Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Исследование сердечного метаболизма в изолированном перфузированном сердце мыши с помощью гиперполяризованной [1-13 C] пируватной и 13C/31P ЯМР-спектроскопии

2.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63188

⸱

21 апреля 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем экспериментальную установку для введения гиперполяризованных 13-меченных 13С-метаболитов в режиме непрерывной перфузии изолированному перфузированному сердцу мыши. Специальный подход к сбору данных 13С-ЯМР позволил количественно оценить активность метаболических ферментов в режиме реального времени, а многопараметрический анализ 31Р-ЯМР позволил определить содержание АТФ в ткани и рН.

Аннотация

Обмен веществ является основой важных процессов в клеточной жизни. Характеристика того, как функционируют метаболические сети в живых тканях, дает важную информацию для понимания механизма заболеваний и разработки методов лечения. В данной работе мы описываем процедуры и методики изучения внутриклеточной метаболической активности в ретроградно перфузированном сердце мыши в режиме реального времени. Сердце было изолировано in situ в сочетании с остановкой сердца, чтобы свести к минимуму ишемию миокарда, и перфузировалось внутри спектрометра ядерного магнитного резонанса (ЯМР). В то время как в спектрометре и при непрерывной перфузии гиперполяризованный [1-13 C] пируват вводили в сердце, а последующие гиперполяризованные [1-13 C] лактат и [13C] бикарбонат служили для определения в режиме реального времени скорости производства лактатдегидрогеназы и пируватдегидрогеназы. Эта метаболическая активность гиперполяризованного [1-13C]пирувата была количественно определена с помощью ЯМР-спектроскопии в свободной модели с использованием метода получения селективного насыщения-возбуждения продукта. 31 См. В промежутках между гиперполяризованными исследованиями применялась P-спектроскопия для мониторинга сердечной энергетики и рН. Эта система уникально полезна для изучения метаболической активности в здоровом и больном сердце мыши.

Введение

Изменения в сердечном метаболизме связаны с различными кардиомиопатиями и часто составляют основу основных патофизиологических механизмов1. Тем не менее, существует множество препятствий для изучения метаболизма в живых тканях, поскольку большинство биохимических анализов требуют гомогенизации ткани и лизиса клеток и/или радиоактивного отслеживания. Поэтому существует острая потребность в новых инструментах для исследования метаболизма миокарда в живых тканях. Магнитный резонанс (МРТ) гиперполяризованных 13С-меченных субстратов позволяет в режиме реального времени измерять метаболизм в живых тканях2 без использования ионизирующего излучения путем увеличения отношения сигнал/шум МР-сигнал/шум (SNR) меченого сайта (сайтов) на несколько порядков3. Здесь мы описываем экспериментальную установку, подход к приобретению и аналитический подход для изучения быстрого метаболизма в изолированном сердце мыши и, параллельно, представляем показатели общей тканевой энергетики и кислотности. рН сердца является ценным показателем, так как кислотно-щелочной баланс нарушается на ранних стадиях сердечных заболеваний и таких состояний, как ишемия миокарда, дезадаптивная гипертрофия исердечная недостаточность6.

Гиперполяризованное производство [1-13 C]лактата и [13 C]бикарбоната из гиперполяризованного [1-13C] пирувата помогает определить скорость производства лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и пируватдегидрогеназы (ПДГ). В большинстве предыдущих исследований, выполненных с использованием гиперполяризованных субстратов в изолированном сердце грызуна, либо использовались сложные кинетические модели для получения ферментативной активности ЛДГ и ФДГ, либо сообщалось об отношениях интенсивности сигнала гиперполяризованного продукта к субстрату без расчета фактических скоростей активности ферментов 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Здесь мы использовали метод 15 селективного насыщения-возбуждения продукта, который позволяет контролировать активность фермента без моделирования15,16. Таким образом, были определены абсолютные ферментативные скорости (т.е. количество молей продукта, произведенного в единицу времени). 31 См. P-спектроскопия использовалась для наблюдения сигналов неорганического фосфата (Pi), фосфокреатина (PCr) и аденозинтрифосфата (АТФ). Многопараметрический анализ был использован для характеристики распределения рН сердца, о чем свидетельствует гетерогенный химический сдвиг в Pi-сигнале ткани.

Ретроградно перфузированное сердце мыши (сердце Лангендорфа)17,18,19 является моделью ex vivo для неповрежденного бьющегося сердца. В этой модели жизнеспособность сердца и рН сохраняются в течение не менее 80 мин20, и она показала потенциал для восстановления после длительного ишемического повреждения21,22. Тем не менее, непреднамеренная вариабельность во время микрохирургии может привести к вариабельности жизнеспособности тканей в сердцах. В предыдущих исследованиях сообщалось об ухудшении состояния этого сердца с течением времени19; Например, наблюдалось снижение сократительной функции на 5-10% в час18. Ранее было показано, что сигнал аденозинтрифосфата (АТФ) сообщает об энергетическом статусе и жизнеспособности миокарда23. Здесь мы отметили, что перфузированное сердце может иногда демонстрировать непреднамеренную вариабельность уровней жизнеспособности, о чем свидетельствует содержание АТФ, несмотря на то, что у нас была непрерывная перфузия и снабжение кислородом. Здесь мы демонстрируем, что нормализация показателей ЛДГ и ФДГ к содержанию АТФ в сердце снижает межсердечную вариабельность этих показателей.

В следующем протоколе мы описываем хирургическую процедуру, используемую для канюляции сердца, выделения и последующей перфузии в ЯМР-спектрометре. Следует отметить, что другие хирургические подходы, направленные на изоляцию и перфузию сердца мыши, были описаны до24,25.

Также описаны методики, используемые для получения данных, связанных с ферментативными скоростями в работающем сердце (с использованием спектроскопии 13 C и гиперполяризованного [1-13C] пирувата), а также жизнеспособностью и кислотностью сердца (с использованием 31P ЯМР-спектроскопии). Наконец, объясняются аналитические методологии определения активности метаболических ферментов, жизнеспособности и кислотности тканей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Объединенный комитет по этике (IACUC) Еврейского университета и медицинского центра «Хадасса» одобрил протокол исследования по благополучию животных (MD-19-15827-1).

1. Подготовка буфера Кребса-Хензеляйта

  1. За сутки до эксперимента приготовьте модифицированный вариант буфера Кребса-Хензелейта (KHB)26. Первоначально растворяют 118 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 0,5 мМ пирувата, 1,2 мМ MgSO4, 25 мМ NaHCO3 и 1,2 мМKH2PO4 в двойной дистилляции H2O.
  2. Взбейте эту смесь с 95%/5% O2/CO2 в течение 20 мин, а затем добавьте 1,2 мМCaCl2.
  3. Отрегулируйте рН буфера до 7,4 с помощью HCl или NaOH.
  4. В день эксперимента добавьте 10 мМ глюкозы и 72 ЕД/л инсулина к KHB, приготовленному на шаге 1.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инсулин добавляют в буфер перфузии, как описано в работе Kolwicz et al.26 и в соответствии с предыдущими исследованиями, в которых сообщалось, что инсулин увеличивает сократительную функцию27 и интенсивность гиперполяризованного [13C] бикарбонатного сигнала 28.

2. Подготовка перфузионной системы

  1. Держите резервуар с 200 мл KHB на водяной бане при 40 ° C и пузыритесь с 95% / 5% O 2 / CO2 при скорости потока 4 л / мин в течение 1 часа до сердечной перфузии. Держите буфер непрерывно пузырящимся с этой газовой смесью на протяжении всего эксперимента.
    1. Сначала установите водяную баню на 40 °C. Вставьте резервуар KHB. Используйте перистальтический насос (см. Таблицу материалов) и удлинительные трубки медицинского класса для рециркуляции KHB между буферным резервуаром и трубкой ЯМР диаметром 10 мм при постоянной скорости потока 7,5 мл / мин.
    2. Подсоедините к насосу три силиконовые трубки платинового отверждения (внутренний диаметр 3 мм) (одну впускную трубку и две выпускные трубки для буфера KH). Вставьте линии оттока и притока в нагретый буфер KH. Затем вставьте кислородную магистраль в нагретый буфер KH.
    3. Используйте тонкие линии полиэфирэфиркетона (PEEK, см. Таблицу материалов) для буфера и гиперполяризованного агента, который будет поступать в трубку ЯМР и из нее в отверстии спектрометра.
  2. Убедитесь, что температура поддерживается на уровне 37-37,5 °C. Выполните следующие действия.
  3. Оберните линию притока (от буферного резервуара до трубки ЯМР) нагревательной лентой, установленной на 42 °C.
  4. Нагрейте ЯМР-трубку внутри спектрометра теплым воздушным потоком, который регулируется спектрометром.
  5. Используйте ЯМР-совместимый датчик температуры (см. Таблицу материалов) для измерения температуры внутри ЯМР-трубки. Температура регулируется до 37-37,5 °C.

3. Калибровка и подготовка ЯМР-спектрометра к получению данных

  1. В день эксперимента вставьте в спектрометр стандартный образец с температурой13 ° C, содержащий 1,4-диоксан (таблица материалов), и настройте и сопоставьте зонд ЯМР на 13° C. Затем получают спектр, показывающий сигнал теплового равновесия 1,4-диоксана с углом нутации 90°.
  2. Теперь замените стандартный образец 13C на стандартный образец 31 P (Таблица материалов), который содержит 105 мМ АТФ в D2O. Настройте и сопоставьте зонд ЯМР на 31P.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Спектр, показывающий сигналы теплового равновесия фосфата, получен с углом нутации 50°.
  3. Вставьте линию притока, линию оттока и датчик температуры в трубку ЯМР диаметром 10 мм, а затем вставьте трубку в магнитное отверстие. Отрегулируйте нагревательную ленту до 42 °C.
  4. Получите 31P спектр ЯМР циркулирующего буфера KH, который будет использоваться в этом эксперименте в течение 30 мин, с углом нутации 50° и TR 1,1 с (1,640 захватов).

4. Подготовка животных, хирургическое вмешательство и перфузия сердца в ЯМР-трубке

  1. Анестезируйте самца мыши HSD:ICR (CD-1) 3,3% изофлураном в комнатном воздухе (Таблица материалов) со скоростью 340 мл / мин в течение 5 минут с использованием системы газовой анестезии (Таблица материалов) в индукционной камере.
  2. Используйте назальный наркоз для поддержания общей анестезии с 2,9% изофлураном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо позаботиться о том, чтобы свести к минимуму боль и дискомфорт для животного.
  3. Закрепите конечности животного скотчем, обеспечьте отрицательный педальный болевой рефлекс, а затем внутрибрюшинно введите 300 МЕ гепарина натрия.
  4. Тщательно смочите грудную стенку и живот мыши 70% спиртом, чтобы обеспечить чистоту и избежать загрязнения волос или обструкции во время хирургической процедуры.
  5. Через 1 мин после инъекции гепарина разрежьте кожу и мышцы брюшной полости маленькими ножницами.
  6. Поместите маленький зажим от комаров с изогнутой челюстью, фиксирующий гемостат, между мечевидным отростком и кожей грудной клетки, чтобы поднять грудную клетку и обнажить диафрагму. Проколите и отрежьте правую долю диафрагмы.
  7. Разрежьте грудь поперек средней линии, отведите в стороны, а затем уберите.
  8. Введите в левый желудочек сердца 200 МЕ гепарина натрия, чтобы предотвратить свертывание крови. Затем введите 0,1 мл ледяного 0,5 моль/л KCl для достижения остановки сердца, как описано ранее25. Остановка сердца необходима для канюляции сердца.
  9. Определите тимус и удалите его с помощью ножниц, чтобы обнажить аорту. Удалите остаточную ткань грудной клетки.
  10. Определите дугу аорты и используйте изогнутые щипцы, чтобы поместить свободный узел с шелковым швом 3-0 (Таблица материалов) вокруг восходящей аорты. Введите 3 мл KHB в левый желудочек, чтобы удалить сгустки крови из аорты.
  11. Используйте изогнутые щипцы, чтобы втянуть сердце вниз для лучшей визуализации восходящей аорты.
  12. Проведите канюляцию in situ с помощью внутривенного катетера 22 г (таблица материалов). Нанесите цианакрилатный клей в канюлированную область, а затем выполните двойное наложение швов. Введите дополнительный буфер KH в сердце и убедитесь, что он течет через канюляционную трубку.
  13. Удалите изогнутые щипцы. Отсоедините сердце от окружающих внутренних органов и ретроградно перфузируйте его ледяным KHB (4 °C) через внутривенный катетер.
  14. Подключите сердце к линии притока перфузионной системы через внутривенный катетер. После начала перфузии теплым буфером (37-37,5 °C) при 7,5 мл / мин сердце начинает биться спонтанно.
  15. Закрепите трубку ЯМР с бьющимся сердцем, линиями оттока и датчиком температуры и вставьте в отверстие спектрометра, убедившись, что сердце находится в центре датчика ЯМР.

5. Получение данных для сердечной энергетики и рН

  1. Получение 31спектра P в течение примерно 1 ч с углом разворота 50° и TR 1,1 с.

6. Спиновая поляризация и растворение DNP

  1. Приготовьте состав [1-13C] пирувата в дозе 28,5 мг. Этот состав состоит из радикала OX063 от 11,1 мМ до 14,0 мМ в чистой кислоте.
  2. Приготовьте 4 мл растворяющей среды. Среда растворения состоит из TRIS-фосфатного буфера, который содержит 11,2 мМ 2 PO 4, 38,8 мМ Na 2 HPO4, 33 мМ TRIS и 2мМ HCl. Эту среднюю композицию регулируют таким образом, что при добавлении 28,5 мг [1-13С] состава пировиноградной кислоты к 4 мл этого буфера (в фазе растворения) рН полученного раствора будет составлять 7,4.
  3. Выполняйте спиновую поляризацию и быстрое растворение в устройстве спиновой поляризации растворения-DNP (dDNP) в соответствии с инструкциями производителя (таблица материалов). Применяют микроволновое облучение на частоте 94,110 ГГц для поляризации состава пировиноградной кислоты [1-13С] при 1,45–1,55 К в течение примерно 1,5 ч.
  4. Быстро смешайте 4 мл гиперполяризованной среды из устройства dDNP с хорошо насыщенным кислородом раствором, который дополняет гиперполяризованную среду растворения, чтобы получить композицию, близко соответствующую перфузионной среде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем среды, перфузирующей сердце во время гиперполяризованных инъекций 14 мМ гиперполяризованным [1-13С] пируватом, составляет 26 мл. Конечная композиция вводимой среды (после смешивания) содержит 4,7 мМ KCl, 1,2 мМ MgSO 4, 70 мМ NaCl, 25 мМ NaHCO3, 1,2 мМ KH2 PO 4, 10 мМ глюкозы, 1,2 мМ CaCl2 и72ЕД/л инсулина.
  5. Вводят гиперполяризованную [1-13С] пируватсодержащую среду в изолированное сердце с использованием установкинепрерывного потока 29.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается для того, чтобы гарантировать, что перфузия сердца не нарушается ни в один момент во время эксперимента и что гиперполяризованная среда вводится с известной скоростью и в течение известной продолжительности.

7. Гиперполяризованная спектроскопия 13C

  1. Получение гиперполяризованных данных 13 C с использованием селективных импульсов насыщения-возбуждения 15 путем применения импульсов кардинального синуса (Sinc) продолжительностью 2,5 мс, как описано ранее15,16. Селективно возбуждают [1-13С]лактат и [13С]бикарбонат последовательно с интервалом 6 с для получения интервала 12с для каждого метаболита.
  2. Для обнаружения [1-13 C] лактата центрируйте селективный импульс Sinc на частоте пируватгидрата [1-13 C] (179,4 ppm), что приводит к соотношению интенсивности сигнала (lac) 0,113 для сигналов C 1 от [1-13 C]пирувата к [1-13C]лактату.
  3. Для обнаружения бикарбоната [13 C] центрируйте селективный импульс Sinc на 157,7 ppm, что составляет 214 Гц в нижнем поле сигнала [13C] бикарбоната (161,1 ppm); это приводит к коэффициенту интенсивности сигнала (bic), равному 0,139 для сигнала C 1 от [1-13C] пирувата до [13C] бикарбоната.

8. Определение массы и объема сырой ткани

  1. В конце эксперимента отделите сердце от перфузионной системы и аккуратно высушите его папиросной бумагой. Впоследствии взвесьте сердце, чтобы получить ткань влажного веса.
  2. Определите объем сердца, используя коэффициент плотности 1,05 г/см3, как определено ранее для сердцамыши 30.

9. Количественная оценка содержания АТФ

  1. Интегрируйте сигнал γ-АТФ одного сбора стандартного образца АТФ и 30-минутного сбора (TR 1,1 с и 1,640 захватов) изолированного сердца.
  2. Количественно определите содержание АТФ в сердце, сравнив интеграл сигнала γ-АТФ сердца со стандартом (Таблица материалов), где последний имеет известную концентрацию (105 мМ), и скорректируйте количество приобретений и эффектов релаксации.

10. Разрешение сигнала Пи сердца

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы оценить рН ткани, сначала необходимо отделить сигнал Pi сердца от общего сигнала Pi (Pit). Это делается путем исключения сигнала KHB Pi (PiKH) из сигнала Pit.

  1. В спектре 31P KHB, который показывает один Pi-сигнал (Pi KH, рис. 1A), подгоните сигнал PiKH к функции Лоренца с помощью Excel (Таблица материалов).
  2. Объем, видимый ЯМР-зондом (Vp, 1,375 мл), содержит больше KHB, когда пробирка для образца не содержит сердца. Чтобы скорректировать этот эффект заполнения, рассчитайте ослабленный буферный сигнал (Pib), используя уравнение 1A.
    figure-protocol-1Уравнение 1А
    где Vh - объем сердца, как определено на шаге 8.
  3. Вычтите этот сигнал из Pit в соответствии с уравнением 1B, чтобы получить сигнал Pi, исходящий исключительно от перфузированного сердца (Pih, рис. 1B).
    figure-protocol-2Уравнение 1В

11. Многопараметрический анализ рН

  1. Выполните преобразование распределения химического сдвига сигнала Pih в рН по отношению к химическому сдвигу PCr, используя уравнение 231.
    figure-protocol-3Уравнение 2
    где Δδ — разность химического сдвига, pKa — 6,72, δ свободное основание — 5,69, а δ свободная кислота — 3,27, как описано ранее31.
  2. Скорректируйте результирующую кривую распределения рН для нелинейности между шкалой химического сдвига Pih и шкалой pH в соответствии с Lutz et al.32. Типичное распределение рН, полученное в результате этого расчета, представлено на рисунке 1C.
  3. Анализ распределения рН тканей с помощью многопараметрического подхода с использованием семи статистических параметров в соответствии с работой Lutz et al. 32. Здесь представлены четыре из этих параметров, поскольку они, по-видимому, являются наиболее описательными для рН тканей: 1) глобальный максимальный рН; 2) средневзвешенный рН; 3) взвешенный медианный рН; и 4) асимметрия графика рН (рис. 1С).

12. Расчет деятельности LDH и PDH

ПРИМЕЧАНИЕ: Скорости производства гиперполяризованных метаболитов [1-13 C] лактата и [13C] бикарбоната используются для расчета активности ЛДГ и ФДГ соответственно. В подходе15 к селективному насыщению-возбуждению продукта при каждом селективном возбуждении обнаруживаются только вновь синтезированные гиперполяризованные метаболиты.

  1. Используйте гиперполяризованный сигнал пирувата [1-13C] в качестве эталона для определения соответствующего уровня производства метаболитов.
    1. При перфузии гиперполяризованной средой концентрация пирувата [1-13 С] в ЯМР-трубке увеличивается (промывка), затем плато (при максимальной концентрации 14мМ), а затем уменьшается (вымывание).
    2. Чтобы определить моменты времени, в которые концентрация пирувата достигла постоянного уровня (плато), скорректируйте сигнал пирувата [1-13C] для затухания сигнала в результате релаксации T1 и радиочастотной пульсации, используя эффективную константу релаксации, Teff.
    3. Для каждой инъекции определитеT-eff на основе его способности корректировать кривую распада пирувата [1-13C], чтобы показать эту динамику потока (уравнение 3).
      figure-protocol-4Уравнение 3
      где figure-protocol-5 — сигнал пирувата [1-13C], полученный во время сбора бикарбоната [13C]. Было обнаружено, что среднийT-эфф в описанных здесь экспериментах составляет 35,8 с ± 2,3 с (n = 5 сердец).
    4. Выберите точки данных, в которых концентрация находится в пределах 10% от максимального скорректированного сигнала пирувата [1-13° C] для дальнейшего анализа.
  2. Используйте соответствующие данные продукции [1-13 С]лактата и [13С]бикарбоната для временных моментов, выбранных на шаге 12.1, для расчета скоростей продукции метаболитов с использованием уравнений 4А и 4В при условии, что отношение сигнал/шум сигнала метаболита больше 2 (пороговое значение для анализа). Типичный пример такого выбора временных точек показан на рисунке 2B (выделенное временное окно).
  3. Рассчитайте производительность каждой из выбранных точек данных, используя уравнения 4A и уравнения 4B:
    figure-protocol-6Уравнение 4А
    figure-protocol-7Уравнение 4B
    где figure-protocol-8 и — скорости производства [1-13 С]лактата или [13 С]бикарбоната в каждый момент времени, соответственно. и являются факторами, представляющими относительное возбуждение [1-13С]пирувата и figure-protocol-9 figure-protocol-10 продуктов [1-13С]лактата или [13С]бикарбоната, соответственно. figure-protocol-11 Ранее эти факторы были определены как 0,113 и 0,139 соответственно29. Vp - объем, который детектируется ЯМР-зондом (1,375 мл), TR обозначает промежуток времени между двумя последовательными селективными насыщающими возбуждениями продукта (12 с для каждого продукта), figure-protocol-12 и являются сигналами [1-13 С]лактата и [13 С]бикарбоната соответственно, и и являются сигналами [1-13 С]пирувата, которые были получены во время [1-13 С]лактата и figure-protocol-13 figure-protocol-14 figure-protocol-15 [13 C]бикарбонатные возбуждения, соответственно. [Pyr] - это концентрация пирувата [1-13 C], которая составляла 14мМ во время фазы плато.
    1. Определите скорость для каждой точки, а затем усредните по гиперполяризованной инъекции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1А показаны 31спектры P, записанные в сердце мыши, перфузированном KHB, и только в буфере. В сердце наблюдались сигналы α-, β- и γ-АТФ, PCr и Pi. Пи-сигнал состоял из двух основных компонентов: в более высоком поле (левая часть сигнала) пи-сигнал был в основном обусловлен KHB при pH 7,4; в нижнем поле (правая часть сигнала) Pi-сигнал был шире и менее однороден из-за более кислой среды. Последний паттерн возникает из сердечной ткани. Пи-сигнал сердечной ткани извлекается...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы демонстрируем экспериментальную установку, предназначенную для исследования гиперполяризованного [1-13C] пируватного метаболизма, тканевой энергетики и рН в изолированной модели сердца мыши.

Важнейшими шагами в рамках протокола являются следующие: 1) обеспечение того, чтобы рН буфера составлял 7,4; 2) обеспечение включения всех компонентов буфера; 3) предотвращение свертывания крови в сосудах сердца путем инъекций гепарина; 4) предотвращение ишемического повреждения сердца за сче...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Раскрытия информации нет.

Благодарности

Этот проект финансировался Израильским научным фондом в рамках грантового соглашения No 1379/18; стипендия Жаботинского Министерства науки и технологий Израиля по прикладным и инженерным наукам для прямых аспирантов No 3-15892 для докторов наук; и исследовательская и инновационная программа Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 858149 (AlternativesToGd).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Equipment
HyperSense DNP PolariserOxford Instruments52-ZNP91000HyperSense, 3,35 Тл, доклиническое растворение - гиперполяризатор
DNP ЯМР-спектрометр RS2DNMR Cube, 5,8 Т, оснащен 10 мм широкополосным зондом
Перистальтический насос;Cole-Parmer07554-95
Температурный зондOsensaFTX-100-LUX+ЯМР совместимый температурный зонд
Somnosuite низкопоточная система для анестезииKent Scientific
Линии, трубки, шовные
платиновые силиконовые трубкиCole-ParmerHV-96119-16L/S 16 I.D. 3,1 мм& НБСП;
Тонкие линии полиэфирэфиркетона (PEEK)Upchurch Scientificid. 0.040"
Внутривенный катетер BD Medical38132322 G
Шелковый шовный материалEthiconW577HДиаметр проволоки 3-0
Химикаты и фармацевтика
1-13C]пировиноградная кислотаCambridge Isotope LaboratoriesCLM-8077-1
Хлорид кальцияSigma-Aldrich21074CAS: 10043-52-4
D-(+)-глюкозаSigma-AldrichG7528CAS: 50-99-77
Гепариннатрия RotexmedicaHEP5A0130C0160
соляной кислоты 37%Sigma-Aldrich258148CAS: 7647-01-0
Инсулин аспарт (NovoLog)Novo Nordisk
ИзофлуранТеррель
СульфатмагнияSigma-Aldrich793612CAS: 7487-88-9
Хлорид калияSigma-AldrichP4504CAS: 7447-40-7
Моноосновной фосфат калияSigma-AldrichP9791CAS: 7778-77-0
Бикарбонат натрияGadot GroupCAS: 144-55-8
Хлорид натрияSigma-AldrichS9625CAS: 7647-14-5
Натрий гидроксидSigma-Aldrich655104CAS: 1310-73-2
Двухосновной фосфат натрияSigma-AldrichS7907CAS: 7558-79-4
Одноосновной дигидрат фосфатанатрия Merck6345CAS: 13472-35-0
TRIS (биотехнологический класс)Amresco0826CAS: 77-86-1
Тритиловый радикал OX063GE Healthcare ASNC100136OX063
Стандарт NMR
13C стандартный образецCambridge Isotope LaboratoriesDLM-72A40%-диоксан в бензоле-D6
31P стандартный образецИзготовлено в собственном105 мМ АТФ и 120 мМ фенилфосфоновой кислоты в D2O
>Software
Excel 2016Microsoft
MNovaMestrelab Research
[ производстве

Ссылки

  1. Aquaro, G. D., Menichetti, L. Hyperpolarized 13C-magnetic resonance spectroscopy: Are we ready for metabolic imaging. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (6), 854-856 (2014).
  2. Schroeder, M. A., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB Journal. 23 (8), 2529-2538 (2009).
  3. Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  4. Merritt, M. E., et al. Hyperpolarized C-13 allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (50), 19773-19777 (2007).
  5. Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: A metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magn Reson Med. (5), 1663-1669 (2014).
  6. Khemtong, C., Carpenter, N. R., Lumata, L. L., et al. Hyperpolarized 13C NMR detects rapid drug-induced changes in cardiac metabolism. Magnetic Resonance in Medicine. 74 (2), 312-319 (2015).
  7. Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-13C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
  8. Moreno, K. X., Sabelhaus, S. M., Merritt, M. E., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Competition of pyruvate with physiological substrates for oxidation by the heart: implications for studies with hyperpolarized [1-13C]pyruvate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), H1556-H1564 (2010).
  9. Purmal, C., et al. Propionate stimulates pyruvate oxidation in the presence of acetate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (8), H1134-H1141 (2014).
  10. Weiss, K., et al. Developing hyperpolarized 13C spectroscopy and imaging for metabolic studies in the isolated perfused rat heart. Applied Magnetic Resonance. 43 (1), 275-288 (2012).
  11. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia: NMR detection of hyperpolarized 13CO2and H13CO3. Magnetic Resonance in Medicine. 60 (5), 1029-1036 (2008).
  12. Schroeder, M. A., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovascular Research. 86 (1), 82-91 (2010).
  13. Ball, D. R., et al. Metabolic imaging of acute and chronic infarction in the perfused rat heart using hyperpolarised [1-13C]pyruvate. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1441-1450 (2013).
  14. Atherton, H. J., et al. Role of PDH inhibition in the development of hypertrophy in the hyperthyroid rat heart: a combined magnetic resonance imaging and hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy study. Circulation. 123 (22), 2552-2561 (2011).
  15. Harris, T., et al. Hyperpolarized product selective saturating-excitations for determination of changes in metabolic reaction rates in real-time. NMR in Biomedicine. 33 (2), e4189(2020).
  16. Shaul, D., et al. Correlation between lactate dehydrogenase/pyruvate dehydrogenase activities ratio and tissue pH in the perfused mouse heart: A potential noninvasive indicator of cardiac pH provided by hyperpolarized magnetic resonance. NMR in Biomedicine. 34 (2), e4444(2021).
  17. Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), e0160605(2016).
  18. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  19. Lateef, R., Al-Masri, A., Alyahya, A. Langendorff's isolated perfused rat heart technique: A review. International Journal of Basic and Clinical Pharmacology. 4, 1314-1322 (2015).
  20. Cross, H. R., Radda, G. K., Clarke, K. The role of Na+/K+ ATPase activity during low-flow ischemia in preventing myocardial injury - A 31P, 23Na and 87Rb NMR spectroscopic study. Magnetic Resonance in Medicine. 34 (5), 673-685 (1995).
  21. Cross, H. R., Clarke, K., Opie, L. H., Radda, G. K. Is lactate-induced myocardial ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (7), 1369-1381 (1995).
  22. Clarke, K., O'Connor, A. J., Willis, R. J. Temporal relation between energy metabolism and myocardial function during ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology. 253 (2), H412-H421 (1987).
  23. Yabe, T., Mitsunami, K., Inubushi, T., Kinoshita, M. Quantitative measurements of cardiac phosphorus metabolites in coronary artery disease by 31P magnetic resonance spectroscopy. Circulation. 92 (1), 15-23 (1995).
  24. Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the determination of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. Journal of Visualized Experiments. (115), e54497(2016).
  25. Cordeiro, B., Clements, R. Murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest. Journal of Visualized Experiments. (102), e52433(2015).
  26. Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (42), e2069(2010).
  27. Nakadate, Y., et al. Glycemia and the cardioprotective effects of insulin pre-conditioning in the isolated rat heart. Cardiovascular Diabetology. 16 (1), 43(2017).
  28. Lauritzen, M. H., et al. Enhancing the C-13 bicarbonate signal in cardiac hyperpolarized 1-C-13 pyruvate MRS studies by infusion of glucose, insulin and potassium. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1496-1500 (2013).
  29. Adler-Levy, Y., et al. In-cell determination of lactate dehydrogenase activity in a luminal breast cancer model - ex vivo investigation of excised xenograft tumor slices using dDNP hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Sensors. 19 (9), 2089(2019).
  30. Young, A. A., Barnes, H., Davison, D., Neubauer, S., Schneider, J. E. Fast left ventricular mass and volume assessment in mice with three-dimensional guide-point modeling. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 30 (3), 514-520 (2009).
  31. Bailey, I. A., Williams, S. R., Radda, G. K., Gadian, D. G. Activity of phosphorylase in total global ischaemia in the rat heart. A phosphorus-31 nuclear-magnetic-resonance study. Biochemical Journal. 196 (1), 171-178 (1981).
  32. Lutz, N. W., Le Fur, Y., Chiche, J., Pouyssegur, J., Cozzone, P. J. Quantitative in vivo characterization of intracellular and extracellular pH profiles in heterogeneous tumors: A novel method enabling multiparametric pH analysis. Cancer Research. 7 (15), 4616-4628 (2013).
  33. Harris, T., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Impurities of [1-13C]pyruvic acid and a method to minimize their signals for hyperpolarized pyruvate metabolism studies. Applied Magnetic Resonance. 49 (10), 1085-1098 (2018).
  34. Cunningham, C. H., et al. Hyperpolarized 13C metabolic MRI of the human heart initial experience. Circulation Research. 119 (11), 1177-1182 (2016).
  35. Kurhanewicz, J., et al. Hyperpolarized 13C MRI: Path to clinical translation in oncology. Neoplasia. 21 (1), 1-16 (2019).
  36. Miloushev, V. Z., et al. Metabolic imaging of the human brain with hyperpolarized 13C pyruvate demonstrates 13C lactate production in brain tumor patients. Cancer Research. 78 (14), 3755-3760 (2018).
  37. Park, I., et al. Development of methods and feasibility of using hyperpolarized carbon-13 imaging data for evaluating brain metabolism in patient studies. Magnetic Resonance in Medicine. 80 (3), 864-873 (2018).
  38. Grist, J. T., et al. Quantifying normal human brain metabolism using hyperpolarized [1-13C]pyruvate and magnetic resonance imaging. Neuroimage. 189, 171-179 (2019).
  39. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-C]pyruvate. Science Translational Medicine. 5 (198), (2013).
  40. Stødkilde-Jørgensen, H., et al. Pilot study experiences with hyperpolarized [1-13C]pyruvate MRI in pancreatic cancer patients. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 961-963 (2019).
  41. Autry, A. W., et al. Measuring tumor metabolism in pediatric diffuse intrinsic pontine glioma using hyperpolarized carbon-13 MR metabolic imaging. Contrast Media and Molecular Imaging. 2018, 3215658(2018).
  42. Chung, B. T., et al. First hyperpolarized [2-13C]pyruvate MR studies of human brain metabolism. Journal of Magnetic Resonance. 309, 106617(2019).
  43. Rider, O. J., et al. Noninvasive in vivo assessment of cardiac metabolism in the healthy and diabetic human heart using hyperpolarized 13C MRI. Circulation Research. 126 (6), 725-736 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Гиперполяризованный пируватспектроскопия ядер углерода 13спектроскопия ядер фосфора 31метаболизм пируваталактатдегидрогеназапируватдегидрогеназаэнергетика сердца
Исследование сердечного метаболизма в изолированном перфузированном сердце мыши с помощью гиперполяризованной [1-13 C] пируватной и 13C/31P ЯМР-спектроскопии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.