Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Система культивирования органов для оценки токсичности вспомогательных веществ и фармацевтических препаратов для внутриглазного лечения

949 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63176

⸱

7 января 2022 г.

 ,  ,  , 
1School of Optometry and Vision Science, University of Waterloo, 2Centre for Ocular Research & Education, School of Optometry and Vision Science, University of Waterloo, 3Tonomed Inc

В этой статье

Краткое содержание

Целью данного протокола является оценка изменений метаболической активности и преломляющей функции хрусталика в ответ на экспериментальное лечение.

Аннотация

Катаракта, являющаяся основной причиной слепоты, является серьезным бременем для десятков миллионов людей во всем мире, страдающих этим заболеванием. Воздействие химических веществ, наряду с другими факторами окружающей среды, является установленной причиной катаракты. Тестирование на офтальмологическую токсичность может оценить, могут ли фармацевтические препараты и их компоненты способствовать повреждению хрусталика, которое может привести к катаракте или помочь в лечении катаракты.

Исследования in vitro и испытания на животных in vivo могут быть использованы для оценки безопасности химических веществ до начала клинических исследований. Тест Дрейза — текущий стандарт in vivo для тестирования глазной токсичности и раздражения — подвергся критике за недостаточную чувствительность и объективные измерения определения глазной токсичности. Клеточные анализы in vitro ограничены, поскольку клеточные культуры не могут надлежащим образом смоделировать неповрежденный функциональный хрусталик.

Описанный здесь метод представляет собой чувствительную альтернативу испытаниям на животных in vitro , предназначенную для оценки реакции неповрежденного бычьего хрусталика на лечение как на уровне клеточной активности, так и на уровне общей рефракции. Нетоксичный реагент резазурин метаболизируется пропорционально уровню активности клеток. Лазерно-сканерный анализ линзы измеряет способность линзы преломлять падающие лучи света в одну точку с минимальной погрешностью, непосредственно связанной с его естественной функцией. Метод может быть использован для определения как острых, так и отсроченных изменений хрусталика, а также восстановления хрусталика после химических воздействий или воздействий окружающей среды.

Введение

Катаракта, поражающая более 20 миллионов человек, является наиболее распространенной причиной слепоты во всем мире 1,2. Катаракта чаще всего возникает из-за возрастных изменений хрусталика, но также вызвана травмой, генетическими состояниями, болезнями или токсическим воздействием2. В настоящее время лечение включает в себя хирургическое вмешательство по замене хрусталика, дорогостоящую и инвазивную процедуру, доступную в основном в развитых странах. Обширное бремя катаракты направило десятилетия исследований на профилактику катаракты и разработку нехирургических методов лечения. В обоих случаях важность доклинических испытаний на токсичность, эффективность и фармакокинетику офтальмологических препаратов имеет первостепенное значение. Этот процесс разработки лекарств в значительной степени опирается на информацию, полученную в ходе исследований, проведенных на животных.

В настоящее время стандартом для тестирования глазной токсичности in vivo является тест Дрейза, включающий доставку исследуемого соединения в конъюнктивальный мешок живого животного. Тест подвергся значительной критике, особенно в отношении этики животных, субъективности, плохой повторяемости иизменчивости. Кроме того, в тесте Дрейза нет компонента, который напрямую отслеживал бы воздействие исследуемых веществ на объектив. Значительные усилия были вложены в разработку альтернативных моделей in vitro 4. Тем не менее, ни один из них не был достаточно валидирован, чтобы заменить тест Дрейза5. Аналогичным образом, многие из этих моделей сталкиваются с ограничениями в отношении прямого применения к катаракте и другим сложным патологиям6. Например, методы оценки прозрачности объектива при размещении над сеткой по своей сути субъективны7. Исследования клеточных культур надежны и широко используются, хотя характеристики монослоя клеток могут отличаться от характеристик первичной культуры тканей8.

Целые хрусталики могут быть отделены от глаз животных и культивированы для сохранения их первоначальной структуры и функции. Одним из анализов, который полезен для оценки функции хрусталика при сохранении состояния органа, является анализ с помощью лазерного сканера хрусталика с использованием сканера, разработанного в Университете Ватерлоо в Канаде. Анализ представляет собой сканирующую систему, в которой используется серия лазерных проекций для измерения оптического качества или преломляющих характеристик хрусталика. Линзы сканируются в специальных двухсегментных камерах для культивирования, что позволяет лучам проходить снизу через линзу (рис. 1A). Камера, установленная внутри сканера, фиксирует изображение лазера, проходящего через объектив в многочисленных точках. Программное обеспечение сканера вычисляет расстояние за линзой, на котором она пересекается с центральной осью (расстояние до задней вершины, BVD), производя серию измерений, которые показывают, насколько последовательно линза фокусирует свет в одной точке (рис. 1).

Ячеистые свойства хрусталика, такие как плотное и упорядоченное расположение его ячеек, помогают поддерживать прозрачность и минимизировать рассеяние, чтобы линза могла функциональнофокусировать свет. Эта мера может быть использована для интерпретации того, насколько сильно химическое вещество нарушает основную структуру хрусталика, такую как градиентный показатель преломления, и насколько функция нарушается из-за индуцированных помутнений. Другие исследования, в которых изучалась реакция культивируемых хрусталиков и везикул хрусталика, показывают, что рассеяние света является продуктом структурных изменений, по сравнению с метаболическими изменениями, и что нарушения липидов и белков хрусталика могут повлиять на показатель преломления и, следовательно, увеличить рассеяние10,11.

Линзовый лазерный сканер может быть использован в сочетании с метаболическими реагентами в анализах для определения биохимических показателей токсичности клеток. Резазурин представляет собой нетоксичный химический реагент, метаболизируемый активными клетками с образованием восстановленного продукта (резоруфина) с измеряемой флуоресценцией12. Хрусталик в значительной степени лишен органелл, за исключением метаболически активных митохондрий, сосредоточенных в переднем эпителии и поверхностных корковых волокнах, удовлетворяющих энергетические потребности хрусталика13,14. Повреждение хрусталика на клеточном уровне может нарушить обмен веществ и часто предшествует возникновению патогенных структурных изменений и катаракты15.

Целью данного метода является оценка влияния ксенобиотиков и воздействия окружающей среды на хрусталик, которые могут способствовать развитию катаракты. Протокол включает в себя два анализа для оценки эффекта лечения с использованием культивируемого бычьего хрусталика. Преимущество этого подхода заключается в том, что он обеспечивает как клеческую, так и функциональную оценку того, как хрусталик как первичная ткань реагирует на лечение. Это чувствительная и объективная оценка хрусталика по сравнению с другими распространенными методами 16,17,18.

Модель была успешно использована для оценки эффектов различных воздействий, включая поверхностно-активные вещества, потребительские товары, алкоголь и ультрафиолетовое излучение 17,19,20. Изменения оптического качества постоянно присутствуют в культивируемых линзах в ответ на токсическое воздействие21. Способность этого метода поддерживать долгосрочную культуру хрусталика хорошо подходит для мониторинга потенциально отсроченного эффекта соединения и восстановления хрусталика от индуцированного повреждения или катаракты22,23. Результаты, полученные в результате применения этого протокола, могут быть использованы для снижения зависимости от испытаний на животных при разработке офтальмологических продуктов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все протоколы экспериментов были проведены в соответствии с этической политикой Университета Ватерлоо в отношении исследований с использованием тканей животных. Бычьи глаза для данного исследования были получены от немолочных коров в течение нескольких часов после смерти и немедленно препарированы, что занимает до 8 часов с момента получения глаз. Глаза должны быть немедленно рассечены для сохранения стерильности и качества диссекции. Питательную среду подготавливают до рН 7,4 и стерильно фильтруют перед добавлением FBS21. Все процедуры проводятся в стерильных условиях, при этом источники материалов и оборудования указаны в Таблице материалов.

1. Культура хрусталика крупного рогатого скота

  1. Препарируйте хрусталик путем удаления экстраокулярных мышц и тканей склеры, удаления задней половины глазного яблока и стекловидного тела, удаления радужки и цилиарного тела вместе с хрусталиком, затем отрезания зонулярных креплений, при этом окончательный разрез расположить таким образом, чтобы хрусталик опустился в камеру для культуры, заполненную средой.
  2. Препарированные линзы культивируют в специальных камерах с основанием, адаптированным для системы лазерного сканирования, с 21 мл стерильно отфильтрованной среды при 37 °C и 5%CO2. Используйте питательную среду с добавлением 3% фетальной бычьей сыворотки (FBS) с 1% пенициллин-стрептомицина, 9,4 г/л M-199, 0,1 г/л L-глютамина, 5,96 г/л HEPES, 2,2 г/л бикарбоната натрия и 7 мл/л NaOH. Неиспользованную питательную среду хранить в холодильнике до 7 дней.
  3. Заменяйте питательную среду каждые 1-2 дня. Перед использованием питательную среду прогрейте в течение часа при температуре 37 °C. С помощью стерильной пастеровской пипетки, подключенной к всасыванию, отсасывайте среду из индивидуальной камеры для культивирования и немедленно пополняйте ее с помощью добавленной среды.
  4. Культивируйте хрусталики в течение 48 часов после вскрытия, чтобы дать время для проявления физического повреждения. Осмотрите и отсканируйте линзы на предмет оптического качества в соответствии с разделом 4 перед включением в эксперимент.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Линзы ориентированы лицевой стороной вниз при подготовке к лазерному сканированию.

2. Порядок действий

  1. Приготовьте раствор с нужной концентрацией солюбилизирующего агента, совместимого с химическим соединением и питательной средой.
  2. Приготовьте раствор для управления транспортным средством, добавив солюбилизирующий агент в добавку. Перед экспериментом нагрейте контрольный раствор в течение часа до 37 °C.
  3. Используйте пастеровский пипетку, подключенную к отсасыванию, для аспирации питательной среды из камер контрольных линз. Пополните камеры раствором для контроля. При необходимости выполните этот шаг с образцами в трех экземплярах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальный объем 7 мл необходим для полного покрытия линзы в переднем положении лицевой стороной вверх. Условия для контроля в данном исследовании составляли 21 мл необработанной среды контроля, 21 мл контрольной среды для транспортного средства и 7 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
  4. Заквашивайте линзы в контрольной среде в течение 2 дней, затем замените новой контрольной средой в соответствии с разделом 1. При кратковременном воздействии отсасывайте контрольный раствор из камер и промывайте его не менее трех раз питательной средой без добавок, прежде чем возобновить протокол культивирования хрусталика, как описано в разделе 1.0.
  5. Дайте линзам акклиматизироваться в инкубаторе при температуре 37 °C и 5%CO2 в течение не менее 3,5 часов до оценки оптического качества.

3. Процедура воздействия

  1. Приготовьте раствор с нужной концентрацией солюбилизирующего агента, совместимого с химическим соединением и питательной средой. Смешайте химическое вещество с солюбилизирующим агентом, при необходимости предоставив соответствующее время для взаимодействия.
    Примечание: 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин был использован в настоящем исследовании для повышения растворимости ланостерола (0,033 г/л) в среде. Раствор бензалкония хлорида (БАК 0,0075%) готовили с использованием ПБС.
  2. Добавьте солюбилизированное химическое вещество в питательную среду. Подготовьте общий объем, достаточный для обеспечения 21 мл среды для всех образцов объективов. Перед экспериментом нагрейте испытуемую среду в течение часа при температуре 37 °C.
  3. Используйте пипетку Пастера, подключенную к отсасыванию, для аспирации питательной среды из камер линз. Немедленно пополните камеры тестовым раствором. По истечении интервала воздействия замените на добавленную питательную среду, предварительно выполнив полоскание при необходимости. При необходимости выполните этот шаг с образцами в трех экземплярах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании условия тестирования составляли 21 мл среды, обогащенной ланостерином, и 7 мл 0,0075% раствора BAK. Минимальный объем 7 мл необходим для полного покрытия объектива. В этом случае линзы в первую очередь должны быть ориентированы передней лицевой стороной вверх. Пипетка Пастера может быть использована для создания тока в камере для культивирования с некоторой частью окружающей питательной среды для изменения положения хрусталика.
  4. Верните линзы в инкубатор не менее чем на 3,5 ч для акклиматизации перед оценкой оптического качества.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Линзы ориентированы лицевой стороной вниз при подготовке к лазерному сканированию.

4. Оптический контроль качества (линзовый лазер-сканер)

  1. Убедитесь, что линзы ориентированы передней стороной вниз и визуально выровнены в камере для культивирования, используя технику из шага 3.3 для корректировки положения хрусталика, если это необходимо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Такое положение гарантирует, что падающий луч будет отражаться вверх через дно камеры и проходить через линзу от передней поверхности к задней.
  2. Поместите камеру для культивирования линз в лазерный сканер таким образом, чтобы штифт каретки камеры вошел в паз в основании камеры.
  3. Выберите объектив и точку сканирования , для которых необходимо выполнить сканирование, щелкните правой кнопкой мыши по объективу сканирования и дождитесь, пока сканер предложит найти и выровнять луч. Выберите начало и конечные точки на достаточном расстоянии для луча за объективом. Убедитесь, что центральный луч выровнен с помощью кнопок грубой и точной регулировки в программном обеспечении сканера и ручки регулировки на сканере. Когда луч будет выровнен, нажмите кнопку «Калибровка» и введите соответствующий выбор радиальных ступеней и разделения луча.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для данного исследования с использованием бычьего хрусталика настройки радиальных ступеней и разделения луча были установлены на 10 ступеней и 0,5 мм соответственно. Первое сканирование, которое выполняет сканер, служит для калибровки лазерного сканера. Это требуется один раз, и все дополнительные сканирования линз могут быть выполнены сразу после юстировки.
  4. После калибровки сканера нажмите кнопку «Сканировать». Подождите, пока будут сгенерированы значения среднего значения BVD, стандартного отклонения и ошибки по одной оси после завершения сканирования объектива, а также установки области луча. Установите осциллограф с места, откуда лучи выходят из объектива, в нужную конечную точку, выбрав максимальное расстояние за линзой, исключив при этом любые видимые помехи.
  5. Используйте созданную диаграмму для просмотра отдельных обратных вершинных расстояний для каждого луча.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Исключите прохождение лучей через шовные материалы линз. Чтобы исключить балку, используйте условные обозначения на экране, щелкните правой кнопкой мыши отдельную балку и выберите «Исключить».
  6. Вручную поверните положение основания камеры для культивирования внутри сканера на 90° таким образом, чтобы второе сканирование вдоль передней поверхности хрусталика было перпендикулярно предыдущему сканированию. Убедитесь, что центральный луч выровнен, как описано в шаге 4.3, а затем отсканируйте линзу.

5. Анализ метаболической активности (резазурин)

  1. Приготовьте среду без FBS. Прогрейте среду в течение часа при температуре 37 °C. Приготовьте 50 мл 8% реагента резазурина в необогащенной среде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточно подготовить 50 мл для заполнения всех лунок в 12-луночной пластине. Раствор следует готовить стерильно при тусклых условиях в непрозрачной емкости, так как резазурин светочувствительный.
  2. Добавьте 3,8 мл 8% раствора резазурина в каждую лунку в стерильном 12-луночном планшете с прозрачным дном, чтобы покрыть линзу.
  3. С помощью стерильных металлических совков осторожно приподнимайте линзы из-под задней поверхности и промывайте линзу с помощью пипетки Пастера небольшим объемом питательной среды без добавок. Поместите линзы по отдельности в каждую лунку.
  4. Инкубируйте лунку при 37 °C и 5%CO2 в течение 5 часов. После инкубации извлеките из лунок линзы с металлическими совками и поместите их в контейнер для утилизации отходов животного происхождения. Перелейте образец объемом 100 мкл из каждой лунки в стерильный 96-луночный планшет с прозрачным дном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Линзы могут быть оценены несколько раз с помощью анализа метаболической активности. В этом случае верните линзы в камеры культуры со свежей средой для инкубации. Анализ метаболической активности лучше всего проводить после завершения всех сканирований, так как краситель может повлиять на измерения BVD.
  5. Измерьте конечную флуоресценцию образцов объемом 100 мкл с помощью считывателя флуоресцентных пластин с длинами волн возбуждения и излучения 560 нм и 590 нм соответственно.

6. Анализ данных

  1. Для анализа оптического качества рассчитайте среднее арифметическое значений, рассчитанных программным обеспечением для ошибки BVD24 на основе двух сканирований, выполненных в каждой временной точке. Выполните этот расчет для всех объективов и всех точек сканирования.
  2. Для анализа метаболической активности соберите конечные значения относительной флуоресценции, полученные с помощью планшетного ридера. Нормализуйте данные, установив среднее значение всех контрольных значений на scanpoint на 100%. Рассчитайте активность каждой линзы в процентах от среднего контрольного значения для этой точки сканирования.
  3. Проведите тест на нормальность для всех экспериментальных групп. Предполагая, что данные в норме, проанализируйте разницу в ошибках BVD между контрольными и экспериментальными объективами с помощью двустороннего ANOVA. Кроме того, выполните тест множественных сравнений Тьюки post-hoc. Выполните однофакторный ANOVA и апостериорный тест Даннетта для получения данных о метаболической активности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунках 2 и 3 (n = 6) представлены результаты исследования, в котором изучалось влияние химической обработки (ланостерола) на бычий хрусталик. Ланостерол – это природный стерол в хрусталике, который когда-то показал многообещающие результаты в качестве потенциального фармацевтического вмешательства при катаракте25, хотя это еще предстоит доказать26. Дизайн исследования включал в себя управление средой и транспо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Целью данного протокола является непосредственная оценка воздействия химических веществ или окружающей среды на хрусталик в первичной культуре тканей. Сначала линзы препарируются и сканируются на оптическое качество. Предотвращение загрязнения и обеспечение качества вскрытия имеют решающее значение. Линзы сканируются через периодические промежутки времени для непрерывного мониторинга изменений рефракционной функции по отношению к контрольной группе или предконтактным условиям. Анализ мет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Благодарим Совет по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) и Канадский целевой фонд оптометрического образования (COETF) за средства для этого проекта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
(2-Гидроксипропил)-&бета;-циклодекстринSigma-AldrichH107Порошок
1 л Система фильтрации на крышкебутылки VWR97066-204Полная сборка, крышка бутылки, 0,2 μ m
100 мм чашка ПетриVWR89022-320Скользящая, в стиле медиа-сейвера, стерильная
12 лунокCorning353043Стерильная, с прозрачным дном
35 мм чашка ПетриVWR25373-041Чашка Петри одноразовая Falcon, стерильная, Corning
96 хорошо тарелкаVWR29442-072Стерильная, с прозрачным дном
Аламар синий (резазурин)Fischer ScientificDAL1100Molecular Probs реагент жизнеспособности клеток
Бензалкония хлорид растворSigma-Aldrich6324950% в H20
Кабинет
Cytation 5 планшетный ридерBioTekCYT5MPVCell imaging многорежимный ридер
Фетальная бычья сывороткаThermoFischer Scientific12484028Квалифицированный, термоинактивированный, Канада
HEPESSigma-AldrichH3375Для клеточных культур, порошковый
инкубатор
LanosterolSigma-AldrichL5768≥ 93%, порошок
L-глутаминSigma-AldrichДля клеточной культуры, порошок
Medium (M-199)Sigma-AldrichM3769Modified, с Earle′ Соли, без L-глутамина, бикарбоната натрия и фенолового красного, порошок, пригодный для клеточной культуры
Пипетки5 3/4'', с ватой и без ваты
Пенициллин-стрептомицинThermoFischer Scientific15140122жидкий (10 000 ед./мл)
Фоспатный буферный солевой раствор (PBS)жидкий, стерильный, подходит для клеточных культур
Наконечники для пипеток (100 & микро; L, 1,000 &; L, 5,000 &; L)VWRSterile
ScanTox (лазерный сканер линз)Специально разработанная собственнаяN/AScans с лазером для определения оптического качества линзы
Камера для культивирования ScanToxСпециально разработанная собственнаяН/ДУдерживает бычью линзу на месте во время тестирования и культивирования
Бикарбонат натрияSigma-AldrichS5761Для клеточной культуры, порошок
Гидроксид натрияSigma-AldrichS27701.0 N, биореагент, подходит для клеточных культур
биобезопасности Пастера линза

Ссылки

  1. Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
  2. Priority eye diseases. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/blindness/causes/priority/en/index1.html (2014).
  3. Wilhelmus, K. R. The Draize eye test. Survey of Ophthalmology. 45 (6), 493-515 (2001).
  4. Jester, J. V. Extent of corneal injury as a biomarker for hazard assessment and the development of alternative models to the Draize rabbit eye test. Cutaneous and Ocular Toxicology. 25 (1), 41-54 (2006).
  5. Vinardell, M. P., Mitjans, M. Alternative methods for eye and skin irritation tests: an overview. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (1), 46-59 (2008).
  6. Bonneau, N., Baudouin, C., Reaux-Le Goazigo, A., Brignole-Baudouin, F. An overview of current alternative models in the context of ocular surface toxicity. Journal of Applied Toxicology. , (2021).
  7. Bree, M., Borchman, D. The optical properties of rat, porcine and human lenses in organ culture treated with dexamethasone. Experimental Eye Research. 170, 67-75 (2018).
  8. Leist, C. H., Meyer, H. P., Fiechter, A. Potential and problems of animal cells in suspension culture. Journal of Biotechnology. 15 (1-2), 1-46 (1990).
  9. Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
  10. Alghamdi, A. H. S., Mohamed, H., Sledge, S. M., Borchman, D. Absorbance and light scattering of lenses organ cultured with glucose. Current Eye Research. 43 (10), 1233-1238 (2018).
  11. Tang, D., et al. Light scattering of human lens vesicles in vitro. Experimental Eye Research. 76 (5), 605-612 (2003).
  12. O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
  13. Bantseev, V., Sivak, J. G. Confocal laser scanning microscopy imaging of dynamic TMRE movement in the mitochondria of epithelial and superficial cortical fiber cells of bovine lenses. Molecular Vision. 11, 518-523 (2005).
  14. Remington, L. A., McGill, E. C. Clinical Anatomy of the Visual system. , Butterworth-Heinemann. Boston. (1998).
  15. Michael, R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Research. 32, 1-44 (2000).
  16. Hamid, R., Rotshteyn, Y., Rabadi, L., Parikh, R., Bullock, P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high through-put screening. Toxicology In Vitro. 18 (5), 703-710 (2004).
  17. Bantseev, V., et al. Mechanisms of ocular toxicity using the in vitro bovine lens and sodium dodecyl sulfate as a chemical model. Toxicological Sciences. 73 (1), 98-107 (2003).
  18. Sivak, J. G., Herbert, K. L., Segal, L. Ocular lens organ culture as a measure of ocular irritancy: The effect of surfactants. Toxicology Methods. 4 (1), 56-65 (1994).
  19. Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens. Toxicology In Vitro. 18 (6), 841-852 (2004).
  20. Sivak, J. G., Stuart, D. D., Herbert, K. L., Van Oostrom, J. A., Segal, L. Optical properties of the cultured bovine ocular lens as an in vitro alternative to the Draize eye toxicity test: Preliminary validation for alcohols. Toxicology Methods. 2 (4), 280-294 (1992).
  21. Wong, W., Sivak, J. G., Moran, K. L. Optical response of the cultured bovine lens; testing opaque or partially transparent semi-solid/solid common consumer hygiene products. Toxicology In Vitro. 17 (5-6), 785-790 (2003).
  22. Sivak, J. G., Stuart, D. D., Weerheim, J. A. Optical performance of the bovine lens before and after cold cataract. Applied Optics. 31 (19), 3616-3620 (1992).
  23. Stuart, D. D., Sivak, J. G., Cullen, A. P., Weerheim, J. A., Monteith, C. A. UV-B radiation and the optical properties of cultured bovine lenses. Current Eye Research. 10 (2), 177-184 (1991).
  24. Dovrat, A., Sivak, J. G. Long-term lens organ culture system with a method for monitoring lens optical quality. Photochemistry and Photobiology. 81 (3), 502-505 (2005).
  25. Zhao, L., et al. Lanosterol reverses protein aggregation in cataracts. Nature. 523 (7562), 607-611 (2015).
  26. Daszynski, D. M., et al. Failure of oxysterols such as lanosterol to restore lens clarity from cataracts. Scientific Reports. 9 (1), 8459(2019).
  27. Baudouin, C., Denoyer, A., Desbenoit, N., Hamm, G., Grise, A. In vitro and in vivo experimental studies on trabecular meshwork degeneration induced by benzalkonium chloride (an American Ophthalmological Society thesis). Transactions of the American Ophthalmological Society. 110, 40-63 (2012).
  28. Schartau, J. M., Kroger, R. H., Sjogreen, B. Short-term culturing of teleost crystalline lenses combined with high-resolution optical measurements. Cytotechnology. 62 (2), 167-174 (2010).
  29. Truscott, R. J. Age-related nuclear cataract-oxidation is the key. Experimental Eye Research. 80 (5), 709-725 (2005).
  30. Deeley, J. M., et al. Human lens lipids differ markedly from those of commonly used experimental animals. Biochimica et Biophysica Acta. 1781 (6-7), 288-298 (2008).
  31. Bantseev, V., et al. Effect of hyperbaric oxygen on guinea pig lens optical quality and on the refractive state of the eye. Experimental Eye Research. 78 (5), 925-931 (2004).
  32. Choh, V., Sivak, J. G. Lenticular accommodation in relation to ametropia: the chick model. Journal of Vision. 5 (3), 165-176 (2005).
  33. Oriowo, O. M., et al. Evaluation of a porcine lens and fluorescence assay approach for in vitro ocular toxicological investigations. Alternatives to Laboratory Animals: ATLA. 30 (5), 505-513 (2002).
  34. van Doorn, K. L., Sivak, J. G., Vijayan, M. M. Optical quality changes of the ocular lens during induced parr-to-smolt metamorphosis in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss). Ocular lens optical quality during induced salmonid metamorphosis. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 191 (7), 649-657 (2005).
  35. Herbert, K. L., Sivak, J. G., Bell, R. C. Effect of diabetes and fructose/non-fructose diet on the optical quality (cataracts) of the rat lens. Current Eye Research. 19 (4), 305-312 (1999).
  36. Wormstone, I. M., Collison, D. J., Hansom, S. P., Duncan, G. A focus on the human lens in vitro. Environmental Toxicology and Pharmacology. 21 (2), 215-221 (2006).
  37. Oyster, C. W. The human eye: structure and function. Sinauer Associates. , Sunderland, Massachussetts. (1999).
  38. Xu, M., McCanna, D. J., Sivak, J. G. Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Окулярная токсичностьоценка катарактытестирование токсичности для хрусталикаанализ in vitroбычий хрусталикметаболизм резазуриналазерный сканер хрусталикарефракционные показатели

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.