Method Article

В пробирке Характеристика гистоновых шаперонов с использованием аналитических, вытягивающих и шаперонных анализов

DOI:

10.3791/63218

⸱

December 29th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Life Sciences, 2Regional Centre for Biotechnology, 3School of Biotechnology, KIIT University, 4Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 5Department of Pharmacology, University of Vermont College of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает набор методов, которые включают аналитическую хроматографию с исключением размера для изучения олигомеризации и стабильности гистонов-шаперонов, анализ вытягивания для разгадки взаимодействий гистон-шаперон-гистон, AUC для анализа стехиометрии белковых комплексов и анализ гистонового шаперонирования для функциональной характеристики предполагаемого гистонового шаперона in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гистоновые белки связываются с ДНК с образованием эукариотического хроматина. Основной единицей хроматина является нуклеосома, состоящая из гистонового октамера, состоящего из двух копий основных гистонов H2A, H2B, H3 и H4, обернутых вокруг ДНК. Октамер состоит из двух копий димера H2A/H2B и одной копии тетрамера H3/H4. Высокозаряженные гистоны ядра склонны к неспецифическим взаимодействиям с несколькими белками в клеточной цитоплазме и ядре. Гистоновые шапероны образуют разнообразный класс белков, которые переносят гистоны из цитоплазмы в ядро и помогают их отложению на ДНК, тем самым помогая процессу сборки нуклеосом. Некоторые гистоновые шапероны специфичны для H2A/H2B или H3/H4, а некоторые функционируют как шапероны для обоих. Этот протокол описывает, как лабораторные методы in vitro , такие как вытягивающие анализы, аналитическая хроматография с исключением размера, аналитическое ультрацентрифугирование и анализ гистонов, могут быть использованы в тандеме для подтверждения того, функционирует ли данный белок в качестве гистонового шаперона.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нуклеосомы, состоящие из ДНК и гистоновых белков, образуют структурную единицу хроматина и регулируют несколько критических клеточных событий. Нуклеосомы динамически репозиционируются и реконструируются, чтобы сделать ДНК доступной для различных процессов, таких как репликация, транскрипция и трансляция 1,2. Гистоны, которые являются очень основными, либо имеют тенденцию взаимодействовать с кислыми белками в клеточной среде, либо подвергаются агрегации, что приводит к различным клеточным дефектам 3,4,5. Группа выделенных белков, называемых гистоновыми шаперонами, помогает транспорту гистонов из цитоплазмы в ядро и предотвращает аберрантные события агрегации гистон-ДНК 6,7. По сути, большинство гистоновых шаперонов хранят и переносят гистоны на ДНК с физиологической ионной силой, тем самым способствуя образованию нуклеосом 8,9. Некоторые гистоновые шапероны имеют определенное предпочтение гистоновым олигомерам H2A/H2B или H3/H410.

Гистоновые шапероны характеризуются на основе их способности собирать нуклеосомы, зависимые или независимые от синтеза ДНК11. Например, фактор сборки хроматина-1 (CAF-1) зависит, в то время как гистоновый регулятор A (HIRA) не зависит от синтеза ДНК12,13. Аналогичным образом, семейство нуклеоплазминов гистоновых шаперонов участвует в деконденсации хроматина сперматозоидов и сборке нуклеосом14. Члены семейства нуклеосомных сборочных белков (NAP) способствуют образованию нуклеосомоподобных структур in vitro и участвуют в перемещении гистонов между цитоплазмой и ядром15. Нуклеоплазмины и белки семейства NAP являются функциональными гистоновыми шаперонами, но не имеют общих структурных особенностей. По сути, ни одна структурная особенность не позволяет классифицировать белок как гистоновый шаперон16. Использование функциональных и биофизических анализов наряду со структурными исследованиями лучше всего подходит для характеристики гистоновых шаперонов.

В этой работе описываются биохимические и биофизические методы характеристики белка как гистонового шаперона, который помогает сборке нуклеосом. Сначала была проведена аналитическая размерно-эксклюзионная хроматография для анализа олигомерного статуса и стабильности гистоновых шаперонов. Затем был проведен вытягивающий анализ для определения движущих сил и конкурентного характера взаимодействий гистон-шаперон-гистон. Однако гидродинамические параметры этих взаимодействий не могут быть точно рассчитаны с помощью аналитической размерно-эксклюзионной хроматографии из-за формы белка и его комплексов, которые влияют на их миграцию через столб. Поэтому было использовано аналитическое ультрацентрифугирование, которое обеспечивает макромолекулярные свойства в растворе, которые включают точную молекулярную массу, стехиометрию взаимодействия и форму биологических молекул. В прошлых исследованиях широко использовался анализ гистонов in vitro для функциональной характеристики гистоновых шаперонов, таких как yScS11617, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120. Анализ гистонового шаперонирования также использовался для функциональной характеристики белков как гистоновых шаперонов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Аналитическая размерно-эксклюзионная хроматография для выяснения олигомерного статуса и стабильности гистоновых шаперонов

  1. Анализ олигомерного статуса гистоновых шаперонов
    1. Уравновешивайте колонку аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC) объемом 24 мл с объемом 1,2 столбца (CV), т.е. 28,8 мл дегазированного буфера SEC [20 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 300 мМ NaCl и 1 мМ β-меркаптоэтанола (β-ME)] при 4 °C (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тип столбца, буферный состав и буферный рН могут быть выбраны на основе интересующего белка. Объем впрыска образца не должен превышать 500 мкл для колонки объемом 24 мл. Кроме того, давление в колонне должно поддерживаться ниже 5 МПа.
    2. Из раствора белка с более высокой концентрацией приготовьте 500 мкл образца белка 0,5 мг/мл в дегазированном буфере SEC и введите его в предварительно уравновешенную колонну с использованием инъекционной петли 500 мкл. Позвольте хроматографии протекать при изократическом расходе 0,2-0,3 мл/мин с буфером SEC при 4 °C.
    3. Мониторинг профиля элюирования белка путем измерения поглощения на длине волны 280 нм. При работе с белками, лишенными ароматических остатков, измерьте абсорбцию на уровне 214 нм.
    4. Используйте объем элюирования белка для расчета его приблизительной молекулярной массы в кДа с использованием стандартной калибровочной кривой21.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровочная кривая получается путем построения удерживающего объема известных молекулярно-весовых белков против логарифма их соответствующих молекулярных масс (log Mr), элюированного с использованием той же колонки.
  2. Анализ термической стабильности гистоновых шаперонов
    1. Возьмите 500 мкл 0,5 мг/мл образца белка, приготовленного в дегазированном буфере SEC (таком же, как используется в 1.1.1) в отдельных микроцентрифужных трубках, и нагрейте каждую трубку до определенной температуры в диапазоне от 20 °C до 90 °C (20 °C, 40 °C, 60 °C и 90 °C) в течение 10 минут на водяной бане.
    2. Затем центрифугируют термообработанные образцы при 16 200 х г в течение 10 мин при 4 °C, собирают супернатант с помощью микропипетки и вводят каждый образец индивидуально, используя инъекционный контур 500 мкл, в аналитическую колонну, предварительно уравновешенную буфером SEC при 4 °C.
    3. Позвольте хроматографии протекать при изократическом расходе 0,2-0,3 мл/мин с буфером SEC при 4 °C.
    4. Наблюдайте за положением и высотой пиков элюирования и ищите появление дополнительных пиков для различных образцов.
  3. Анализ химической стабильности гистоновых шаперонов
    1. Для изучения солевой стабильности гистоновых шаперонов инкубируют 500 мкл образца белка 0,5 мг/мл, приготовленного в буфере Tris [20 мМ Tris-HCl (рН 7,5) и 1 мМ β-ME], дополненном повышением концентрации NaCl (300 мМ, 600 мМ, 1 М, 1,5 М и 2 М) в отдельных микроцентрифужных трубках в течение 30 мин при 4 °C. Центрифугируйте образцы при 16 200 х г в течение 10 мин при 4 °C и сохраняйте супернатант.
    2. Затем загрузите образцы белка в различных концентрациях NaCl по отдельности, используя инъекционный контур 500 мкл в аналитическую колонку, предварительно уравновешенную 1,2 CV (28,8 мл) соответствующего буфера, содержащего увеличение концентраций NaCl при 4 °C.
    3. Позвольте хроматографии протекать с изократической скоростью потока 0,2-0,3 мл/мин с 1 CV (24 мл) соответствующего буфера при 4 °C.
    4. Наблюдайте за положением и высотой пиков элюирования и ищите появление дополнительных пиков для различных образцов.
    5. Аналогичным образом, для анализа стабильности мочевины инкубируют 500 мкл образца белка 0,5 мг/мл, приготовленного в буфере Tris [20 мМ Tris-HCl (рН 7,5) и 1 мМ β-ME], дополненном повышением концентрации мочевины (1 М, 2 М, 3 М, 4 М и 5 М) в отдельных микроцентрифужных трубках в течение 16 ч при комнатной температуре. Центрифугируйте образцы при 16 200 х г в течение 10 мин при комнатной температуре и удерживайте супернатант.
    6. Затем загрузите обработанные мочевиной образцы белка по отдельности с использованием инъекционного контура 500 мкл в аналитическую колонку, предварительно уравновешенную 1,2 CV (28,8 мл) соответствующего буфера, содержащего различные концентрации мочевины при комнатной температуре.
    7. Позвольте хроматографии протекать при изократической скорости потока 0,2-0,3 мл/мин с 1 CV (24 мл) соответствующего буфера при комнатной температуре.
      ВНИМАНИЕ: Не проводите эксперименты с буфером, содержащим мочевину при более низкой температуре, так как мочевина имеет тенденцию кристаллизоваться и повреждать колонну.
    8. Наблюдайте за положением и высотой пиков элюирования и ищите появление дополнительных пиков для различных образцов.

2. Анализы вытягивания на основе соляного градиента для понимания типа взаимодействий, способствующих сложному образованию между гистоновыми олигомерами и гистоновым шапероном

  1. Для каждой реакции вытягивающего анализа пипетку 40 мкл никель-NTA смолы в спиновую колонну и промывают стерильной двойной дистиллированной водой. Затем уравновешивают смолу 100 CV (4 мл) буфера равновесия [20 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, 10 мкг/мл BSA и 1 мМ β-ME] (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вытягивание также может быть выполнено в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл.
  2. Подготовьте образец путем смешивания 5 мкМ меченого Гистонового шаперона с 20 мкМ гистона H2A/H2B димера или тетрамера H3/H4 в буфере равновесия. Инкубировать образец на льду в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Димер H2A/H2B и тетрамер H3/H4 получают из рекомбинантных человеческих гистонов21, и целостность олигомеров подтверждается на основе расчетных молекулярных масс методом аналитического ультрацентрифугирования (AUC). Те же гистоновые олигомеры использовались для всех экспериментов, упомянутых ниже.
  3. Загрузите образцы в отдельные предварительно уравновешенные спиновые колонны с никель-NTA-смолой со стадии 2.1, каждая из которых помечена для определенной концентрации соли, и держите колонны в течение 30 мин при 4 °C. Центрифугирование колонн при 1000 х г в течение 1 мин.
  4. Затем промываем колонны 100 CV (4 мл) промывочного буфера [20 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 50 мМ имидазола, 0,2% Tween-20 и 1 мМ β-ME], содержащие различные концентрации солей (т.е. 300 мМ, 500 мМ, 600 мМ, 700 мМ, 800 мМ, 900 мМ и 1 М NaCl). Вымойте каждую колонку буфером, имеющим определенную концентрацию соли.
  5. После стадии промывки соли элюируют белок из различных колонок, используя 100 мкл буфера элюирования [20 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 300 мМ NaCl, 300 мМ имидазола и 1 мМ β-ME].
  6. Затем подвергайте элюированные образцы 18% SDS-PAGE22 и визуализируйте гель после окрашивания Coomassie Brilliant Blue R250 (см. Таблицу материалов). Кроме того, вы можете напрямую загрузить смолу на гель SDS-PAGE вместо того, чтобы элюировать связанный белок из смолы Ni-NTA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буферные композиции для уравновешивания, промывки и элюирования и рН могут быть изменены в зависимости от интересующего белка.

3. Конкурентный вытягивающий анализ для определения предпочтения гистонового шаперона для H2A / H2B или H3 / H4

  1. Подготовка спинового столбца, как описано в шаге 2.1
  2. Инкубировать 5 мкМ гистонового шаперона с димером H2A/H2B 20 мкМ в 300 мкл буфера равновесия (приготовленного на стадии 2.1) в течение 30 мин на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отношение гистонового олигомера к гистоновому шаперону в реакции может быть выбрано на основе известных данных стехиометрии связывания; использовать пятикратный избыток гистона, если информация отсутствует.
  3. Центрифугируйте комплекс гистонового шаперона-H2A/H2B при 16 200 х г в течение 5 мин при 4 °C для удаления любого осадка. Затем загрузите образец на спиновую колонну, предварительно уравновешенную буфером равновесия (подготовленную на стадии 2.1), и инкубируйте в течение 30 мин при 4°С.
  4. Промыть колонну со 100 CV (4 мл) промывочного буфера [20 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 300 мМ NaCl, 50 мМ имидазола, 0,2% Tween-20 и 1 мМ β-ME] для удаления избыточного димера H2A/H2B. Затем смешайте комплекс гистонового шаперона-H2A/H2B с 20-60 мкМ тетрамера H3/H4 и инкубируйте в течение 30 мин на льду.
  5. Перемойте колонну 100 CV (4 мл) промывочного буфера (подготовленного на этапе 3.4) для удаления любого несвязанного тетрамера H3/H4 и элюляции образца с использованием буфера элюирования (подготовленного на этапе 2.5). Подвергайте элюированные образцы 18% SDS-PAGE и визуализируйте после окрашивания с помощью Coomassie Brilliant Blue R250.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ может быть обратным, при этом, во-первых, тетрамер H3/H4 может быть смешан с шапероном, комплексом, разрешенным для связывания с шариками Ni-NTA, и комплекс затем инкубируется с различными концентрациями димера H2A/H2B.

4. Аналитические эксперименты по ультрацентрифугированию - скорости осаждения (AUC-SV) для анализа стехиометрии связывания между гистоновыми шаперонами и гистонами

  1. Пробоподготовка для AUC
    1. Диализуйте восстановленный диалеймер гистона H2A/H2B, тетрамер H3/H4 и шаперон гистона отдельно через отсечную диализную трубку 7 кДа23 против диализного буфера [20 мМ Tris (pH 7,5), 300 мМ NaCl и 1 мМ β-ME] (см. Таблицу материалов). Чтобы свести к минимуму фоновую ошибку из-за несоответствия буфера, широко выполняйте диализ против диализного буфера, предпочтительно три раза в течение 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальный OD280 образцов белка должен иметь в два-три раза более высокое значение для достижения конечного OD280 0,3-0,5. По сути, это делается для того, чтобы свести на нет последствия разбавления.
    2. Очистите димер H2A/H2B, тетрамер H3/H4 и гистоновый шаперон по отдельности с помощью диализного буфера, используя аналитическую размерно-эксклюзионную хроматографию (как упоминалось на этапе 1). Сохраните буфер от запуска, чтобы подготовить дальнейшие разведения в дальнейшем и использовать в качестве эталона в ячейке AUC.
  2. Загрузка образцов для AUC
    1. Смешайте очищенные белки в конечном объеме 450 мкл, используя диализный буфер со стадии 4.1.1, чтобы достичь OD280 0,3-0,6. Смешайте гистоновый шаперон с димером H2A/H2B или тетрамером H3/H4 для комплексного образования в отдельных реакционных трубках. Инкубировать белковые смеси в течение 2-3 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, данные седиментации могут быть получены с помощью интерференционной оптической сканирующей системы в аналитической ультрацентрифуге. Отдельно для смешивания очищенных белков фиксируют концентрацию гистонового шаперона и инкубируют его с возрастающими концентрациями гистоновых олигомеров для получения точной стехиометрии.
    2. Соберите ячейку с двойным сектором центральной части и кварцевыми окнами для эксперимента AUC-SV с использованием детектора поглощения аналитической ультрацентрифуги, как описано ранее в деталях24.
    3. Заполните 400 мкл раствора образца и 420 мкл диализного буфера в два сектора (образец и опорный секторы соответственно) ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Больший объем буфера используется в эталонном секторе для удержания эталонного мениска над мениском образца. Однако, используя систему оптических помех, заполните два сектора равным объемом.
    4. Взвешивайте и точно балансируйте ячейки и загружайте их в четырехместный титановый ротор (см. Таблицу материалов). Выровняйте ячейки, используя метки, указанные в нижней части ячеек и ротора. Загрузите ротор в центрифугу, закройте крышку и дайте развить вакуум до тех пор, пока давление не упадет до менее чем 15 мкм Hg и температура ротора не стабилизируется до 20 °C (обычно занимает 2-2,5 ч).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочие параметры AUC включают экспериментальную температуру, скорость вращения ротора, интервал между сканированиями и количество сканирований, которые необходимо собрать. В случае экспериментов SV интервал сканирования задается в соответствии с молекулярной массой белка; меньшие белки требуют больших временных интервалов между сканированиями. Скорость ротора также устанавливается в соответствии с ожидаемой молекулярной массой белка, и эксперимент проводится при 20 °C. Данные поглощения контролируются при 280 нм.
    5. Чтобы получить точную стехиометрию, держите концентрацию гистонового шаперона постоянной и инкубируйте с увеличением концентрации гистоновых олигомеров для достижения насыщения.
  3. Анализ данных AUC
    1. Выполните анализ данных, как описановыше 25. Вкратце рассчитайте плотность и вязкость для буферных компонентов с помощью программы SEDNTERP26 (см. Таблицу материалов). Аналогично рассчитать частичный удельный объем белка на основе его аминокислотного состава, также используя SEDNTERP.
    2. Загрузите данные с машины AUC в программу SEDFIT27 и определите мениск (красная линия), нижнюю часть ячейки (синяя линия) и границы анализа данных (зеленые линии). Выберите непрерывное распределение C(s) в качестве модели.
    3. Затем установите максимальное разрешение до 100; установленный коэффициент седиментации (с), с мин: 0 и с макс: 10-15; установить коэффициент трения на 1,2 изначально и выбрать float, чтобы получить отношение из данных; установить доверительный уровень (F-отношение; определяющее величину регуляризации) равным 0,68 для регуляризации 1 сигма; установить частичный удельный объем, плотность буфера и значения вязкости буфера, полученные из SEDNTERP.
    4. Нажмите клавишу RUN , чтобы позволить программному обеспечению решить уравнение Ламма27. Настройте параметры, если есть значительное несоответствие данных. После настройки параметров нажмите FIT , чтобы уточнить все параметры. Оцените качество подгонки на основе значения среднеквадратичного отклонения (RMSD), которое должно быть меньше 0,01 единицы сигнала.
    5. Оцените молекулярные массы пиков, выбрав опцию: показать пик «Mw в c(s)» в функции отображения главной панели инструментов, которая предоставит информацию о 's' молекулы/комплекса.

5. Плазмидный суперспиральный анализ для подтверждения функции шаперонирования гистонов

  1. Реакция сборки нуклеосом
    1. Смешайте 2 мкМ тетрамера H3/H4 и 4 мкМ димера H2A/H2B с возрастающими концентрациями гистонового шаперона (1-6 мкМ) в сборочном буфере [20 мМ Tris HCl (рН 7,5), 1 мМ DTT, 1 мМ MgCl2, 0,1 мг/мл BSA и 100 мМ NaCl] до конечного объема 50 мкл. Инкубировать смесь при 4 °C в течение 30 мин.
    2. Одновременно в отдельной реакции предварительно обрабатывают 500 нг отрицательно перемощенной плазмиды pUC19 1 мкг фермента топоизомеразы I (см. Таблицу материалов) в сборочном буфере в конечном объеме 50 мкл и инкубируют при 30 °С в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Топоизомераза I расслабляет суперспиратированную двухцепочечную плазмидную ДНК, генерируя одноцепочечный ник. Может быть использован фермент топоизомеразы I эукариотического происхождения, такой как коммерчески доступная топоизомераза зародышей пшеницы I или рекомбинантно экспрессированная Drosophila melanogaster topoisomerase I.
    3. Затем смешайте тетрамер H3/H4, димер H2A/H2B, смесь гистоновых шаперонов (со стадии 5.1.1), расслабленную реакционную смесь плазмидной ДНК (из стадии 5.1.2) и инкубируйте далее при 30 °C в течение 90 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка двух контрольных реакций для анализа; один из них имеет гистоновый шаперон и расслабленную плазмидную ДНК (но не гистоны), а другой имеет гистоновые олигомеры и расслабленную плазмидную ДНК (но не гистоновый шаперон).
    4. Остановите реакцию сборки, добавив 100 мкл 2x стоп-буфера (40 мМ ЭДТА, 2% SDS и 0,4 мг/мл протеиназы K) и инкубируйте при 37 °C в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стоп-буфер депротеинизирует плазмидную ДНК путем денатурации и протеолиза связанных гистонов.
  2. Экстракция фенол-хлороформа и осаждение этанола
    1. Добавьте равный объем насыщенного трисом фенола в пробирку, содержащую реакционную смесь со стадии 5.1.4, и хорошо перемешайте с последующим центрифугированием при 16 200 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    2. Аккуратно соберите верхнюю водную фазу, имеющую плазмидную ДНК, микропипеткой и смешайте с равным объемом хлороформа. Вращайте смесь и центрифугу при 16 200 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изоамиловый спирт может быть включен на этом этапе, чтобы избежать нечеткой границы раздела между водной и органической фазами.
    3. Далее собирают верхнюю водную фазу, добавляют 1/10-й объем 3 М ацетата натрия (рН 5,5) и 2,5 объема ледяного этанола (см. Таблицу материалов). Хорошо перемешайте раствор, перевернув пробирку 3-4 раза и выдерживайте смесь в морозильной камере -20 °C в течение 30 мин для полного осаждения плазмидной ДНК.
    4. Центрифугируйте образец со стадии 5.2.3 при 16200 х г в течение 10 мин и осторожно выбросьте супернатант. Держите трубки открытыми при комнатной температуре, пока даже следовые количества этанола не испарятся, оставляя осажденную плазмидную ДНК в трубке.
  3. Выполняют электрофорез агарозного геля для наблюдения за плазмидным суперспиральным эффектом.
    1. Растворить осажденную плазмидную ДНК со стадии 5.2.4 в стерильной двойной дистиллированной воде.
    2. Разрешите образцы на 1% агарозном геле в 1x буфере Tris-ацетат-ЭДТА (TAE) (40 мМ Tris, 20 мМ уксусной кислоты и 1 мМ ЭДТА) (см. Таблицу материалов).
    3. Окрашивают гель с концентрацией бромида этидия 0,2-0,5 мкг/мл и наблюдают под ультрафиолетовым излучением для визуализации полос ДНК на геле.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рекомбинантный N-концевой нуклеоплазминовый домен белка FKBP53 из Arabidopsis thaliana был подвергнут аналитическому SEC. Пиковый объем элюирования был построен против стандартной кривой, чтобы определить его олигомерное состояние. Результаты анализа SEC показали, что домен существует в виде пентамера в растворе, с приближенной молекулярной массой 58 кДа (рисунок 1A,B). Далее нуклеоплазминовый домен анализировали на термическую и химическую стабильность совместно с ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа демонстрирует и подтверждает всеобъемлющий набор протоколов для биохимической и биофизической характеристики предполагаемого гистонового шаперона. При этом для демонстрации протоколов использовали рекомбинантно экспрессированные и очищенные белки семейства NAP, AtNRP1 и AtNRP2, а также N-концевой нуклеоплазминовый домен AtFKBP53. Тот же набор экспериментов вполне может быть использован для очерчивания функциональных атрибутов ранее нехарактеризованных гистоновых шаперонов любого организма.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

О конфликте интересов заявлено не было.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Заочные гранты Дилипу Васудевану от Совета по научным и инженерным исследованиям правительства Индии [CRG/2018/000695/PS] и Департамента биотехнологии Министерства науки и технологий правительства Индии [BT/INF/22/SP33046/2019], а также внутренняя поддержка со стороны Института наук о жизни Бхубанешвара. Мы благодарим г-жу Судешну Сен и г-жу Аннапурну Саху за их помощь в приготовлении гистонов. Приветствуются также дискуссии с нашими коллегами д-ром Чинмайи Мохапатрой, г-ном Манасом Кумаром Джагдевым и д-ром Шейхом Наусадом Хоссейном.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Уксусная кислота (ледяная)SigmaA6283
AcrylamideMP Biomedicals814326
AgaroseMP Biomedicals193983
AKTA Pure 25M FPLCCytiva29018226Инструмент для очистки белка
персульфата аммония (APS)SigmaA3678
An-60Ti роторBeckman Coulter361964Ротор для аналитического ультрацентрифугирования
Бычий сывороточный альбумин (БСА)SigmaA7030
ХлороформSigmaC2432
Coomassie brilliant blue R 250Sigma1.15444
Диализная трубка (отсечка 7 кДа)Thermo Fisher68700Для диализа образцов белка
Дитиотреитол ( DTT)MP Biomedicals100597
ДНК-загрузочный красительNew England BiolabsB7025S
EDTA динатриевая сольMP Biomedicals194822
Электронные весыShimadzuATX224R
этанолSigmaE7023
Бромид этидия (EtBr)SigmaE8751
Gel Doc СистемаBio-Rad12009077Для визуализации гелей после окрашивания
Аппарат для горизонтального гель-электрофорезаBio-Rad1704405Инструмент для электрофореза в агарозном геле
Соляная кислота (HCl)Sigma320331
имидазолMP Biomedicals102033
Магния хлорид (MgCl2)SigmaM8266
МикропипеткиEppendorfZ683779Для пипетирования микрообъемов
Система электрофореза Mini-PROTEANBio-RAD1658000Прибор для SDS-PAGE
N,N-метилен-бис-акриламидMP Biomedicals800172
Nano dropThermo FisherND-2000Для измерения концентраций
Ni-NTA agaroseInvitrogenR901-15Гранулы смолы для вытягивающего анализа
Optima AUC аналитическая ультрацентрифугаBeckman CoulterB86437Прибор для аналитического ультрацентрифугирования
pH-метрMettler ToledoMT30130863
PhenolSigmaP4557
Набор для выделения плазмидQiagen27104
Протеиназа KSigma-Aldrich1.07393
pUC19Thermo FisherSD0061Плазмида для анализа суперкойлинга
Охлаждаемая высокоскоростная центрифугаThermo Fisher75002402
SDS-PAGE белковый маркерBio-Rad1610317
SEDFITБесплатное программное обеспечение для аналитических данных ультрацентрифугирования
анализ SEDNTERPБесплатное программное обеспечение для оценки вязкости и плотности буфера и частичного удельного объема белка
SigmaPrep Spin ColumnsSigmaSC1000Для понижающего анализа
Ацетат натрияSigmaS2889
Хлорид натрия (NaCl)MerckS9888
Додецилсульфат натрия (SDS)MP Biomedicals102918
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva28990944Колонка для аналитической эксклюзионной хроматографии
Superdex 75 Increase 10/300 GLCytiva29148721Колонка для аналитической эксклюзионной хроматографии
TEMEDSigma1.10732
Топоизомераза IInspiralisWGT102Фермент, используемый в плазмидный суперспиральный анализ
трис основаниеMerckT1503
Tween-20SigmaP1379
МочевинаMP Biomedicals191450
Водяная баняNü veNB 5Для термической обработки образцов белка
&бета;-меркаптоэтанола (β-ME)SigmaM6250
белков и ДНК

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
  2. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  3. Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
  4. Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
  5. Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
  6. Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
  7. Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
  8. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  9. Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
  10. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  11. Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
  12. Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
  13. Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
  14. Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
  15. Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
  16. Elsässer, S. J., D'Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
  17. Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111(2004).
  18. Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
  19. Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
  20. Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
  21. Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
  22. Scofield, B. T. K. H. Protein Electrophoresis. , (2012).
  23. Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
  24. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530(2009).
  25. Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625(2019).
  26. Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 20, Unit20.12 (2013).
  27. Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  28. Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258(2019).
  29. Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809(2017).
  30. Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
  31. Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
  32. Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
  33. Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487(2019).
  34. Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
  35. Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
  36. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  37. Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
  38. Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
  39. Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
  40. Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608(2012).
  41. Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Histone ChaperonesChromatin AssemblyPull Down AssayAnalytical UltracentrifugationSize Exclusion ChromatographyPlasmid Super CoilingNucleosome AssemblyH2A H2B DimerH3 H4 TetramerProtein DNA Interaction

Related Articles