативного буфера диссоциации (см. Таблицу материалов) и инкубируйте при 37 °C.
    1. Повторно суспендируют кусочки ткани и диссоциированные клетки с помощью лампового пипеттора каждые 3 мин в течение 9-10 мин. Разбавить буфер диссоциации 1:1 холодной рассеченной средой.
  2. Соберите ячейки методом центрифугирования (350 х г, 3 мин, 4 °С). Повторно суспендируют клетки в 2 мл буфера лизиса эритроцитов в течение 2 мин при комнатной температуре, а затем разбавляют 1:1 холодной диссекционной средой.
  3. Собирают клетки центрифугированием (350 х г, 3 мин, 4 °С) и повторно суспендируют в 5 мл холодного проназного раствора.
    1. Инкубировать в проназной среде пищеварения и повторно суспендировать клеточные сгустки с помощью лампового пипеттора каждые 3-5 мин до достижения одноклеточной суспензии (~25-30 мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап лучше всего выполнять в тканевой культуральной пластине или колбе, чтобы обеспечить постоянное наблюдение, предотвращающее ненужное чрезмерное воздействие проназы.
  4. Пропустите клетки через стерильную макросетку (сетка размером 1 мм x 1 мм, прикрепленная к конической трубке с резинкой (рисунок 4B)), чтобы удалить оставшиеся недиссоциированные кусочки ткани. Соберите клетки путем центрифугирования (350 х г, 3 мин, 4 °C) и повторно суспендируйте их в холодной среде, подходящей для последующего анализа (например, буфер FACS, если продолжить окрашивание для проточной цитометрии).

5. Экстракция РНК сегментов яйцевода

  1. Гомогенизируйте замороженные образцы в 200 мкл реагента экстракции РНК в гомогенизаторе тканей блендера шариков на уровне 12 в течение двух интервалов (3 мин каждый) при 4 °C с использованием смеси шариков из нержавеющей стали.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для сохранения целостности РНК образцы должны быть немедленно перемещены из замороженного состояния в реагент для экстракции РНК и не взвешиваться.
  2. Ненадолго центрифугу гомогенат при 100-200 х г в настольной центрифуге в течение приблизительно 5 с при комнатной температуре для отделения жидкости от шариков. Переложите супернатант в свежий тюбик.
  3. Добавьте еще 200 мкл реагента для экстракции РНК в шарики для извлечения большего количества образцов с последующим центрифугированием (100-200 х г, 5 с, комнатная температура). Комбинируйте супернатанты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте небольшой наконечник пипетки (большинство наконечников p200 подходят), чтобы предотвратить перенос шарика при удалении супернатанта.
  4. Следуйте рекомендациям производителя по фазированию и осаждению РНК. Репрезентативные образцы осаждали в течение ночи при -20 °C 100% изопропанолом (приблизительно 2:1 объем, изопропанол: восстановленная водная фаза).
  5. Перенос полного осадка РНК вместе с раствором в РНК-связывающую спиновую колонку и центрифугу в течение 30 с при 9 500 х г. Очистите РНК на колонке в соответствии с рекомендациями производителя, а затем элюируйте РНК в 20 мкл воды без нуклеазы. Оцените качество/количество на микрообъемном спектрофотометре и/или биоанализаторе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный протокол диссоциации дает 100 000-120 000 клеток на мышь с объединением обоих яйцеводов. Метод достаточно мягкий, чтобы оставить многореснитчатые клеточные границы нетронутыми, что позволяет проводить различие между мультиреснитчатыми клетками и секреторными клетками и проверять, что метод пищеварения достаточно мягкий, чтобы предотвратить дедифференцировку. Репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения на фиг.5 показывают мелкоклеточные сгустки после стадии 4.2.1, зафиксирован...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Три сегмента яйцевода гистологически, морфологически и функционально различны1,2,3. Эпителий сильно варьируется от одного конца яйцевода к другому. Реснитчатые клетки доминируют на фимбриальном/инфундибулярном конце, в то время как секреторные клетки доминируют в истмической области1. Хотя этот общий градиент был признан в течение некоторого времени, недавняя работа выявила больше различий между сегментам...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана премией Министерства обороны США за прорыв AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR был частично поддержан очными стипендиями: Pease Cancer Pre-Doctoral Fellowship и Mary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical Sciences and University of California, Riverside, intramural awards: Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant и Graduate Division Dissertation Year Program Award. Авторы благодарят Джиллиан М. Райт и Алиссу М. Кумари за помощь в раннем устранении неполадок этого метода.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,5 мм Смесь шариков из нержавеющей сталиNext AdvanceSSB05Смесь 1:1 с 1,4 мм SSB14B, стерилизованная
1,4 мм Смесь для бусин из нержавеющей сталиNext AdvanceSSB14BMix 1:1 с 0,5 мм SSB05, стерилизованная
1X Буферный фосфат Дульбекко А, pH 7,4 (DPBS)Gibco21600-010Холодная, стерильная
игла 25GBD305122
60 мм стерильные чашки ПетриCorning430166
70 μ m клеточные сеткиFisherbrand22-636-548
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kitAgilent 2100 Bioanalyzer5067-1513
Bead Bullet Blender Тканевый гомогенизаторNext AdvanceBBY24M
БиоанлизерAgilent 2100 Биоанализатор
Бычья сыворотка альбуминSigma AldrichA7906
Cold тарелка/упаковка/поверхность по выборуН/Д/ДХранится при -20 ° C для вскрытия
Dental waxPolysciences Inc.403
Дульбекко s Модифицированный Eagle' s Средний (DMEM)/ Ветчина s F12Corning10-090-CVПодготовьте среду для рассечения: DMEM/ Ham' s F12, 10% FBS, 25 мМ Hepes, 1% Pen-Strepping
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаCorning35-015CV
Щипцы выбора с тонкой точкойН/Д Н/Д
ГлицинSigma AldrichG712bИммуноцитохимическая валидационная визуализация
антимышиная IgG Alexa Fluor 555InvitrogenA-21422Иммуноцитохимическая валидационная визуализация
Козья антикроличья IgG Alexa Fluor 488InvitrogenA-11001Иммуноцитохимические валидационные изображения
HepesSigma AldrichH-3784
Hoescht 33342Cell Signaling Technologies4082SИммуноцитохимические валидационные изображения
Инвертированный составной микроскопKeyence BZ-X700
Мышиный антимышиный окклюдинInvitrogen33-1500Иммуноцитохимические валидационные изображения
Неферментативный диссоциативный буферN/A5 мМ ЭДТА, 1 г/л глюкозы, 0,4% БСА, 1X DPBS
Нейлоновая макросетка 1 мм x 1 ммThomas Scientific1210U04
ПараформальдегидSigma AldrichP-6148Иммуноцитохимическая валидационная визуализация
Pen-StrepMP Biomedicals10220-718
Пролонгировать золотой реагент AntifadeCell Signaling Technologies9071SИммуноцитохимическая валидация изображений: антифадерная монтажная среда
PronaseSigma Aldrich10165921001Prepare проназы Среда для расщепления: 0,15% проназы в DMEM/Ham's F12, стерильный
Propidium IodideRoche11 348 639 001Валидационные изображения
жизнеспособности Кролик антимышиный Ацетилированный тубулинAbcamab179484Иммуноцитохимическая валидация изображений
Буфер для лизиса эритроцитовBD Biosciences555899
RNeasy Mini KitQiagen74134Используется для очистки на колонке в тексте
Пружинные ножницы для микродиссекцииRoboz SurgicalRS-5610
Стерильные пипетки с лампой 3 млGlobe Scientific137135
Толуидиновый синийAlfa AesarJ66015Готовьте раствор толуидина синего: 1% в 1X DPBS, стерильные
трис-буферизованные физиологические растворы (TBST)N/AN/AИммуноцитохимические валидационные изображения; 0,1 N NaCl, 10 мМ Tris-Cl pH 7,5, 1% Tween 20
Triton-X-100Mallinckrodt Inc.3555Иммуноцитохимические валидационные изображения
Реагент экстракции РНК ТризолИнвитроген15596026Упоминается как реагент для экстракции РНК. В соответствии с рекомендациями производителя требуется вода, не содержащая нуцелазы, хлороформ и изопропонал в дополнение к экстракции тризола
Н Козья

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stewart, C. A., et al. Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. Kubiak, J. Z., et al. , Springer. Berlin Heidelberg. 247-262 (2012).
  2. Ford, M. J., et al. Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis. Cell Reports. 36 (10), 109677(2021).
  3. Harwalkar, K., et al. Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development. Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).
  4. Agduhr, E. Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse. Acta Zoologica. 8 (1), 1(1927).
  5. Pulkkinen, M. O. Oviductal function is critical for very early human life. Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).
  6. Kindelberger, D. W., et al. Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship. American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).
  7. Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells. Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).
  8. Lee, Y., et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube. Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).
  9. Kim, J., et al. High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).
  10. Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
  11. Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).
  12. Zhai, Y. L., et al. High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease. Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).
  13. Karthikeyan, S., et al. Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model. Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).
  14. Shao, R., et al. Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice. Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).
  15. Alwosaibai, K., et al. PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state. Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).
  16. Peri, L. E., et al. A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts. Biology of Reproduction. 92 (4), 102(2015).
  17. Lõhmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nature Communications. 11 (1), 2660(2020).
  18. Chen, S., et al. An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone. Scientific Reports. 7, 42298(2017).
  19. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565(2010).
  20. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  21. McGlade, E. A., et al. Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts. The FASEB Journal. 35 (5), 21563(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи