Анализ дифференцировки клеток, морфогенеза и паттернинга во время эмбриогенеза курицы с использованием анализа промокшей из бусин

Summary

Анализ на вымоченные шарики включает в себя целевую доставку тестового реагента в любой момент развития для изучения регуляции дифференцировки и морфогенеза клеток. Представлен подробный протокол, применимый к любой экспериментальной модели на животных, для приготовления трех различных типов размоченных шариков и их имплантации в интердигит куриного эмбриона.

Abstract

Во время эмбрионального развития активируется множество генетических программ, которые организуют дифференцировку клеток для создания поразительного разнообразия соматических клеток, тканей и органов. Точная активация этих генетических программ регулируется морфогенами, диффузными молекулами, которые направляют судьбу клеток при разных порогах. Понимание того, как генетическая активация координирует морфогенез, требует изучения локальных взаимодействий, вызванных морфогенами во время развития. Использование шариков, пропитанных белками, или лекарств, имплантированных в отдельные области эмбриона, позволяет изучить роль специфических молекул в установлении пальцев и других процессах развития. Этот экспериментальный метод предоставляет информацию о контроле индукции клеток, судьбе клеток и формировании паттернов. Таким образом, этот анализ на вымощенные бусины является чрезвычайно мощным и ценным экспериментальным инструментом, применимым к другим эмбриональным моделям.

Introduction

Прорывы в молекулярных механизмах, которые контролируют экспрессию генов во время эмбрионального развития, позволили нам понять, как определяется судьба клеток. Приверженность различным клеточным линиям происходит, как только клетки начинают молекулярную экспрессию факторов транскрипции¹. Этот паттерн экспрессии хорошо скоординирован в пространстве и времени и, таким образом, направляет формирование, позиционирование и паттерн клеток, тканей и органов 1,2,3,4,5. Эмбриональная индукци....

Protocol

Это исследование было рассмотрено и одобрено Институциональным наблюдательным советом по уходу за лабораторными животными и их использованию Института биомедических исследований Национального автономного университета Мексики (УНАМ, Мехико, Мексика).

1. Инкубация яйцеклеток и постановка эмбриона

ПРИМЕЧАНИЕ: Оплодотворенные куриные яйца можно получить на местных фермах. Чаще всего используются оплодотворенные куриные яйца White Leghorn. Храните свежеоплодотворенные куриные яйца при температуре 15 °C в течение 1 недели до инкубации.

1. Инкубируйте оплодотворенные куриные яйца вертикально заос....

Results

Использование пропитанных шариков для оценки поведения клеток в эмбриональной конечности цыпленка
Чтобы обеспечить эффективность этого анализа, шарик должен быть размещен последовательно и точно в правильном месте; в данном случае дистальный - самый третий интердигит под апикальным эктодермальным гребнем АЭР (рисунок 1А). Такое позиционирование позволяет рассматриваемой молекуле равномерно распространяться по всей межпальцевой ткани. Кроме того, зона под AER содержит неди.......

Discussion

Основным преимуществом экспериментального инструмента, подробно описанного в этом протоколе, является возможность контролировать время и место воздействия шариков, пропитанных данной экспериментальной молекулой. Сочетание правильного позиционирования с точным временем развития дает огромные возможности для изучения процессов дифференцировки клеток. Проведение этих экспериментов в недифференцированной ткани позволяет исследовать первые важные события в клеточной линии. Например, размещение пропитанной TGFß бусины в межпал.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Бусины Affi-Gel Blue Gel	Bio-Rad	153-7302
AG1-X2 Бусины	Bio-Rad	1400123
Инкубатор для яиц	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Тонкие хирургические щипцы	Fine Science Tools	9115-10
Бусины гепарина сефарозы	Abcam	ab193268
Чашка Петри	Гнездо
Стереомикроскоп	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA
Вольфрамовая игла	GoodFellow	E74-15096/01