Методическая статья

Надежная платформа discovery для идентификации новых медиаторов метастазирования меланомы

DOI:

10.3791/63186

⸱

8 марта 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, NYU Grossman School of Medicine, 2Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group, Perlmutter Cancer Center, 3Department of Radiology, NYU Grossman School of Medicine, 4Preclinical Imaging Core, NYU Grossman School of Medicine, 5Ronald Perelman Department of Dermatology, NYU Grossman School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается рабочий процесс методов, используемых для тестирования новых потенциальных медиаторов метастазирования меланомы и их механизма (механизмов) действия.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метастазирование является сложным процессом, требующим от клеток преодоления барьеров, которые только неполностью моделируются анализами in vitro . Систематический рабочий процесс был создан с использованием надежных, воспроизводимых моделей in vivo и стандартизированных методов для выявления новых игроков в метастазировании меланомы. Этот подход позволяет выводить данные на конкретных экспериментальных этапах, чтобы точно охарактеризовать роль гена в метастазировании. Модели устанавливаются путем введения генетически модифицированных клеток меланомы с помощью внутрисердечных, внутрикожных или подкожных инъекций мышам с последующим мониторингом с последовательной визуализацией in vivo . Как только предварительно установленные конечные точки достигнуты, первичные опухоли и / или органы, несущие метастазы, извлекаются и обрабатываются для различных анализов. Опухолевые клетки могут быть отсортированы и подвергнуты любой из нескольких платформ «омики», включая секвенирование одноклеточной РНК. Органы проходят визуализацию и иммуногистопатологический анализ для количественной оценки общего бремени метастазов и картирования их конкретного анатомического местоположения. Этот оптимизированный конвейер, включая стандартизированные протоколы для приживления, мониторинга, сбора, обработки и анализа тканей, может быть принят для полученных от пациента краткосрочных культур и установленных линий клеток человека и мышей различных типов рака.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высокая смертность, связанная с метастатической меланомой, в сочетании с ростом заболеваемости меланомой во всем мире1 (по оценкам, увеличение на 7,86% к 2025 году) требует новых подходов к лечению. Достижения в обнаружении целей зависят от воспроизводимых моделей метастазирования, очень сложного процесса. На протяжении всех этапов метастатического каскада клетки меланомы должны преодолевать бесчисленные барьеры для достижения уклонения иммунной системы и колонизации отдаленных тканей2. Устойчивость и адаптивность клеток меланомы возникают из множества факторов, включая их высокую генетическую мутационную нагрузку3 и их происхождение нервного гребня, которые придают решающую фенотипическую пластичность 3,4,5. На каждом этапе транскрипционные программы позволяют метастазирующим клеткам меланомы переключаться из одного состояния в другое на основе сигналов перекрестных помех с микросредой, включающей иммунную систему6, внеклеточную среду 7,8 и клеточную архитектуру физических барьеров9, с которыми они вступают в контакт. Например, клетки меланомы избегают иммунного надзора, снижая экспрессию важных иммунопраймирующих опухолевых факторов6.

Исследования описывают «преметастатическую нишу», в которой клетки меланомы секретируют хемокины и цитокины, чтобы подготовить отдаленный «целевой» орган для метастазирования10. Эти результаты поднимают важные вопросы о тропизме органов клеток метастатической меланомы и анатомическом пути, который они проходят для доступа к отдаленным тканям. Известно, что после интравазации клетки меланомы метастазируют через лимфатические (лимфатическое распространение) и кровеносные сосуды (гематогенное распространение)2,11. В то время как у большинства пациентов присутствует локализованное заболевание, небольшое подмножество случаев представляет собой отдаленное метастатическое заболевание и отсутствие лимфатической диссеминации (отрицательное вовлечение лимфатических узлов)11, что предполагает существование альтернативных метастатических путей для меланомы.

Когда они колонизируют метастатический участок, клетки меланомы подвергаются эпигенетической и метаболической адаптации12,13. Для доступа и вторжения в новые компартменты клетки меланомы используют протеазы14 и цитоскелетные модификации 11,15, которые позволяют им перемещаться и расти в новом месте. Трудность нацеливания на клетки меланомы заключается в сложности и количестве таких адаптаций; таким образом, на местах следует приложить усилия для экспериментального воссоздания как можно большего числа шагов и адаптаций. Несмотря на многочисленные достижения в анализах in vitro, таких как органоиды и 3D-культуры16,17, эти модели лишь неполностью повторяют метастатический каскад in vivo.

Мышиные модели показали ценность, установив баланс между воспроизводимостью, технической осуществимостью и моделированием заболеваний человека. Внутрисосудистые, ортотопически и гетеротопически имплантированные клетки меланомы из полученных пациентом ксенотрансплантатов или краткосрочных культур в иммуноскомпрометированных или гуманизированных мышах представляют собой основу обнаружения мишеней при метастатической меланоме. Тем не менее, этим системам часто не хватает важнейшего биологического ограничения на метастазирование: иммунной системы. Модели метастазирования сингенной меланомы, которые обладают этим ограничением, относительно редки в этой области. Эти системы, разработанные у иммунокомпетентных мышей, включая B16-F1018, семейство клеточных линийYUMM 19, SM120, D4M321, RIM322 или совсем недавно, клеточные линии меланомы RMS23 и M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 , облегчают исследование сложной роли иммунного ответа хозяина в прогрессировании меланомы.

Здесь представлен конвейер для идентификации цели метастазирования меланомы. С увеличением и увеличением наборов данных «омики», генерируемых из когорт пациентов с меланомой, мы постулируем, что исследования, имеющие наибольшую клиническую перспективу, связаны с интеграцией больших данных, что приводит к тщательному функциональному и механистическому опросу 25,26,27,28. Используя мышиные модели для изучения потенциальных целей в метастатическом процессе, можно учитывать in vivo-специфические события и тканевые взаимодействия, тем самым увеличивая вероятность клинической трансляции. Изложены многочисленные методы количественной оценки метастатической нагрузки, предоставляющие дополнительные данные о результатах любого данного эксперимента. Описан протокол выделения одной клетки из опухолей в различных органах, чтобы помочь объективной характеристике экспрессии генов в метастатических клетках, которые могут предшествовать одноклеточному или объемному секвенированию РНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры для животных, включенные в следующий протокол, были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Нью-Йоркского университета (IACUC). Все процедуры проводятся в учреждениях, одобренных Ассоциацией по оценке и аккредитации Международной ассоциации по уходу за лабораторными животными (AAALAC). На рисунке 1 показан общий экспериментальный подход.

1. Краткосрочные культуры меланомы, полученные от пациента (СНТ)

  1. Поместите ткань в чашку Петри толщиной 60 мм с 1 мл полного RPMI (RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 1x MEM раствора заменимых аминокислот и пенициллина (100 МЕ/мл)/стрептомицина (100 мкг/мл)).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для увеличения соотношения опухолевых клеток при необходимости рассекают и удаляют ткани, окружающие опухоль, в чашке Петри, под микроскопом, используя стерильные хирургические инструменты.
  2. Мелко нарежьте свежую ткань стерилизованными бритвенными лезвиями на кубики по 1-2 мм. Добавьте 4 мл полного RPMI и пипетку к содержимому пластины вверх и вниз 5-10 раз с помощью серологической пипетки объемом 10 мл.
  3. Переложите клеточную суспензию в коническую трубку 15 мл полипропилена и раскрутите ячейки вниз (180 × г в течение 5 мин при 4 °C). Аспирируйте супернатант, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл свежей среды и перенесите суспензию в колбу для культуры тканей размером25 см2 .
  4. Чтобы помочь фрагментам ткани прикрепиться к дну, установите колбу с наклоном под углом 20°-30° в инкубаторе культуры тканей при 37 °C, 5% CO2 в течение 20 мин.
  5. Положите колбу плоско, чтобы среда могла покрыть ткань, и ежедневно проверяйте состояние культуры. Расщепляйте клетки, когда они достигают 90-100% слияния. Поддерживайте краткосрочные культуры на «низком» количестве проходов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: STC будут установлены примерно через 2 месяца после изоляции клеток и культивирования, хотя фактическая временная шкала варьируется между образцами и типами опухолей. После 10-14 проходов клеточные линии достигают 100% чистоты, содержащие только клетки меланомы29. Порог числа проходов эмпирически определяется путем наблюдения за изменениями в морфологии клеток, времени удвоения и поведении in vivo. Чтобы сохранить неоднородность и другие характеристики родительской опухоли, не раскалывайте клетки более 1:5.
  6. После создания STC и с любой моделью клеточной линии, которая будет введена животным, как описано на последующих этапах, трансдукция клеток с помощью репортера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентная метка (например, красный флуоресцентный белок (RFP), зеленый флуоресцентный белок (GFP)), например, позволяет проводить иммунофлуоресцентную визуализацию ex-vivo и сортировку опухолевых клеток путем флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS). Люцифераза позволяет проводить биолюминесцентную визуализацию in vivo , полезный инструмент для мониторинга экспериментального прогрессирования (раздел 4).

figure-protocol-1
Рисунок 1: Схема, иллюстрирующая описанный рабочий процесс, от интеграции данных пациента до генерации и анализа данных in vivo от мышей. Сокращения: LOF = потеря функции; GOF = усиление функции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Имплантация ксенотрансплантата

ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальные процедуры, описанные здесь, проводятся на мышах с нарушениями адаптивной и врожденной иммунной системы, NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) мышах; или у мышей, у которых отсутствует только адаптивный иммунитет, например, у мышей с дефицитом Т-клеток с дефицитом атимической /обнаженной (NU/J). Животные мужского пола, в возрасте от 8 до 10 недель. Женщины часто демонстрируют высокую частоту гонадных метастазов при внутрисердечном введении опухолевых клеток, что снижает их выживаемость.

  1. Для подкожных и внутрикожных инъекций приготовьте клеточную суспензию 1:1, смешивая одну часть клеток, взвешенных в 1x фосфатно-буферном физиологическом растворе Dulbecco (DPBS) с одной частью размороженного внеклеточного матричного субстрата (EMS), и держите на льду при 4 °C. Для внутрисосудистых (внутрисердечных, внутрикаротидных, ретроорбитальных, хвостовых или селезеночных) инъекций приостанавливайте клетки только в DPBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующий объем для внутрикожных инъекций должен быть как можно ниже (30 мкл). Для подкожных инъекций вводимый объем может доходить до 150 мкл, а для внутрисосудистых инъекций – до 250 мкл (исходя из веса животного). Добавьте к конечной клеточной суспензии 10-30% дополнительного объема инъекции, исходя из количества введенного и шприца, используемого для учета мертвого объема внутри скользящего наконечника и иглы (например, туберкулиновый шприц объемом 1 мл с иглой 30 г, 25 мм имеет мертвый объем 100 мкл).
  2. Проведите пилотную кампанию, чтобы охарактеризовать поведение используемых клеточных линий и временную шкалу прогрессирования опухоли in vivo. Для внутрикожных инъекций начните с инъекции от 1000 до 50000 клеток / 30 мкл. Для подкожных инъекций начните с инъекции от 10 000 до 2 × 106 клеток / 150 мкл. Для внутрисосудистых (внутрисердечных, внутрикаротидных, ретроорбитальных и селезеночных) инъекций начните с инъекции 50 000 клеток / 150 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внутрисосудистые инъекции предрасполагают животных к эмболическим событиям, либо путем введения воздуха в кровеносную систему, либо путем использования чрезмерного количества клеток, которые закупоривают мелкие сосуды. Хорошо перемешайте клеточную суспензию, чтобы избежать слипания. Загрунтуйте шприц перед загрузкой клеточной суспензии. Удалите пузырьки воздуха внутри шприца. Держите клеточную суспензию/шприцы на льду до загрузки и времени впрыска.
  3. Вводят анестезию ингаляционным путем. Установите регулятор уровня кислорода между 1-2 л/мин. Поместите животное в индукционную камеру с испарителем изофлурана, установленным на 2,5-5% для индукции и 1,5-3% для обслуживания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за дыханием и частотой сердечных сокращений животного во время фазы индукции анестезии. Не оставляйте животное без присмотра. Не контролируйте более одного животного одновременно. Титруйте количество анестезии к весу животного.
  4. Переместите животное из индукционной камеры в носовой конус. Нанесите стерильную вазелиновую офтальмологическую мазь на глаза животного, чтобы предотвратить сухость роговицы во время процедуры.
  5. Сбрить место процедуры прямым лезвием бритвы, наклоненным под углом 30°. Очистите кожу процедурной зоны 70% мазками изопропилового спирта. Перед любыми дальнейшими шагами оцените достаточный уровень анестезии с помощью педального рефлекса.
  6. Для внутрикожных инъекций выполните всю процедуру внутри кабинета биобезопасности для поддержания асептических условий.
    1. Обезболить и побрить животное, как описано в шагах 2.3-2.5.
    2. Схватите и втягивайте кожу назад против траектории удара иглой. Используя иглу инсулинового шприца 31 г длиной 6 мм, удерживаемую под острым углом, аккуратно проколоть кожу скосом, обращенным вверх.
    3. Почувствуйте сброс давления на кончике иглы. Осторожно заранее, чтобы оставаться внутри внутрикожного отсека и не проходить через всю глубину кожи в подкожную клетчатку. Решающее значение: Если кто-то проскальзывает в подкожное пространство, извлеките иглу, измените область инъекции и снова вставьте иглу. Медленно вводите весь объем (30 мкл) клеточной суспензии до тех пор, пока не будет наблюдаться куполообразная ворсинка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Низкие объемы инъекций будут вызывать меньшее рассечение слоев кожи и меньше архитектурных искажений.
    4. Держите иглу внутри и считайте до 5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ЭМС становится вязкой при температуре тела, помогая избежать обратного потока через рану прокола иглы.
    5. Снимите иглу и поместите животное в клетку на теплую подушечку для восстановления. Вернуть животное в клетку вивария после восстановления сознания, при грудиневых и амбулаторных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Непрерывное наблюдение за животным во время всех процедур, описанных в настоящем протоколе. Не оставляйте животное без присмотра и не контролируйте более одного животного одновременно.
    6. Контролировать прогрессирование роста опухоли, потерю веса и общее состояние здоровья совместно с ветеринарным персоналом ежедневно в начальной фазе роста и более интенсивно, при необходимости, после того, как животные начинают терять вес. Во время этих сеансов мониторинга: взвесьте животных и постройте диаграмму для мониторинга потери веса, а также проверьте наличие признаков опухолевого изъязвления, неврологических, локомоторных и / или поведенческих признаков (вялость, отсутствие ухода, низкое потребление пищи или воды).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Усыпляйте животных сразу после наблюдения признаков прогрессирующего заболевания (более 20% потери веса, оценка состояния тела <2, чрезвычайно сниженный уровень активности, паралич или судороги). Используйте метод эвтаназии, одобренный IACUC учреждения (например, автоматизированная настольная камера CO2 используется для воздействия на животных CO2 в течение 15 минут с последующим вторичным методом эвтаназии, либо вывих шейки матки, обезглавливание или пневмоторакс, вызванный двусторонне разрезанием грудной клетки).
    7. Проведите измерения с помощью суппортов и используйте размеры длины (L) и ширины (W) опухоли для расчета объема (V) по формуле:
      figure-protocol-2
  7. Для подкожных инъекций:
    1. Выполните всю процедуру внутри кабинета биобезопасности для поддержания асептических условий26,27.
    2. Обезболить и побрить животное, как описано в шагах 2.3-2.5.
    3. Используя иглу инсулинового шприца от 28 г до 31 г, длиной 6 мм, удерживаемую под острым углом, аккуратно проколите кожу скосом вверх. Почувствуйте высвобождение давления на кончике иглы дважды , проходя через эпидермис, дерму и гиподерму.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Второй раз, когда на кончике иглы ощущается сброс давления, указывает на то, что подкожный отсек был достигнут.
    4. Медленно вводят весь объем (30-150 мкл) клеточной суспензии до тех пор, пока не будет наблюдаться удлиненная эллипсообразная волдырь. Держите иглу внутри и считайте до 5. Считайте до 10 для больших объемов (более 50 мкл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: ЭМС становится вязкой при температуре тела, помогая избежать обратного потока через рану прокола иглы.
    5. Снимите иглу и поместите животное в клетку на теплую подушечку для восстановления. Верните животное в клетку вивария после восстановления сознания, когда оно стернальное и амбулаторное.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время постпроцедурного мониторинга наблюдайте за любыми признаками осложнений (низкая частота дыхания, кровотечение, медленное восстановление) и устраняйте их соответствующим образом. Если улучшения не наблюдается, приступают к гуманным процедурам эвтаназии, описанным в ПРИМЕЧАНИИ к шагу 2.6.6.
    6. Следите за ростом опухоли, потерей веса и общим состоянием здоровья животного, как описано в шагах 2.6.6-2.6.7.
  8. Для внутрисердечных инъекций:
    1. Выполните всю процедуру внутри кабинета биобезопасности для поддержания асептических условий26,30.
    2. Обезболить животное, как описано в шагах 2.3-2.4.
    3. Перенесите животное на нагретую платформу ультразвукового аппарата и закрепите его гипоаллергенной лентой на носовом конусе.
    4. Побрить грудную клетку прямым лезвием бритвы, наклоненным под углом 30°. Очистите кожу процедурной зоны 3 аппликациями 10% повидон-йода, чередуя с 3 аппликациями изопропилового спирта.
    5. Перед любыми дальнейшими шагами оцените достаточный уровень анестезии с помощью педального рефлекса. Нанесите ультразвуковой гель на место процедуры.
    6. Захватите сердечное окно с помощью ультразвукового зонда. Расположите ультразвуковой зонд в середине грудной клетки с левой стороны животного, чтобы захватить горизонтальное окно, ориентированное на получение поперечного сечения (короткой оси) левого желудочка. Убедившись, что длинная ось зонда обращена вверх, зафиксируйте зонд под углом 50°, а нагретую платформу под углом 20°. Зафиксируйте зонд и опорную раму в нужном положении.
    7. Выведите клеточную суспензию во время работы внутри шкафа биобезопасности в туберкулиновом шприце объемом 1 мл с иглой 30 Г, 25 мм. Удалите пузырьки воздуха в шприце.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно создавать и поддерживать одноклеточную суспензию во время обработки и введения клеток. Удаление пузырьков воздуха является важным шагом, чтобы избежать воздушной эмболии. Хорошо подготовленная система шприц-игла предотвратит предотвратимые смерти в экспериментальной группе. Всегда втягивайте в шприц больше объема, чем будет введено. Дополнительный объем поможет удалить воздух, впрыскивая часть клеточной суспензии обратно в трубку объемом 1,5 мл.
    8. Зафиксируйте шприц в стереотаксическом инжекторе. Под ультразвуковым контролем продвиньте иглу через грудную стенку в левый желудочек сердца. Медленно вводят весь объем (100-250 мкл) клеточной суспензии.
    9. Снимите иглу и поместите животное в клетку на теплую подушечку для восстановления. Верните животное в клетку вивария после восстановления сознания, когда оно стернальное и амбулаторное. Мониторинг животного на предмет роста опухоли, потери веса и общего состояния здоровья, как описано в шаге 2.6.6.
  9. Для внутрикаротидных инъекций:
    1. Выполните всю процедуру на правильно продезинфицированной поверхности, чтобы помочь поддерживать асептические условия30.
    2. Обезболить животное коктейлем кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) путем внутрибрюшинной инъекции с помощью инсулинового шприца, иглы 28 г. Нанесите стерильную вазелиновую офтальмологическую мазь на глаза животного, чтобы предотвратить сухость роговицы во время процедуры.
    3. Сбрите область процедуры прямым лезвием бритвы, наклоненным под углом 30°. Перед любыми дальнейшими шагами оцените достаточный уровень анестезии с помощью педального рефлекса.
    4. Поместите животное под стереомикроскоп на согревающую прокладку. Очистите кожу процедурной зоны 3 аппликациями 10% повидон-йода, чередуя с 3 аппликациями изопропилового спирта.
    5. Наденьте стерильные средства индивидуальной защиты (СИЗ) и стерильные перчатки. Подготовьте стерильное поле, положив стерильную драпировку на тело животного.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если стерильная драпировка не имеет отверстия, соответствующего размеру и расположению разреза, сложите драпировку пополам и используйте ножницы Метценбаума, чтобы вырезать отверстие соответствующего размера в середине стерильной драпировки.
    6. Используйте скальпель или ножницы ириса, чтобы разрезать кожу от половины шеи до грудины. С помощью двух микрохирургических щипцов тупо рассекают на части 2 подчелюстные слюнные железы в плоскости средней линии. При необходимости используйте электрическое прижигание при гемостазе.
    7. Рассекните фасцию, окружающую общую сонную артерию (CCA) от манубрия к бифуркации и продолжайте медиально, чтобы освободить заднюю стенку наружной сонной артерии. Временно обрежьте наружную сонную артерию (ЭКА) перед инъекцией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При рассечении по окружности ОАС необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить блуждающий нерв (лежит латерально к артерии).
    8. Загрузите ячейку суспензии в шприц объемом 1 мл с иглой 33 Г, 15 мм.
    9. Пройдите две лигатуры 7-0 под CCA и выполните свободный инструментальный узел для каждой из двух лигатур. Используйте зажим для сосуда под давлением 5 мм, 10 G и временно обрежьте ECA. Завязывайте проксимальную лигатуру; затем свяжите дистальную лигатуру свободно (рядом с бифуркацией CCA). Используйте дистальную петлю позже, чтобы контролировать кровотечение после инъекции.
    10. Используя шприц с иглой 33 G, 15 мм, аккуратно проколите CCA скосом иглы, обращенным вверх и под острым углом. Вводят весь объем (50-150 мкл) клеточной суспензии медленно.
    11. Захватите дистальную петлю щипцами и поднимите ее, снимая иглу, чтобы закупорить просвет CCA и остановить кровотечение. Замените шприц щипцами ювелиров #7 и завяжите дистальную петлю.
    12. Бросьте еще один инструментальный узел на дистальную лигатуру и снимите зажим сосуда с ЭКА. Контролируйте хирургическое поле на предмет кровотечения и прижигайте любые кровоточащие сосуды перед закрытием. Используйте сшивающее устройство 9 мм, чтобы закрыть кожу животного и поместить животное на теплую подушку для восстановления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите скобы через 7-10 дней после операции.
    13. Вводят обезболивающий препарат подкожно - бупренорфин (0,3 мг/мл) каждые 12 ч в течение 72 ч после операции в концентрации 0,1 мг/кг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, рассмотрите возможность использования анальгетического препарата с пролонгированным высвобождением, который требует 1 дозы каждые 72 ч.
    14. Верните животное в клетку вивария после восстановления сознания, когда оно стернальное и амбулаторное. Ежедневно контролируйте животных после операции на наличие признаков инфекции или боли в месте операции, общего состояния здоровья и осложнений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Животные, которые плохо восстанавливаются после операции по выживанию, могут получить дополнительные дозы обезболивающих препаратов и будут усыплены гуманно, если не полностью выздоровеют к 72 часам после операции.
    15. Мониторинг животного на предмет роста опухоли, потери веса и общего состояния здоровья, как описано в шаге 2.6.6.
  10. Для ретроорбитальных инъекций:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте эту технику в качестве альтернативы инъекциям хвостовой вены, когда оператор обучен и опытен в этой технике и когда есть сильное научное обоснование. Клеточные суспензии, доставляемые по этому маршруту, могут индуцировать рост опухоли в ретроорбитальном пространстве; следовательно, следует тщательно учитывать риски и преимущества при выборе этой техники. Например, чтобы воспользоваться прямой кровеносной связью ретроорбитального венозного синуса с внутримозговыми венами через анастомозы, выберите этот метод, когда образование опухоли головного мозга не удалось с помощью других инъекционных путей.
    1. Выполните всю процедуру внутри кабинета биобезопасности для поддержания асептических условий. Наденьте стерильные СИЗ и перчатки.
    2. Обезболить животное, как описано в шагах 2.3-2.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой процедуры не наносите стерильную вазелиновую офтальмологическую мазь на глаза животного, потому что это будет препятствовать инъекции; применять только местные обезболивающие капли.
    3. Нагрузите клеточную суспензию в инсулиновый шприц иглой 28-31 г, 6 мм.
    4. Когда животное находится в положении лежа, втягивайте веки до тех пор, пока глаз не выступит. Нанесите 1 каплю местного анестетика в глаз на стороне, проходящей процедуру.
    5. Вставьте иглу под углом 30-45° между глазом и медиальным эпикантусом со скосом, обращенным вниз. Вводят клеточную суспензию (10-150 мкл) медленно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более медленные движения предотвращают повреждение глаза и обратного потока инъекции.
    6. Выполните действия, описанные в разделах 2.7.5-2.7.6.
  11. Для инъекций селезенки:
    1. Выполняют всю процедуру внутри кабинета биобезопасности для поддержания асептических условий31. Наденьте стерильные СИЗ и стерильные перчатки.
    2. Обезболить и побрить животное, как описано в шагах 2.3-2.5.
    3. Поместите животное в правое боковое лежачее положение. Очистите кожу области процедуры с помощью 3 применений 10% повидона-йода, чередуя с 3 применениями изопропилового спирта, и подготовьте хирургическое поле, как описано на этапе 2.9.5.
    4. С помощью ножниц Метценбаума или скальпеля сделайте разрез 1 см в левом боку брюшной стенки с последующим разрезом в брюшине.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Селезенка будет видна через полупрозрачную брюшную стенку после того, как будет сделан разрез кожи. Выполните разрез брюшины именно в этом месте.
    5. Обнажите селезенку и селезенку через разрез. Используя иглу инсулинового шприца 28-31 г длиной 6 мм, аккуратно проколоть селезенку скосом иглы лицом вверх и под острым углом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если колотая рана кровоточит, прижигайте участок, чтобы ограничить кровотечение и обратный поток.
    6. Медленно вводят весь объем (50-100 мкл) клеточной суспензии. Извлеките иглу. Поместите на селезенку небольшую марлю и надавите щипцами. Слегка зажмите селезенку между марлей мелкими москитными щипцами и подождите 15 минут.
    7. Выполнить спленэктомию, связав селезеночную мышцу шелковым швом 3-0 или 4-0, при необходимости прижигая сосуды. Закройте брюшину 5-0 полидиоксаноном (PDS) или рассасывающимся швом полигликолевой кислоты.
    8. Выполните действия, описанные в шагах 2.7.5-2.7.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Животные, у которых присутствуют осложнения кровотечения или которые не полностью выздоровели через 72 часа после операции, должны быть гуманно усыплены. Помните, что благополучие мышей всегда является приоритетом.

3. Постановочная операция по выживанию (SSS)

  1. Основываясь на экспериментальных выводах из шага 2.2, определите правильное время до операции по выживанию. В зависимости от клеточной линии и экспериментальной гипотезы выбирают более раннюю временную точку для резекции опухоли (при объеме опухоли = 150 мм3) или более позднюю точку времени (при объеме опухоли = 500 мм3)26.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предел объема опухоли составляет 1 500мм3 , когда опухолевая нагрузка достаточно высока, чтобы нанести ущерб благополучию животного и предрасполагать к осложнениям.
  2. Обезболить и побрить животное, как описано в шагах 2.3-2.5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура проводится внутри кабинета биобезопасности.
  3. Очистите кожу области процедуры с помощью 3 применений 10% повидона-йода, чередуя с 3 применениями изопропилового спирта, и подготовьте хирургическое поле, как описано на этапе 2.9.5.
  4. С помощью ирисовых ножниц или скальпеля разрезают кожу, поддерживая 5-7 мм резекционный край от края опухоли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запас для резекции зависит от способности опухоли распространяться локально. Для агрессивных опухолей увеличьте запас резекции, убедившись, что осталось достаточно кожи для выполнения закрытия раны.
  5. В случае внутрикожных опухолей резецируют опухоль вместе с окружной кожей.
  6. При подкожных опухолях рассекают и удаляют опухоль под кожей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если опухоль вторгается в брюшину и/или кожу, резецируйте ее в блоке с опухолью и закройте брюшину 5-0/4-0 PDS или рассасывающимися швами полигликолевой кислоты.
  7. Закройте рану с помощью сшивающего устройства диаметром 9 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите скобы через 7-10 дней после операции. Введите обезболивающее лекарство и поместите животное на теплую подушечку, чтобы восстановиться. Продолжайте введение анальгетического препарата в течение 72 ч после операции, один раз в 12 ч в соответствии с шагом 2.9.13. Животные с осложнениями кровотечения или которые не пришли в полное сознание после операции, должны быть гуманно усыплены.
  8. Размещайте животное в клетке, на теплой подушке для восстановления. Вернуть животное в клетку вивария после восстановления сознания, при грудиневых и амбулаторных.
  9. Продолжайте следить за животным после операции на предмет местных рецидивов, потери веса, неврологических, локомоторных и / или поведенческих признаков (летаргия, отсутствие ухода, низкое потребление пищи или воды) и общего состояния здоровья.

4. Визуализация in vivo (рисунок 2A)

  1. Вводят субстрат D-люциферина (150 мг/кг) животным путем внутрибрюшинной инъекции с помощью инсулинового шприца 1 мл, иглы 28 г.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Опухолевые клетки должны быть стабильно трансдуцированы люциферазой кДНК.
  2. Индуцировать анестезию, как описано на этапах 2,3-2,4, через 6 мин после инъекции субстрата D-люциферина.
  3. Выполнение визуализации с помощью сканера биолюминесцентной визуализации (BLI) (система визуализации in vivo )26.
  4. Переместите животное внутрь камеры визуализации и в носовой конус. Изображение до 5 животных одновременно, в зависимости от мощности системы визуализации.
  5. Запустите инструмент, нажав кнопку инициализировать. Установите для параметра время экспозиции значение auto (1-120 с).
  6. Захватите пустое изображение, чтобы при необходимости вычесть любой фон. Нажмите кнопку «Получить » и сохраните изображение после завершения последовательности получения.
  7. Поместите животное обратно в клетку, которая сидит с 50% площади базовой поверхности над согревающей прокладкой, чтобы восстановиться после анестезии. Вернуть животное в клетку вивария после восстановления сознания, при грудиневых и амбулаторных.
  8. Для анализа данных в том же программном обеспечении для визуализации in vivo , с помощью которого были сделаны изображения, перейдите в папку, где сохранены изображения, и откройте изображения всех мышей, относящихся к эксперименту, сразу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ одного изображения за раз не позволит нормализовать его по группам.
  9. Установите для устройств значение сияния (не учитывается). Убедитесь, что флажок, указывающий на человека , снят, так как это предотвратит нормализацию сигнала между группами.
  10. С помощью инструмента рисования «Область интереса» (ROI) нарисуйте круговые ROI для области мозга и прямоугольные ROI для тела. Будьте осторожны, чтобы исключить уши и нос из ROI мозга, так как они имеют тенденцию излучать неспецифическое свечение. Чтобы свести к минимуму смещение в этом процессе, рисуйте ROI только на фотографиях мышей без наложения люминесцентного сигнала.
  11. Выберите Измерить рентабельность инвестиций , чтобы количественно оценить сигнал и экспортировать данные в электронную таблицу. Анализ различий между группами путем построения графика общего люминесцентного потока (п/с/см2/ср) в интересующих областях тела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы оценить различия между группами в тропизме мозга, рассчитать соотношение между сигналом мозга и сигналом тела для каждой мыши. Это контролирует межвизменные вариации общей опухолевой нагрузки и различия в уровнях экспрессии люциферазы между экспериментальными группами.

5. Магнитно-резонансная томография Ex vivo

  1. Выполняют МРТ ex vivo сразу после эвтаназии. В качестве альтернативы, извлеките органы, представляющие интерес, зафиксируйте их в формалине на срок до 72 ч и выполните визуализацию в более поздней точке времени.
  2. Получайте изображения с помощью системы микро-МРТ 7-Tesla (7-T) (300 МГц), оснащенной консолью ЯМР и магнитом с горизонтальным отверстием с нулевым кипением или аналогичным оборудованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимость в активно экранированной вставке градиентной катушки с правильным компромиссом производительности имеет решающее значение. Он должен обеспечивать градиентную линейность не менее 50 мм динамического сферического объема (DSV), чтобы охватить набор образцов, исследуемых одновременно без геометрических искажений. Сочетание градиентной прочности (от 440 до 750 мТл/м) и рабочего цикла, обеспечивающего максимальные одновременные токи постоянного тока в диапазоне от 3 x 30 А до 3 x 87 А, обеспечит адекватную производительность изображения. Используемая вставка градиентной катушки (см. Таблицу материалов) обеспечивает следующие характеристики: 660 мТл/м, время нарастания 130 мкс, 3 x 87 А и DSV = 80 мм.
  3. Выполняйте сканирование с помощью коммерческой передающей-приемной циркулярно поляризованной радиочастотной катушки всего тела мыши (OD = 59 мм, ID = 38 мм, L = 40 мм), настроенной на 300,16 МГц, частоту протонаЛармора 1 H.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот радиочастотный зонд позволяет получать наборы 3D-данных с субмиллиметрическим изотропным разрешением (<150 мкм) во время ночных сканирований продолжительностью 8-12 ч.
  4. Обнаруживают опухолевую нагрузку с помощью нескольких последовательностей30.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гиперинтенсивный сигнал, обнаруженный С помощьюT2-взвешенной, быстрой визуализации с перефокусированным эхо (RARE) последовательностью распознает отек, окружающий опухоли.
  5. Выполните последовательность 3D RARE со следующими параметрами захвата: [120 мкм]3 изотропное разрешение; время захвата 5 ч, 27 мин; время повторения (TR) = 500 мс; эхо-интервал (ES) = 12,7 мин; Турбо фактор TFx = 12; эффективное время эха (TEeff) = 76,2 мс; полоса пропускания (BW) = 75 кГц; Размер матрицы = 2843; поле зрения (FOV) = [4,0 мм]3; количество средних значений (Nav) = 6.
  6. Обнаружить метастазы по следующим параметрам.
    1. Для пигментированных метастазов с осветлением сигнала используют взвешеннуюT1 3D градиентную эхо-последовательность со следующими параметрами: [120 мкм]3 изотропное разрешение; время захвата 2 ч, 41 мин; TR = 20 мс; время эха (TE) = 4,0 мс; угол переворачивания (FA) = 18°; BW = 75 кГц; Размер матрицы = 2843; FOV = [34,0 мм]3; Навигатор = 6.
    2. Для непигментированных и/или геморрагических метастазов используют гипоинтензионный сигнал при приобретении подТ2*-взвешенной, многоградиентной эхо (МГЭ) последовательностью (3D MGE, изотропное разрешение [120 мкм]3 ; время захвата 3 ч, 35 мин; TR = 40 мс; TE = 3,6 мс; ES = 3,2 мс; 4 эха; ФА = 20°; BW = 100 кГц; Размер матрицы = 2843; FOV = (34,0 мм)3; Навигатор = 4.
  7. Используйте все 3 последовательности для количественной оценки опухолевой нагрузки.
  8. Перекрестная ссылка на области опухоли, выявленные в ходе анализа, с гистологическими срезами для обеспечения точности. разделы 7 и 8.

6. Обработка тканей для одноклеточного или объемного секвенирования РНК

  1. Усыплите животное, используя любой метод, одобренный IACUC учреждения. См. одну из процедур, описанных в ПРИМЕЧАНИИ к шагу 2.6.6.
  2. Рассекните интересующие органы и поместите их в отдельные колодцы пластины, содержащей сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) на льду. Работайте быстро и держите ткань на льду в любое время, чтобы максимизировать жизнеспособность клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги специфичны для обработки мозга. Отрегулируйте тип коллагеназы к конкретной ткани, исходя из ваших потребностей.
  3. Подготовьте 6-луночную плиту с 3 мл HBSS в каждой лунке.
  4. Чтобы визуализировать и дополнительно помочь направить рассечение, используйте флуоресцентный микроскоп и идентифицируйте помеченные области.
  5. Рассекните флуоресцентные участки и поместите фрагменты ткани в 6-луночную пластину (1 фрагмент на лунку при анализе отдельных метастатических очагов или множественные фрагменты из одного органа, если анализируются множественные метастазы в одном органе). Используйте стерильные бритвенные лезвия, чтобы измельчить ткань на фрагменты как можно меньше (не тратя более 1-2 мин на этот этап для каждого образца).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничение времени обработки опухолей помогает сохранить жизнеспособность клеток.
  6. Аспирировать и перенести содержимое каждой лунки в коническую трубку объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вырежьте наконечник наконечника пипетки объемом 1000 мкл, чтобы облегчить перенос более крупных фрагментов.
  7. Добавьте 1 мл HBSS в скважину и убедитесь, что оставшиеся фрагменты ткани / клетки перенесены в трубку объемом 15 мл, которая будет содержать конечный объем 4 мл. Добавьте 50 мкл коллагеназы типа I (40 мг/мл) и 12,5 мкл ДНКазы I (2000 единиц/мл) в каждую трубку.
  8. Поместите конические трубки на водяную баню, нагретую при 37 °C, в течение 45 мин. Кратковременно вращайте конические трубки каждые 5 мин.
  9. Сетчатый фильтр 70 мкм с HBSS. Используйте закрытый конец стерилизованной микроцентрифужной трубки или пластиковую часть плунжера шприца и измельчите гомогенаты ткани через ситечко 70 мкм в новую коническую трубку объемом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное увлажнение сетчатых фильтров с буфером HBSS или FACS облегчает деформацию.
  10. Вымойте ситечко 1 мл HBSS. Сетчатый фильтр 40 мкм с HBSS. Снова отфильтруйте каждый образец через сетчатый фильтр 40 мкм в новую коническую трубку объемом 50 мл. Добавьте 1 мл FBS в ситечко 40 мкм, чтобы промыть его. Держите конические трубки на льду все время.
  11. Наполните коническую трубку до 50 мл ледяным DPBS. Раскрутите ячейки вниз (180 × г в течение 10 мин при 4 °C). Выбросьте супернатант, стараясь не потерять гранулу клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов мозга повторно суспендируют клетки в 2,5 мл раствора для разделения 38% плотности (разбавляют в HBSS и хранят при комнатной температуре (RT)). Переложить на 5 мл facs трубок. Отжим в течение 20 мин при 800 × г. Вырежьте кончик кончика пипетки объемом 1000 мкл и удалите верхний слой жира. Не оставляйте жира на стенках трубок. Если остался жир, снова вращайтесь вниз и повторите процесс. Это важнейший шаг. Удалите остальную часть жидкой фазы (гранула будет полупрозрачной и трудно визуализируемой).
  12. Повторно суспендируют клетки в 1 мл буфера лизиса эритроцитов (RBC) и инкубируют в течение 60 с на RT. Погасите раствор лизиса, добавив 20 мл DPBS.
  13. Раскрутите ячейки при 180 × г в течение 10 мин при 4 °C. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клетки в 2 мл буфера FACS (5% FBS в DPBS).
  14. Приступайте к сортировке меченых клеток и/или подготовке библиотеки к объемному или одноклеточному секвенированию РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть раскручены, заморожены и сохранены при -80 °C до выделения РНК для объемной РНК-seq.

7. Перфузия тканей животных и подготовка к иммуногистологическим анализам

  1. Обезболить животное при передозировке коктейля кетамина (300 мг/кг) и ксилазина (30 мг/кг) путем внутрибрюшинной инъекции с помощью инсулинового шприца и иглы 28 г.
  2. Обнажите сердце путем грубого рассечения и сделайте разрез в правом предсердии. Осторожно удерживайте сердце на месте длинными, изогнутыми щипцами, обращенными кпереди.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Формалин и параформальдегид (PFA) являются канцерогенами. Ознакомьтесь с паспортом безопасности (SDS), избегайте воздействия паров и носите соответствующие СИЗ.
  3. Используя шприц объемом 10 мл с иглой 22 г, 22 мм, введите 10 мл DPBS с последующим 10 мл 4% PFA в левый желудочек.
  4. Приступайте к извлечению органов и загрузке их в предварительно маркированные гистологические кассеты. Поместите кассеты в контейнер соответствующего размера, который вмещает достаточное количество фиксатора (формалина) для покрытия тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале фиксирующий объем должен быть в 5-10 раз больше объема тканей.
  5. Зафиксируйте органы внутри гистологических кассет в 10% формалине в течение 48-72 ч. Выбросьте 10% формалина и дважды вымойте кассеты с 1x DPBS.
  6. Начните процесс обезвоживания, погружая кассеты в 70% этанол на 2 ч. Продолжайте погружать кассеты последовательно в возрастающие концентрации этанола: 80%, 95%, 100% в течение 1 ч каждая. Изменить 100% раствор дважды через 1,5 ч. Погружайте кассеты в ксилол на 1,5 ч и выполняйте три смены раствора.
  7. Вставить кассеты в парафиновый воск при 58-60 °C. Разделите парафиновые блоки. Приступают к окрашиванию гематоксилином и эозином (H&E) или иммуногистохимией.
  8. Для идентификации клеток меланомы используйте любой из этих маркеров или панель: S100, Melan-A, HMB-45, Tyrosinase, MITF. Когда это возможно, используйте окрашивание белка ядерного митотического аппарата (NuMA), поскольку это высокоспецифичный маркер клеток человека.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание NuMA обеспечивает четкое разграничение между клетками-хозяевами (мышью) и приживленными клетками (человеком), что помогает в обработке изображений и последующих стадиях количественной оценки опухоли.

figure-protocol-3
Рисунок 2: Примеры изображений BLI, brightfield, ex vivo флуоресценции и окрашивания H&E, иллюстрирующих многосторонний подход к анализу эффектов генов-кандидатов в метастазировании меланомы. (A) BLI, (B) BF, (C) ex vivo флуоресценция и (D) изображения окрашивания H&E. Изображения, использованные для иллюстрации, соответствуют эксперименту, в котором 131/6-4-4-литровые клетки меланомы, трансдуцированные нецелевой контрольной шРНК (SHNTC) или шРНК, нацеленной на FUT8, вводили мышам с иммунодефицитом (NSG). Глушение FUT8 ухудшало метастатическую диссеминацию клеток меланомы. Шкала и цветовая шкала = p/sec/cm2/sr × 106 (A), 100 мм (B, C), 100 мкм (D). Сокращения: BLI = биолюминесцентная визуализация; H&E = гематоксилин и эозин; шРНК = короткая шпилька РНК; shNTC = нецелевой контроль шРНК; NSG = не страдающий ожирением диабет тяжелой комбинированной иммунодефицитной гаммы; FUT8 = фукозилтрансфераза 8; BF = яркое поле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

8. Окрашивание белка ядерного митотического аппарата (NuMA) (рисунок 3)

  1. Используйте анти-NuMA антитело в качестве высокоспецифичного для человека митотического веретенообразного маркера для идентификации и количественной оценки метастатической нагрузки в срезах тканей. 8.1. Достигается высокоспецифичная и чувствительная идентификация клеток меланомы.
  2. Если хромогенная иммуногистохимия для NuMA выполняется на автоматическом иммуноирашивающем инструменте, выполните следующие действия, как описано32:
  3. Депарафинизируйте срезы в ксилоле и регидратируйте их в последовательно снижающихся концентрациях этанола. Держите слайды погруженными в течение 15 минут в ксилол и переведите их на 100% этанол еще 15 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные этапы регидратации этанола (95%, 80%, 75%) длятся от 3 до 5 мин каждая.
  4. Промойте горки в деионизированной воде.
  5. Выполните извлечение эпитопа, погрузив слайды в контейнер (например, банку для окрашивания Коплина) в буфер цитрата натрия 10 мМ, рН 6,0, в микроволновую печь мощностью 1200 Вт при 100% мощности в течение 10 минут.
  6. Используйте для маркировки неконъюгированное, поликлональное античеловеческое античеловеческое антитело NuMA, разбавленное 1:7000 в сывороточном альбумине Tris-Bovine (BSA) (25 мМ Tris, 15 мМ NaCl, 1% BSA, рН 7,2). Проводите соответствующие положительные и отрицательные контрольные группы параллельно с разделами исследования.
  7. Инкубируют слайды с первичным антителом в течение 12 ч. Обнаружить первичное антитело с помощью конъюгированного мультимера HRP против козьего анти-кролика и визуализировать комплекс с 3,3-диаминобензидином и усилителем сульфата меди.
  8. Промыть горки в дистиллированной воде, обмазывать гематоксилином, обезвоживать и монтировать постоянной средой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы обезвоживания являются обратными стадиям регидратации, описанным в шаге 8.3. Сканируйте слайды с помощью доступного сканера с 20-кратным или 40-кратным увеличением и загружайте их в базу данных.
  9. Используя программное обеспечение, нарисуйте ROI, чтобы включить все окрашенные NuMA клетки в ткань органа, исключая другие паренхимы органов и пустые пространства.
  10. Настройте параметры, чтобы классифицировать NuMA-положительные и NuMA-отрицательные клетки, используя соответствующие положительные и отрицательные элементы управления для каждого органа. Используйте установленный программный алгоритм для количественной оценки общего количества/процента NuMA-положительных клеток для каждого образца.

9. Иммунофлуоресценция среза ткани

Чтобы определить метастатическую стадию, в которой требуется конкретный кандидат гена (например, экстравазация против выживаемости после посева), можно определить иммунофлуоресценцию среза ткани в разные моменты времени для отслеживания прогрессирования опухолевых клеток от инъекции до отдаленной инвазии органов, посева и роста. Такой подход позволяет добавлять маркеры для соседних клеток для захвата события экстравазации и окружающих опухолевых микроокружений33.

  1. Обезболить животное, как описано в шаге 7.1.
  2. Вводят 100 мкг флуорофорного конъюгированного лектина Lycopersicon Esculentum (Tomato) в левый желудочек каждого животного за 3 мин до перфузии, чтобы очертить эндотелий сосудов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте время для рециркуляции томатного лектина во всей системе.
  3. Перфузируйте животное, как описано в шагах 7.2-7.3. Извлеките интересующие органы и переложите их в предварительно маркированные контейнеры, заполненные 4% PFA. Зафиксируйте ткань в течение 24-48 ч. Разделите ткань с помощью вибратома на срезы толщиной 30-50 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина должна быть оптимизирована. Рекомендуется использовать срезы толщиной от 30 до 50 мкм, особенно при выполнении z-стековой визуализации.
  4. Инкубировать ломтики в блокирующем буфере (10% обычной козьей сыворотки, 2% BSA, 0,25% triton X-100 в DPBS) в течение 2 ч при RT.
  5. Выполните эксперимент по оптимизации окрашивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку время извлечения антигена, буферы, используемые для извлечения антигена, температура, различные антитела / разные партии и тип ткани влияют на окрашивание, необходимы эксперименты по оптимизации.
  6. Добавляйте первичные антитела при оптимизированном разведении и инкубируйте в течение оптимизированного времени при оптимизированной температуре (см. примеры в таблице 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соответствующие средства контроля для первичных/вторичных антител и неокрашенных образцов тканей.
  7. Промыть ломтики ткани 3 раза в течение 5 мин 0,25% Тритоном Х-100 в DPBS.
  8. Инкубируют срезы ткани во вторичном антителе, разведенном в блокирующем растворе в течение нужного времени (таблица 1).
  9. Промыть ломтики ткани 3 раза в течение 5 мин 0,25% Тритоном Х-100 в DPBS.
  10. Окрашивают ядра 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), разбавленным 1:1000 в DPBS или блокирующим буфером в течение 5 мин.
  11. Добавьте 2 капли антизатухнечной флуоресцентной монтажной среды в крышку и установите ткань на стеклянные слайды, убедившись, что срезы полностью покрыты монтажной средой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что непосредственно на срезах нет пузырьков воздуха, так как это искажает микроскопию.
  12. Делайте конфокальные изображения с помощью доступного микроскопа с помощью 60-кратного масляного погружного объектива.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При получении конфокальных изображений применяйте одни и те же параметры настроек (напряжение, воздушные единицы и усиление) ко всем изображениям в эксперименте.
  13. Делайте неконфокальные изображения с помощью микроскопа в 10, 20 или 40 раз.
  14. Загрузите изображения в программное обеспечение для анализа изображений и проанализируйте их, сравнивая параметры выбора (например, площадь, количество, интенсивность маркеров или контакт с соседними ячейками).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующие рисунки иллюстрируют, как описанный рабочий процесс был применен для идентификации новых факторов метастазирования меланомы. На рисунке 2 обобщены результаты опубликованного исследования, в котором изучались эффекты глушения фукозилтрансферазы FUT8 при метастазировании меланомы in vivo 26. Вкратце, анализ гликомических данных пациента человека (полученных с помощью лектиновых массивов) и транскриптомического профилирования выявил повышенные уровни а...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этого технического отчета состоит в том, чтобы предложить стандартизированный, сверху донизу рабочий процесс для исследования потенциальных участников метастазирования меланомы. Поскольку эксперименты in vivo могут быть дорогостоящими и трудоемкими, стратегии максимизации эффективности и повышения ценности полученной информации имеют первостепенное значение.

Крайне важно использовать взаимодополняющие подходы для перекрестной проверки результатов в рамках одного и того же экспери...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Отдел передовых исследовательских технологий (DART) в NYU Langone Health и, в частности, Исследовательскую лабораторию экспериментальной патологии, Центр геномных технологий, Лабораторию цитометрии и сортировки клеток, Доклиническое ядро визуализации, которые частично поддерживаются грантом поддержки онкологического центра Перлмуттера NIH / NCI 5P30CA016087. Мы благодарим Междисциплинарную кооперативную группу меланомы Нью-Йоркского университета (PI: Dr. Iman Osman) за предоставление доступа к краткосрочным культурам меланомы, полученным от пациента (10-230BM и 12-273BM), которые были получены с помощью протоколов, одобренных IRB (исследование универсального согласия #s16-00122 и междисциплинарное исследование Melanoma Cooperative Group #10362). Мы благодарим д-ра Роберта Кербеля (Университет Торонто) за предоставление клеточных линий меланомы 113/6-4L и 131/4-5B1* и д-ра Минхарда Херлина (Институт Вистар) за предоставление краткосрочных культур меланомы WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2 меланомы**. E.H. поддерживается NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, премией Американского онкологического общества-Меланомы Research Alliance Team Science Award и NIH Melanoma SPORE (NCI P50 CA225450; ПИ: И.О.). Рисунок 1 был создан с помощью Biorender.com.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
#15 Скамель Блейд WPI500242Для хирургических процедур
#3 Scapel HandleWPI500236Для хирургических процедур
1 мл туберкулиновый шприц, скользящий наконечник;BD309626Инъекции
10 мл шприц, скользящий наконечникBD301029перфузия
10% формалин с натриевым буферомEK Industries4499-20LДля перфузии/фиксатора тканей
15 мл КоническийCorning 430052Клеточная культура
15 мл коническая полипропиленовая центрифужная пробиркаFalcon352196Клеточная культура
200 пруф ЭтанолDeacon Labs04-355-223Гистология
22G – 22 мм иглаBD305156перфузия
4-0 Викрил Шовный материалEthiconJ464GШовный материал
4% фосфат Карсона буферизированный параформальдегид EMS15733-10Для перфузии/фиксатора тканей
40&микро; mCorning431750Обработка тканей
5-0 Рассасывающийся шов Ethicon6542000Крышка
50 мл коническая Corning 430828Клеточная культура
50 мл Коническая полипропиленовая центрифугаFalcon352070Клеточная культура
7-0 Шелковый шов FST18020-70Лигатура
70&микро; mCorning431751Обработка тканей
Антивыцветающие монтажные среды   Вектор ЛабсH-1000-10Иммунофлуоресцентный
аппроксиматор с применением щипцов, 10см WPI14189Для микрохирургических процедур
AvanceBruker3 HDNMR Console 
Biospec 7030 Bruker7030Micro MRI
BSABioregA941NuMA Окрашивание
Castroviejo щипцы для наложения швов, прямые наконечники 5,5 мм платформа для завязывания, 11 см и м..;WPIWP5025501Для микрохирургических процедур
Баночка для окрашивания CoplinBel-Art F44208-1000Гистология
DAPISigma-AldrichD9542-1MGИммунофлуоресценция
dCas9-KRABAddgene110820Генетическая манипуляция
DNase INEBM0303LОбработка тканей
DPBSCorning21-030-CMОбработка тканей
Сверхострое безобоюдочное лезвие без покрытияGEM62-0167Обработка тканей
Субстрат внеклеточного матрикса Corning354234рассматривают сниженный фактор роста ( в качестве альтернативы 
FBSCytivaSH30910.03Клеточная культура
Фиджи Имидж JФиджи Имидж JПрограммное обеспечениеИммунофлуоресценция
козья антикроличья HRP конъюгированная мультимер Thermo FisherA16104NuMA Окрашивающая
сыворотка для козGibcoPCN5000иммунофлуоресценция
HBSSCorning21-020-CVОбработка тканей
Гематоксилин Ричард-Аллан Научный 7231Гистология
Illumina III PerkinElmerCLS136334BLI Instrument
Инсулиновый шприц 28G - игла 8 ммBD329424Инъекции Инсулиновый
шприц 31G - 6 мм игла BD326730Инъекции
Щипцы для радужной оболочки, 10,2 см, полный изгиб, зубчатыеWPI 504478Для перфузии и хирургических процедур
Isoflurane USPCovetrus11695067772Anesthesia
Jewelers #7 Щипцы титановые 11 см 0,07 x 0,01 мм НаконечникWPIWP6570Для микрохирургических процедур
Кетамин HCl 100 мг/млMylan Ind.1049007Анестезия
lentiCRISPRv2Addgene98290Генетическая манипуляция
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649InvitrogenL32472Маркер эндотелиальных клеток
сосудов MEM заменимые аминокислоты X 100Corning25-025-CIКлеточная культура
Ножницы МетценбаумаWPI503269Для хирургических процедуры
Установка для микроинъекцийKOPF5000Внутрисердечные инъекции
NaClFisherS25877 Окрашивание NuMA
Игла 30G x 25 ммBD305128Игла для внутрисердечных инъекций
33G x 15 ммHamilton7747-01Иглодержатель для внутрисонных инъекций
, Кастровьехо, 14 см, с замком, 1,2 мм Зубчатые губкиWPI14137-GДля микрохирургических процедур
NOD. мыши Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJЛаборатория Джексона005557мышиной модели
NU/J мышиЛаборатория Джексона002019мышиной модели
Ядерный митотический аппарат Белок поликлональный кролик антигуманный Abcam97585NuMA Окрашивание
пенициллин-стрептомицин 10000 ЕД/млGibco15140122Клеточная культура
PercollGE0891-01раствор для разделения плотности 
PI Классические хирургические перчаткиCardinal Health2D72PT75XSurgery
pLKO Tet-OnAddgene21915Генетическая манипуляция
Повидон-йод 10% растворMedlineMDS093943хирургии
Капли пропаракаина 0,5%Akorn PharmaAX0501Офтальмологический местный анестетик
Puralube Petrolatum Офтальмологическая мазьDechra83592Лезвие бритвы для анестезии
с двойным лезвием EMS72000Бритье и вибротомная нарезка мозга 
Зажим Reflex 9mm EZ BraintreeEZC-  КИТУкупорка для ран
RPMI 1640 Corning10-040-CMНожницы для клеточных культур
, пружина 10,5 см Str, лезвия 8 ммWPI501235для микрохирургических процедур
Полуавтоматическое вибрационное лезвие MicrotomeLeicaVT1200Срез мозга Иммунофлуоресценция
Одноканальная анестезия Испаритель Система испарителяKent ScientificVetFlo-1210S анестезия
Smartbox Настольная камерная система и вытяжная воздуходувкаEZ SystemsTT4000CO2 эвтаназия
стерильная фенестрированная одноразовая простыняmedlineNON21002хирургии
стерильные неармированные хирургические халаты aurora с втачными рукавамиmedlineDYNJP2715хирургии
T25 FlaskCorning 430639Клеточная культура
TrisCorning46-031-CMNuMA Staining
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500MLИммунофлуоресцентные
щипцы для вязания Troutman, 10 см, изогнутый G-образец, наконечник 0,52 мм с завязывающей платформойWPIWP505210Для микрохирургических процедур
Зажимы для сосудов 10G Давление 5x 0,8 мм Губки, 5/штWPI15911Для микрохирургические процедуры
VisiopharmVisiopharmVisiopharmNuMA Программное обеспечение для количественного определения окрашивания
Xylasine 100 мг/млAkorn Pharma59399-111-50Анестезия
XyleneFisherX3P-1GALГистология

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J. Metastatic pathways in patients with cutaneous melanoma. Pigment Cell Melanoma Research. 30 (1), 13-27 (2017).
  3. Platz, A., Egyhazi, S., Ringborg, U., Hansson, J. Human cutaneous melanoma; a review of NRAS and BRAF mutation frequencies in relation to histogenetic subclass and body site. Molecular Oncology. 1 (4), 395-405 (2008).
  4. Alonso, S. R., et al. A high-throughput study in melanoma identifies epithelial-mesenchymal transition as a major determinant of metastasis. Cancer Research. 67 (7), 3450-3460 (2007).
  5. Rowe, C. J., Khosrotehrani, K. Clinical and biological determinants of melanoma progression: Should all be considered for clinical management. Australasian Journal of Dermatology. 57 (3), 175-181 (2016).
  6. Plebanek, M. P., et al. Pre-metastatic cancer exosomes induce immune surveillance by patrolling monocytes at the metastatic niche. Nature Communications. 8 (1), 1319(2017).
  7. Orgaz, J. L., et al. Loss of pigment epithelium-derived factor enables migration, invasion and metastatic spread of human melanoma. Oncogene. 28 (47), 4147-4161 (2009).
  8. Ladhani, O., Sanchez-Martinez, C., Orgaz, J. L., Jimenez, B., Volpert, O. V. Pigment epithelium-derived factor blocks tumor extravasation by suppressing amoeboid morphology and mesenchymal proteolysis. Neoplasia. 13 (7), 633-642 (2011).
  9. Ju, R. J., Stehbens, S. J., Haass, N. K. The role of melanoma cell-stroma interaction in cell motility, invasion, and metastasis. Frontiers in Medicine - Dermatology. 5, 307(2018).
  10. Wiley, H. E., Gonzalez, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
  11. Meier, F., et al. Metastatic pathways and time courses in the orderly progression of cutaneous melanoma. British Journal of Dermatology. 147 (1), 62-70 (2002).
  12. Turner, N., Ware, O., Bosenberg, M. Genetics of metastasis: melanoma and other cancers. Clinical & Experimental Metastasis. 35 (5-6), 379-391 (2018).
  13. Ubellacker, J. M., et al. Lymph protects metastasizing melanoma cells from ferroptosis. Nature. 585 (7823), 113-118 (2020).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  15. Cunningham, C. C., et al. Actin-binding protein requirement for cortical stability and efficient locomotion. Science. 255 (5042), 325-327 (1992).
  16. Unger, C., et al. Modeling human carcinomas: physiologically relevant 3D models to improve anti-cancer drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 50-67 (2014).
  17. Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
  18. Nakamura, K., et al. Characterization of mouse melanoma cell lines by their mortal malignancy using an experimental metastatic model. Life Science. 70 (7), 791-798 (2002).
  19. Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
  20. Koya, R. C., et al. BRAF inhibitor vemurafenib improves the antitumor activity of adoptive cell immunotherapy. Cancer Research. 72 (16), 3928-3937 (2012).
  21. Jenkins, M. H. Multiple murine BRaf(V600E) melanoma cell lines with sensitivity to PLX4032. Pigment Cell Melanoma Research. 27 (3), 495-501 (2014).
  22. Tuncer, E., et al. SMAD signaling promotes melanoma metastasis independently of phenotype switching. The Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2702-2716 (2019).
  23. Schwartz, H., et al. Incipient Melanoma Brain Metastases Instigate Astrogliosis and Neuroinflammation. Cancer Research. 76 (15), 4359-4371 (2016).
  24. Perez-Guijarro, E., et al. Multimodel preclinical platform predicts clinical response of melanoma to immunotherapy. Nature Medicine. 26 (5), 781-791 (2020).
  25. Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
  26. Agrawal, P., et al. A systems biology approach identifies FUT8 as a driver of melanoma metastasis. Cell. 31 (6), 804-819 (2017).
  27. Hanniford, D., et al. Epigenetic silencing of CDR1as drives IGF2BP3-mediated melanoma invasion and metastasis. Cancer Cell. 37 (1), 55-70 (2020).
  28. Kim, H., et al. PRMT5 control of cGAS/STING and NLRC5 pathways defines melanoma response to antitumor immunity. Science Translational Medicine. 12 (551), (2020).
  29. de Miera, E. V., Friedman, E. B., Greenwald, H. S., Perle, M. A., Osman, I. Development of five new melanoma low passage cell lines representing the clinical and genetic profile of their tumors of origin. Pigment Cell Melanoma Research. 25 (3), 395-397 (2012).
  30. Morsi, A., et al. Development and characterization of a clinically relevant mouse model of melanoma brain metastasis. Pigment Cell Melanoma Research. 26 (5), 743-745 (2013).
  31. Huynh, C., et al. Efficient in vivo microRNA targeting of liver metastasis. Oncogene. 30 (12), 1481-1488 (2011).
  32. Zou, C., et al. Experimental variables that affect human hepatocyte AAV transduction in liver chimeric mice. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 18, 189-198 (2020).
  33. Kleffman, K., et al. Melanoma-secreted Amyloid Beta Suppresses Neuroinflammation and Promotes Brain Metastasis. bioRxiv. , 854885(2019).
  34. Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
  35. Sil, P., Wong, S. W., Martinez, J. More than skin deep: autophagy is vital for skin barrier function. Frontiers in Immunology. 9, 1376(2018).
  36. Chen, S., et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 160 (6), 1246-1260 (2015).
  37. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  38. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  39. Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Research. 30 (1), 207-210 (2002).
  40. Lappalainen, I., et al. The European Genome-phenome Archive of human data consented for biomedical research. Nature Genetics. 47 (7), 692-695 (2015).
  41. Cerami, E., et al. The cBio cancer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data. Cancer Discovery. 2 (5), 401-404 (2012).
  42. Grossman, R. L., et al. Toward a shared vision for cancer genomic data. New England Journal of Medicine. 375 (12), 1109-1112 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vivo

Похожие статьи