Анализ куриных рекомбинантных конечностей для понимания морфогенеза, паттернов и ранних этапов дифференцировки клеток

Краткое содержание

Рекомбинантные конечности являются мощной экспериментальной моделью, позволяющей изучать процесс дифференцировки клеток и генерации паттернов под влиянием эмбриональных сигналов. Этот протокол представляет собой подробный метод генерации рекомбинантных конечностей с куриными конечностями-мезодермальными клетками, адаптируемыми к другим типам клеток, полученных от разных организмов.

Аннотация

Клеточная дифференцировка - это тонко настроенный процесс клеточной приверженности, приводящий к образованию различных специализированных типов клеток во время создания развивающихся тканей и органов. Этот процесс активно поддерживается в зрелом возрасте. Дифференцировка клеток – это непрерывный процесс во время развития и гомеостаза органов. Понимание ранних этапов дифференцировки клеток имеет важное значение для знания других сложных процессов, таких как морфогенез. Таким образом, рекомбинантные куриные конечности являются экспериментальной моделью, позволяющей изучать дифференцировку клеток и генерацию паттернов по сигналам эмбрионального паттерна. Эта экспериментальная модель имитирует среду in vivo ; он собирает реагрегированные клетки в эктодермальную оболочку, полученную из раннего бутона конечности. Позже эктодермы переносятся и имплантируются в рецептор эмбриона цыпленка, чтобы обеспечить его развитие. Этот анализ в основном использовался для оценки клеток мезодермальных почек конечностей; однако он может быть применен к другим стволовым клеткам или клеткам-предшественникам других организмов.

Введение

Конечность позвоночных является грозной моделью для изучения дифференцировки клеток, пролиферации клеток, гибели клеток, формирования паттернов и морфогенеза ^1,2. Во время развития конечности возникают в виде выпуклостей из клеток, полученных из боковой пластинки мезодермы¹. Почки конечностей состоят из центрального ядра мезодермальных клеток, покрытых эктодермой. Из этой ранней структуры возникает цельная и хорошо сформированная конечность. После возникновения бутона конечности распознаются три оси: (1) проксимо-дистальная ось ([PD] плечо к пальцам), (2) дорсо-вентральная ось ([DV] от тыльной стороны руки до ладони) и (3) передне-задняя ([AP] большой палец к пальцу). Проксимально-дистальная ось зависит от апикального эктодермального гребня (АЭР), специализированной эктодермы, расположенной на дистальном кончике бутона конечности. AER необходим для роста, поддержания выживаемости, пролиферации и недифференцированного состояния клеток, получающих сигналы ^2,3. С другой стороны, зона поляризационной активности (ZPA) контролирует переднезаднюю картину⁴, в то время как дорсальная и эктодерма контролируют дорсовентральный паттерн ^7,8. Интеграция трехмерного паттерна подразумевает сложные перекрестные помехи между этими тремя осями⁵. Несмотря на понимание молекулярного пути во время развития конечностей, открытые вопросы о механизмах, которые контролируют паттерн и правильный рост для формирования целой конечности, остаются без ответа.

Эдгар Цвиллинг разработал систему рекомбинантных конечностей (RL) в 1964 году для изучения взаимодействия между мезенхимальными клетками конечностей и эктодермой в развивающихся конечностях⁶. Система RL собирает диссоциированную-реагрегированную мезодерму почки конечности в эктодерму эмбриональной конечности, чтобы пересадить ее в дорсальную часть донорского эмбриона цыпленка. Сигналы, обеспечиваемые эктодермой, индуцируют экспрессию генов дифференцировки и генов паттернов пространственно-временным образом, тем самым вызывая формирование конечностной структуры, которая может повторять клеточные программы, возникающие во время развития конечностей ^7,8,9.

Модель RL ценна для понимания свойств компонентов конечностей и взаимодействия между мезодермальными и эктодермальными клетками⁶. RL можно определить как конечноподобную структуру, созданную экспериментально собирающими или рекомбинирующими мезодермальными клетками почек конечностей внутри эктодермального покрова⁶. Морфогенез RL зависит от характеристик мезодермальных клеток (или других типов), которые будут реагировать на сигналы эктодермального паттерна. Одним из преимуществ этой экспериментальной системы является ее универсальность. Эта характеристика позволяет создавать множественные комбинации путем изменения источника мезодермальных клеток, таких как клетки с разных стадий развития, из разных положений вдоль конечности, или целые (недиссоциированные) или реагрегированные клетки 7,8,9,10. Другим примером является возможность получения эмбриональной эктодермы от видов, отличных от кур, например, черепахи¹¹, перепела или мыши¹².

В этом смысле метод RL помогает изучать развитие конечностей и взаимодействия между мезенхимальными и эктодермальными клетками конечностей с эволюционной точки зрения. Этот метод также имеет большой потенциал для анализа способности различных источников клеток-предшественников дифференцироваться в конечностную структуру, используя сигналы, предоставляемые эмбриональной эктодермой 12,13,14. В отличие от культур in vitro, RL позволяет оценивать дифференцировку и морфогенетический потенциал клеточной популяции путем интерпретации эмбриональных сигналов от развивающейся конечности ^9,15.

В этом протоколе приведено пошаговое руководство по выполнению успешной РЛ с реагрегированными клетками мезодермальных почек конечностей, что открывает возможность адаптации этого протокола с различными источниками реагрегированных клеток или даже различными источниками эктодермы.

Протокол

Это исследование было рассмотрено и одобрено Институциональным наблюдательным советом по уходу за лабораторными животными и их использованию Института биомедических исследований Национального автономного университета Мексики (УНАМ, Мехико, Мексика). Схематическая блок-схема общих шагов этого протокола показана на рисунке 1A.

1. Инкубация эмбрионов и определение жизнеспособности

1. Инкубировать оплодотворенные куриные яйца при 38 °C и относительной влажности 60% в течение примерно трех с половиной дней, пока они не достигнут стадии 22 HH (согласно Hamilton and Hamburger, 1951)¹⁶.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Свежеоплодотворенные куриные яйца можно хранить при температуре 15 °C до одной недели.
   1. Чтобы высиживать оплодотворенные яйца, поместите яйца вертикально заостренной стороной вниз в увлажненный инкубатор. Вращайте яйца во время инкубации, так как это необходимо, чтобы не допустить прилипания развивающегося эмбриона к мембране скорлупы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оплодотворенные куриные яйца можно получить на местных фермах. Оплодотворенные куриные яйца White Leghorn обычно используются, чтобы избежать пигментации перьев у поздних эмбрионов. Рассмотрите возможность инкубации достаточного количества яйцеклеток отдельно для получения трех структур: (1) мезодермальных клеток конечностей, (2) эктодермы конечностей и (3) донорские эмбрионы для пересадки RL.
2. После трех с половиной дней инкубации вынуть яйца из инкубатора, тампон с 70% этанолом и дать высохнуть на воздухе.
3. Определите развивающиеся эмбрионы, засахаривающие яйцеклетку, чтобы наблюдать за кровеносными сосудами и находить эмбрион. Выбросьте яйца, у которых нет эмбриона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе распределите яйцеклетки, чтобы получить мезодермальные клетки, эктодермы и хозяев для RL.

2. Получение мезодермальных клеток конечностей для заполнения эктодерм

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом манипуляций настоятельно рекомендуется продезинфицировать рабочую зону, микроскопы и все инструментальное путем смазывания 70% раствором этанола.

1. Постучите тупым концом яичной скорлупы концом тупыми щипцами, чтобы открыть окно и удалить около 1 см х 1 см скорлупы с помощью щипцов.
2. Переложите яйца в пластиковый или картонный держатель и поместите их по одному под стереомикроскоп. Определите воздушную мембрану, а затем удалите ее, выбрав небольшое отверстие, где не найдено сосудов. Потяните эту область с помощью тонких хирургических щипцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Воздушная мембрана может быть идентифицирована как белая и непрозрачная мембрана, наблюдаемая сразу после окна яйца.
   1. Удалите любой маленький кусочек яичной скорлупы, который может вступить в контакт с эмбрионом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что эмбрионы находятся на стадии 22 HH, прежде чем инициировать протокол. Эмбрионы на более ранних стадиях могут быть возвращены в инкубатор после запечатывания окна яичной скорлупы скотчем.
3. Полностью открыть амниотический мешок, разорвав амнион с помощью тонких хирургических щипцов (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Амнион можно идентифицировать как прозрачную мембрану, которая плотно покрывает эмбрион и заполнена амниотической жидкостью.
4. Осторожно извлеките эмбрион из яйцеклетки с помощью пары тупых щипцов, а затем перенесите в стерильную чашку Петри, содержащую ледяной фосфатно-буферный физиологический раствор (1x PBS). Повторите этот шаг для оставшихся яиц. Учтите, что только ~8-10 эмбрионов достаточно для получения мезодермальных клеток.
5. Вымойте эмбрионы один раз в ледяном 1x PBS и с помощью стереомикроскопа (см. Таблицу материалов) извлеките все оставшиеся мембраны. Найдите почки задних конечностей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Почки конечностей представляют собой округлые структуры, расположенные вдоль передне-задней оси эмбриона в виде выступов из бока. Задние конечности расположены более задними, чем передние конечности.
6. Поддерживайте эмбрионы в чистом 1x PBS и, используя пару тонких хирургических щипцов, срезайте каждую почку задней конечности продольно. Вырежьте бутон очень близко к боку эмбриона, чтобы рассекнуть все почки задних конечностей. Повторите этот шаг с оставшимися эмбрионами.
7. Используйте пластиковую переносную пипетку для переноса почек конечностей в пустую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
8. Используйте наконечник пипетки, чтобы удалить избыток 1x PBS и заменить PBS 500 мкл 0,5% раствора трипсина (см. Таблицу материалов). Высиживать почки конечностей в термоблоке в течение 7 мин при 37 °C.
9. Удалить раствор трипсина и заменить его 500 мкл коллагеназы IV типа при 2 мг/мл в растворе сбалансированной соли Хэнкса (см. Таблицу материалов), затем инкубировать его в термоблоке при 37 °C в течение 8 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация трипсина слегка отделяет эктодермы, в то время как коллагеназа дезагрегирует мезодермальные клетки.
10. После инкубации удалите как можно больше коллагеназы и замените ее 1 мл холодной среды Dulbecco's Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM-HG), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) для инактивации ферментов. Пипетку смеси аккуратно ~10 раз.
11. Фильтруйте суспензию, содержащую клетки, с помощью клеточного ситечка 70 мкм, чтобы оставить после себя эктодермы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтрация также удалит любые непереваренные почки конечностей, оставив после себя суспензию одиночных клеток.
12. После фильтрации пипеткой снова суспензию 5-10 раз и центрифугой при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, затем выбросьте надосадочное вещество.
13. Используйте 1 мл DMEM-HG с добавлением 10% FBS для промывания избытка коллагеназы. Центрифугировать суспензию при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
14. Осторожно выбрасывайте среду путем пипетирования, а затем замените ее 1 мл свежего DMEM-HG, дополненного 10% FBS, не нарушая клетки в нижней части трубки.
15. Дайте клеткам сформировать компактную гранулу (реагрегацию) после инкубации их в течение 1-1,5 ч при 37 °C в термоблоке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как мезодермальные клетки образуют гранулу, удобно получать эктодермы конечностей.

3. Получение эктодерм конечностей

1. Повторите шаги 1-6 из раздела 2 отдельно с другими 22 куриными эмбрионами HH, выбранными для получения эктодерм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество эмбрионов для этой цели пропорционально конечному количеству желаемого RL. Уместно соотношение эктодермы-РЛ 2:1.
2. После получения бутонов задних конечностей используйте пластиковую пипетку, чтобы перенести их в пустую микроцентрифужную трубку. Удалите избыток 1x PBS и замените его 500 мкл 0,5% трипсина в стерильном 1x PBS. Инкубировать смесь в течение 30 мин при 37 °C в термоблоке.
3. После ферментативного пищеварения перенесите раствор трипсина, содержащий почки конечностей, в стерильную чашку Петри.
4. Удалите избыток трипсина как можно больше с помощью микропипетки; залить чашку Петри ледяным 1x PBS, дополненным 10% FBS, пока все почки конечностей не будут покрыты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: FBS можно заменить конской сывороткой.
5. Идентификация почек конечностей под стереомикроскопом; идентифицировать эктодерму как слегка отделенную прозрачную мембрану от мезодермальных клеток конечности (рисунок 1B).
6. Удерживайте самый проксимальный конец бутона конечности с помощью тонких хирургических щипцов, при этом осторожно отделяйте и отделяйте слой эктодермы с помощью других щипцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Получение эктодерм может быть затруднено из-за слипания мезодермальных клеток и прикрепления к эктодермам, что приводит к тому, что они становятся липкими. Рекомендуется постоянно выбрасывать мезодермальные клетки, чтобы поддерживать в чашке Петри только эктодермы.
7. Поддерживают эктодермы в ледяном 1x PBS-10% растворе FBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эктодермы могут храниться при 4 °C в случае, если реагрегированная мезодерма не готова. Однако предпочтительно согласовывать время инкубации гранулы с эктодермальным получением.

4. Сборка мезодермальных клеток внутри эктодермальной оболочки

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого необходимо иметь пустые эктодермы в чашке Петри со стерильным 1x PBS-10% раствором FBS, содержащим сформированную гранулу мезодермальных клеток.

1. После того, как гранула сформирована (см. раздел 2), отбросьте ~600 мкл среды из трубы путем пипетки.
2. Аккуратно отсоедините гранулу от дна с помощью наконечника пипетки и не разбивая и не разрушая ее.
3. Когда гранула полностью отсоединится от нижней части трубки, переверните трубку вверх дном, чтобы перенести гранулу в чашку Петри, содержащую пустые эктодермы (рисунок 1C).
4. Вырежьте небольшой кусочек гранулы с помощью пары тонких хирургических щипцов и поместите его как можно ближе к эктодерме.
5. Как если бы это был мешок, откройте эктодерму хирургическими щипцами и поместите кусок гранулы как можно плотнее в эктодермальную оболочку. Повторите этот шаг для необходимого количества RL (рисунок 1D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разрежьте кусочки гранулы один за другим и заполните эктодермы для поддержания чистоты 1x PBS-10% раствором FBS. Размер гранулы должен соответствовать каждой эктодерме.
6. Дайте эктодерме и мезодерме зажить вместе в течение ~ 30 минут при комнатной температуре, а затем привите их хозяину эмбриона. Выбросьте неиспользованные эктодерму и мезодерму.

5. Трансплантация заполненной эктодермы эмбриону хозяина
 

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед пересадкой эктодермы расположите два стереомикроскопа рядом друг с другом на столешнице, один для манипуляций с эмбрионами и трансплантации RL. Другой предназначен для поддержания заполненных эктодерм, готовых к переносу в эмбрион.

1. Выберите количество желаемых яйцеклеток для пересадки заполненных эктодерм.
2. Используя конец тупых щипцов, постучите по яичной скорлупе эмбрионов хозяина 22 HH, чтобы открыть окно. Определите воздушную мембрану и, используя пару тонких хирургических щипцов, удалите ее полностью.
3. Откройте амниотический мешок возле передней конечности, чтобы обнажить правый фланг эмбриона. Открывайте только сумму, необходимую для выполнения процедуры.
4. Ориентируясь в положение передней конечности, выполняют раневое расчесывание вольфрамовой иглой (см. Таблицу материалов) длиной 2-3 сомита, слегка повреждая мезодерму до тех пор, пока она не кровоточит.
5. Индивидуально перенесите заполненную эктодерму (RL) в эмбрион цыпленка и поместите основание рекомбинантной конечности над раной сомита.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Передача RL может быть выполнена с помощью пластиковой пипетки или с помощью наклонного щелевого ножа.
6. Правильно закрепите RL двумя кусками палладиевой проволоки диаметром 0,025 мм и длиной 0,5-1 мм (см. Таблицу материалов). Выровняйте основание RL с раной, чтобы гарантировать, что она будет прикреплена к боку эмбриона хозяина и васкуляризирована (рисунок 1E).
7. Заклейте окно скотчем, и верните яйцо в инкубатор. Соберите эмбрионы в нужные моменты времени для анализа.

Результаты

Распознавание хорошо выполненной рекомбинантной конечности
После пересадки обработанные эмбрионы были возвращены в инкубатор, чтобы позволить RL развиваться. Время инкубации коррелировало с требованиями эксперимента. Тем не менее, RL можно легко отличить после 12 ч имплантации. Чтобы определить, была ли имплантация адекватной, RL наблюдали в виде выступа, который был надежно прикреплен к мезодермальной стенке донорского эмбриона (рисунок 2A). Напротив, независимо от того,...

Обсуждение

В целом, протокол RL можно разделить на пять этапов: (1) инкубация эмбриона, (2) получение мезодермальных клеток конечностей для заполнения эктодерм, (3) получение эктодерм, (4) сборка мезодермальных клеток внутри эктодермальных покровов и (5) трансплантация заполненных эктодерм в эмбрионы хозяина. Основным ограничением метода RL является длинный, подробный протокол, который имеет много критических моментов, требующих терпения для надлежащей работы. Для успешного завершения протокола необходимо определить критические мом...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Alcian Blue 8GX	Sigma	A5268
Угловой щелевой нож	Alcon	2.75mm DB
Тупые щипцы	Fine Science Tools	11052-10
Коллагеназа типа IV	Gibco	1704-019
DMEM-HG	Sigma	D5796
Инкубатор для яиц	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	16000069
Тонкие хирургические щипцы	Fine Science Tools	9115-10
Hanks Сбалансированный солевой раствор	Sigma	H6648
Микроцентрифуга	Eppendorf	5417R
Micropipet	NA	NA
Палладиевая проволока	GoodFellow	7440 05-3
Чашка Петри	Гнездо	705001
Pippette	crmglobe	PF1016
Стереомикроскоп	Zeiss	Stemi DV4
Tape		NA
Trypsin porcine	Merck	9002 07-7
Вольфрамовая игла	GoodFellow	E74-15096/01