В пробирке Характеристика гистоновых шаперонов с использованием аналитических, вытягивающих и шаперонных анализов

Нуклеосомы, состоящие из ДНК и гистоновых белков, образуют структурную единицу хроматина и регулируют несколько критических клеточных событий. Нуклеосомы динамически репозиционируются и реконструируются, чтобы сделать ДНК доступной для различных процессов, таких как репликация, транскрипция и трансляция ^1,2. Гистоны, которые являются очень основными, либо имеют тенденцию взаимодействовать с кислыми белками в клеточной среде, либо подвергаются агрегации, что приводит к различным клеточным дефектам ^3,4,5. Группа выделенных белков, называемых гистоновыми шаперонами, помогает транспорту гистонов из цитоплазмы в ядро и предотвращает аберрантные события агрегации гистон-ДНК ^6,7. По сути, большинство гистоновых шаперонов хранят и переносят гистоны на ДНК с физиологической ионной силой, тем самым способствуя образованию нуклеосом ^8,9. Некоторые гистоновые шапероны имеют определенное предпочтение гистоновым олигомерам H2A/H2B или H3/H4¹⁰.

Гистоновые шапероны характеризуются на основе их способности собирать нуклеосомы, зависимые или независимые от синтеза ДНК¹¹. Например, фактор сборки хроматина-1 (CAF-1) зависит, в то время как гистоновый регулятор A (HIRA) не зависит от синтеза ДНК^12,13. Аналогичным образом, семейство нуклеоплазминов гистоновых шаперонов участвует в деконденсации хроматина сперматозоидов и сборке нуклеосом¹⁴. Члены семейства нуклеосомных сборочных белков (NAP) способствуют образованию нуклеосомоподобных структур in vitro и участвуют в перемещении гистонов между цитоплазмой и ядром¹⁵. Нуклеоплазмины и белки семейства NAP являются функциональными гистоновыми шаперонами, но не имеют общих структурных особенностей. По сути, ни одна структурная особенность не позволяет классифицировать белок как гистоновый шаперон¹⁶. Использование функциональных и биофизических анализов наряду со структурными исследованиями лучше всего подходит для характеристики гистоновых шаперонов.

В этой работе описываются биохимические и биофизические методы характеристики белка как гистонового шаперона, который помогает сборке нуклеосом. Сначала была проведена аналитическая размерно-эксклюзионная хроматография для анализа олигомерного статуса и стабильности гистоновых шаперонов. Затем был проведен вытягивающий анализ для определения движущих сил и конкурентного характера взаимодействий гистон-шаперон-гистон. Однако гидродинамические параметры этих взаимодействий не могут быть точно рассчитаны с помощью аналитической размерно-эксклюзионной хроматографии из-за формы белка и его комплексов, которые влияют на их миграцию через столб. Поэтому было использовано аналитическое ультрацентрифугирование, которое обеспечивает макромолекулярные свойства в растворе, которые включают точную молекулярную массу, стехиометрию взаимодействия и форму биологических молекул. В прошлых исследованиях широко использовался анализ гистонов in vitro для функциональной характеристики гистоновых шаперонов, таких как yScS116¹⁷, DmACF¹⁸, ScRTT106p¹⁹, HsNPM1²⁰. Анализ гистонового шаперонирования также использовался для функциональной характеристики белков как гистоновых шаперонов.

1. Аналитическая размерно-эксклюзионная хроматография для выяснения олигомерного статуса и стабильности гистоновых шаперонов

1. Анализ олигомерного статуса гистоновых шаперонов
   1. Уравновешивайте колонку аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC) объемом 24 мл с объемом 1,2 столбца (CV), т.е. 28,8 мл дегазированного буфера SEC [20 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 300 мМ NaCl и 1 мМ β-меркаптоэтанола (β-ME)] при 4 °C (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тип столбца, буферный состав и буферный рН могут быть выбраны на основе интересующего белка. Объем впрыска образца не должен превышать 500 мкл для колонки объемом 24 мл. Кроме того, давление в колонне должно поддерживаться ниже 5 МПа.
   2. Из раствора белка с более высокой концентрацией приготовьте 500 мкл образца белка 0,5 мг/мл в дегазированном буфере SEC и введите его в предварительно уравновешенную колонну с использованием инъекционной петли 500 мкл. Позвольте хроматографии протекать при изократическом расходе 0,2-0,3 мл/мин с буфером SEC при 4 °C.
   3. Мониторинг профиля элюирования белка путем измерения поглощения на длине волны 280 нм. При работе с белками, лишенными ароматических остатков, измерьте абсорбцию на уровне 214 нм.
   4. Используйте объем элюирования белка для расчета его приблизительной молекулярной массы в кДа с использованием стандартной калибровочной кривой²¹.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровочная кривая получается путем построения удерживающего объема известных молекулярно-весовых белков против логарифма их соответствующих молекулярных масс (log Mr), элюированного с использованием той же колонки.
2. Анализ термической стабильности гистоновых шаперонов
   1. Возьмите 500 мкл 0,5 мг/мл образца белка, приготовленного в дегазированном буфере SEC (таком же, как используется в 1.1.1) в отдельных микроцентрифужных трубках, и нагрейте каждую трубку до определенной температуры в диапазоне от 20 °C до 90 °C (20 °C, 40 °C, 60 °C и 90 °C) в течение 10 минут на водяной бане.
   2. Затем центрифугируют термообработанные образцы при 16 200 х г в течение 10 мин при 4 °C, собирают супернатант с помощью микропипетки и вводят каждый образец индивидуально, используя инъекционный контур 500 мкл, в аналитическую колонну, предварительно уравновешенную буфером SEC при 4 °C.
   3. Позвольте хроматографии протекать при изократическом расходе 0,2-0,3 мл/мин с буфером SEC при 4 °C.
   4. Наблюдайте за положением и высотой пиков элюирования и ищите появление дополнительных пиков для различных образцов.
3. Анализ химической стабильности гистоновых шаперонов
   1. Для изучения солевой стабильности гистоновых шаперонов инкубируют 500 мкл образца белка 0,5 мг/мл, приготовленного в буфере Tris [20 мМ Tris-HCl (рН 7,5) и 1 мМ β-ME], дополненном повышением концентрации NaCl (300 мМ, 600 мМ, 1 М, 1,5 М и 2 М) в отдельных микроцентрифужных трубках в течение 30 мин при 4 °C. Центрифугируйте образцы при 16 200 х г в течение 10 мин при 4 °C и сохраняйте супернатант.
   2. Затем загрузите образцы белка в различных концентрациях NaCl по отдельности, используя инъекционный контур 500 мкл в аналитическую колонку, предварительно уравновешенную 1,2 CV (28,8 мл) соответствующего буфера, содержащего увеличение концентраций NaCl при 4 °C.
   3. Позвольте хроматографии протекать с изократической скоростью потока 0,2-0,3 мл/мин с 1 CV (24 мл) соответствующего буфера при 4 °C.
   4. Наблюдайте за положением и высотой пиков элюирования и ищите появление дополнительных пиков для различных образцов.
   5. Аналогичным образом, для анализа стабильности мочевины инкубируют 500 мкл образца белка 0,5 мг/мл, приготовленного в буфере Tris [20 мМ Tris-HCl (рН 7,5) и 1 мМ β-ME], дополненном повышением концентрации мочевины (1 М, 2 М, 3 М, 4 М и 5 М) в отдельных микроцентрифужных трубках в течение 16 ч при комнатной температуре. Центрифугируйте образцы при 16 200 х г в течение 10 мин при комнатной температуре и удерживайте супернатант.
   6. Затем загрузите обработанные мочевиной образцы белка по отдельности с использованием инъекционного контура 500 мкл в аналитическую колонку, предварительно уравновешенную 1,2 CV (28,8 мл) соответствующего буфера, содержащего различные концентрации мочевины при комнатной температуре.
   7. Позвольте хроматографии протекать при изократической скорости потока 0,2-0,3 мл/мин с 1 CV (24 мл) соответствующего буфера при комнатной температуре.
      ВНИМАНИЕ: Не проводите эксперименты с буфером, содержащим мочевину при более низкой температуре, так как мочевина имеет тенденцию кристаллизоваться и повреждать колонну.
   8. Наблюдайте за положением и высотой пиков элюирования и ищите появление дополнительных пиков для различных образцов.

2. Анализы вытягивания на основе соляного градиента для понимания типа взаимодействий, способствующих сложному образованию между гистоновыми олигомерами и гистоновым шапероном

1. Для каждой реакции вытягивающего анализа пипетку 40 мкл никель-NTA смолы в спиновую колонну и промывают стерильной двойной дистиллированной водой. Затем уравновешивают смолу 100 CV (4 мл) буфера равновесия [20 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, 10 мкг/мл BSA и 1 мМ β-ME] (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вытягивание также может быть выполнено в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл.
2. Подготовьте образец путем смешивания 5 мкМ меченого Гистонового шаперона с 20 мкМ гистона H2A/H2B димера или тетрамера H3/H4 в буфере равновесия. Инкубировать образец на льду в течение 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Димер H2A/H2B и тетрамер H3/H4 получают из рекомбинантных человеческих гистонов²¹, и целостность олигомеров подтверждается на основе расчетных молекулярных масс методом аналитического ультрацентрифугирования (AUC). Те же гистоновые олигомеры использовались для всех экспериментов, упомянутых ниже.
3. Загрузите образцы в отдельные предварительно уравновешенные спиновые колонны с никель-NTA-смолой со стадии 2.1, каждая из которых помечена для определенной концентрации соли, и держите колонны в течение 30 мин при 4 °C. Центрифугирование колонн при 1000 х г в течение 1 мин.
4. Затем промываем колонны 100 CV (4 мл) промывочного буфера [20 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 50 мМ имидазола, 0,2% Tween-20 и 1 мМ β-ME], содержащие различные концентрации солей (т.е. 300 мМ, 500 мМ, 600 мМ, 700 мМ, 800 мМ, 900 мМ и 1 М NaCl). Вымойте каждую колонку буфером, имеющим определенную концентрацию соли.
5. После стадии промывки соли элюируют белок из различных колонок, используя 100 мкл буфера элюирования [20 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 300 мМ NaCl, 300 мМ имидазола и 1 мМ β-ME].
6. Затем подвергайте элюированные образцы 18% SDS-PAGE²² и визуализируйте гель после окрашивания Coomassie Brilliant Blue R250 (см. Таблицу материалов). Кроме того, вы можете напрямую загрузить смолу на гель SDS-PAGE вместо того, чтобы элюировать связанный белок из смолы Ni-NTA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буферные композиции для уравновешивания, промывки и элюирования и рН могут быть изменены в зависимости от интересующего белка.

3. Конкурентный вытягивающий анализ для определения предпочтения гистонового шаперона для H2A / H2B или H3 / H4

1. Подготовка спинового столбца, как описано в шаге 2.1
2. Инкубировать 5 мкМ гистонового шаперона с димером H2A/H2B 20 мкМ в 300 мкл буфера равновесия (приготовленного на стадии 2.1) в течение 30 мин на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отношение гистонового олигомера к гистоновому шаперону в реакции может быть выбрано на основе известных данных стехиометрии связывания; использовать пятикратный избыток гистона, если информация отсутствует.
3. Центрифугируйте комплекс гистонового шаперона-H2A/H2B при 16 200 х г в течение 5 мин при 4 °C для удаления любого осадка. Затем загрузите образец на спиновую колонну, предварительно уравновешенную буфером равновесия (подготовленную на стадии 2.1), и инкубируйте в течение 30 мин при 4°С.
4. Промыть колонну со 100 CV (4 мл) промывочного буфера [20 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 300 мМ NaCl, 50 мМ имидазола, 0,2% Tween-20 и 1 мМ β-ME] для удаления избыточного димера H2A/H2B. Затем смешайте комплекс гистонового шаперона-H2A/H2B с 20-60 мкМ тетрамера H3/H4 и инкубируйте в течение 30 мин на льду.
5. Перемойте колонну 100 CV (4 мл) промывочного буфера (подготовленного на этапе 3.4) для удаления любого несвязанного тетрамера H3/H4 и элюляции образца с использованием буфера элюирования (подготовленного на этапе 2.5). Подвергайте элюированные образцы 18% SDS-PAGE и визуализируйте после окрашивания с помощью Coomassie Brilliant Blue R250.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ может быть обратным, при этом, во-первых, тетрамер H3/H4 может быть смешан с шапероном, комплексом, разрешенным для связывания с шариками Ni-NTA, и комплекс затем инкубируется с различными концентрациями димера H2A/H2B.

4. Аналитические эксперименты по ультрацентрифугированию - скорости осаждения (AUC-SV) для анализа стехиометрии связывания между гистоновыми шаперонами и гистонами

1. Пробоподготовка для AUC
   1. Диализуйте восстановленный диалеймер гистона H2A/H2B, тетрамер H3/H4 и шаперон гистона отдельно через отсечную диализную трубку 7 кДа²³ против диализного буфера [20 мМ Tris (pH 7,5), 300 мМ NaCl и 1 мМ β-ME] (см. Таблицу материалов). Чтобы свести к минимуму фоновую ошибку из-за несоответствия буфера, широко выполняйте диализ против диализного буфера, предпочтительно три раза в течение 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальный OD₂₈₀ образцов белка должен иметь в два-три раза более высокое значение для достижения конечного OD₂₈₀ 0,3-0,5. По сути, это делается для того, чтобы свести на нет последствия разбавления.
   2. Очистите димер H2A/H2B, тетрамер H3/H4 и гистоновый шаперон по отдельности с помощью диализного буфера, используя аналитическую размерно-эксклюзионную хроматографию (как упоминалось на этапе 1). Сохраните буфер от запуска, чтобы подготовить дальнейшие разведения в дальнейшем и использовать в качестве эталона в ячейке AUC.
2. Загрузка образцов для AUC
   1. Смешайте очищенные белки в конечном объеме 450 мкл, используя диализный буфер со стадии 4.1.1, чтобы достичь OD₂₈₀ 0,3-0,6. Смешайте гистоновый шаперон с димером H2A/H2B или тетрамером H3/H4 для комплексного образования в отдельных реакционных трубках. Инкубировать белковые смеси в течение 2-3 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, данные седиментации могут быть получены с помощью интерференционной оптической сканирующей системы в аналитической ультрацентрифуге. Отдельно для смешивания очищенных белков фиксируют концентрацию гистонового шаперона и инкубируют его с возрастающими концентрациями гистоновых олигомеров для получения точной стехиометрии.
   2. Соберите ячейку с двойным сектором центральной части и кварцевыми окнами для эксперимента AUC-SV с использованием детектора поглощения аналитической ультрацентрифуги, как описано ранее в деталях²⁴.
   3. Заполните 400 мкл раствора образца и 420 мкл диализного буфера в два сектора (образец и опорный секторы соответственно) ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Больший объем буфера используется в эталонном секторе для удержания эталонного мениска над мениском образца. Однако, используя систему оптических помех, заполните два сектора равным объемом.
   4. Взвешивайте и точно балансируйте ячейки и загружайте их в четырехместный титановый ротор (см. Таблицу материалов). Выровняйте ячейки, используя метки, указанные в нижней части ячеек и ротора. Загрузите ротор в центрифугу, закройте крышку и дайте развить вакуум до тех пор, пока давление не упадет до менее чем 15 мкм Hg и температура ротора не стабилизируется до 20 °C (обычно занимает 2-2,5 ч).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочие параметры AUC включают экспериментальную температуру, скорость вращения ротора, интервал между сканированиями и количество сканирований, которые необходимо собрать. В случае экспериментов SV интервал сканирования задается в соответствии с молекулярной массой белка; меньшие белки требуют больших временных интервалов между сканированиями. Скорость ротора также устанавливается в соответствии с ожидаемой молекулярной массой белка, и эксперимент проводится при 20 °C. Данные поглощения контролируются при 280 нм.
   5. Чтобы получить точную стехиометрию, держите концентрацию гистонового шаперона постоянной и инкубируйте с увеличением концентрации гистоновых олигомеров для достижения насыщения.
3. Анализ данных AUC
   1. Выполните анализ данных, как описано^{выше 25}. Вкратце рассчитайте плотность и вязкость для буферных компонентов с помощью программы SEDNTERP²⁶ (см. Таблицу материалов). Аналогично рассчитать частичный удельный объем белка на основе его аминокислотного состава, также используя SEDNTERP.
   2. Загрузите данные с машины AUC в программу SEDFIT²⁷ и определите мениск (красная линия), нижнюю часть ячейки (синяя линия) и границы анализа данных (зеленые линии). Выберите непрерывное распределение C(s) в качестве модели.
   3. Затем установите максимальное разрешение до 100; установленный коэффициент седиментации (с), с мин: 0 и с макс: 10-15; установить коэффициент трения на 1,2 изначально и выбрать float, чтобы получить отношение из данных; установить доверительный уровень (F-отношение; определяющее величину регуляризации) равным 0,68 для регуляризации 1 сигма; установить частичный удельный объем, плотность буфера и значения вязкости буфера, полученные из SEDNTERP.
   4. Нажмите клавишу RUN , чтобы позволить программному обеспечению решить уравнение Ламма²⁷. Настройте параметры, если есть значительное несоответствие данных. После настройки параметров нажмите FIT , чтобы уточнить все параметры. Оцените качество подгонки на основе значения среднеквадратичного отклонения (RMSD), которое должно быть меньше 0,01 единицы сигнала.
   5. Оцените молекулярные массы пиков, выбрав опцию: показать пик «Mw в c(s)» в функции отображения главной панели инструментов, которая предоставит информацию о 's' молекулы/комплекса.

5. Плазмидный суперспиральный анализ для подтверждения функции шаперонирования гистонов

1. Реакция сборки нуклеосом
   1. Смешайте 2 мкМ тетрамера H3/H4 и 4 мкМ димера H2A/H2B с возрастающими концентрациями гистонового шаперона (1-6 мкМ) в сборочном буфере [20 мМ Tris HCl (рН 7,5), 1 мМ DTT, 1 мМ MgCl₂, 0,1 мг/мл BSA и 100 мМ NaCl] до конечного объема 50 мкл. Инкубировать смесь при 4 °C в течение 30 мин.
   2. Одновременно в отдельной реакции предварительно обрабатывают 500 нг отрицательно перемощенной плазмиды pUC19 1 мкг фермента топоизомеразы I (см. Таблицу материалов) в сборочном буфере в конечном объеме 50 мкл и инкубируют при 30 °С в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Топоизомераза I расслабляет суперспиратированную двухцепочечную плазмидную ДНК, генерируя одноцепочечный ник. Может быть использован фермент топоизомеразы I эукариотического происхождения, такой как коммерчески доступная топоизомераза зародышей пшеницы I или рекомбинантно экспрессированная Drosophila melanogaster topoisomerase I.
   3. Затем смешайте тетрамер H3/H4, димер H2A/H2B, смесь гистоновых шаперонов (со стадии 5.1.1), расслабленную реакционную смесь плазмидной ДНК (из стадии 5.1.2) и инкубируйте далее при 30 °C в течение 90 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка двух контрольных реакций для анализа; один из них имеет гистоновый шаперон и расслабленную плазмидную ДНК (но не гистоны), а другой имеет гистоновые олигомеры и расслабленную плазмидную ДНК (но не гистоновый шаперон).
   4. Остановите реакцию сборки, добавив 100 мкл 2x стоп-буфера (40 мМ ЭДТА, 2% SDS и 0,4 мг/мл протеиназы K) и инкубируйте при 37 °C в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стоп-буфер депротеинизирует плазмидную ДНК путем денатурации и протеолиза связанных гистонов.
2. Экстракция фенол-хлороформа и осаждение этанола
   1. Добавьте равный объем насыщенного трисом фенола в пробирку, содержащую реакционную смесь со стадии 5.1.4, и хорошо перемешайте с последующим центрифугированием при 16 200 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
   2. Аккуратно соберите верхнюю водную фазу, имеющую плазмидную ДНК, микропипеткой и смешайте с равным объемом хлороформа. Вращайте смесь и центрифугу при 16 200 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изоамиловый спирт может быть включен на этом этапе, чтобы избежать нечеткой границы раздела между водной и органической фазами.
   3. Далее собирают верхнюю водную фазу, добавляют 1/10-й объем 3 М ацетата натрия (рН 5,5) и 2,5 объема ледяного этанола (см. Таблицу материалов). Хорошо перемешайте раствор, перевернув пробирку 3-4 раза и выдерживайте смесь в морозильной камере -20 °C в течение 30 мин для полного осаждения плазмидной ДНК.
   4. Центрифугируйте образец со стадии 5.2.3 при 16200 х г в течение 10 мин и осторожно выбросьте супернатант. Держите трубки открытыми при комнатной температуре, пока даже следовые количества этанола не испарятся, оставляя осажденную плазмидную ДНК в трубке.
3. Выполняют электрофорез агарозного геля для наблюдения за плазмидным суперспиральным эффектом.
   1. Растворить осажденную плазмидную ДНК со стадии 5.2.4 в стерильной двойной дистиллированной воде.
   2. Разрешите образцы на 1% агарозном геле в 1x буфере Tris-ацетат-ЭДТА (TAE) (40 мМ Tris, 20 мМ уксусной кислоты и 1 мМ ЭДТА) (см. Таблицу материалов).
   3. Окрашивают гель с концентрацией бромида этидия 0,2-0,5 мкг/мл и наблюдают под ультрафиолетовым излучением для визуализации полос ДНК на геле.

Рекомбинантный N-концевой нуклеоплазминовый домен белка FKBP53 из Arabidopsis thaliana был подвергнут аналитическому SEC. Пиковый объем элюирования был построен против стандартной кривой, чтобы определить его олигомерное состояние. Результаты анализа SEC показали, что домен существует в виде пентамера в растворе, с приближенной молекулярной массой 58 кДа (рисунок 1A,B). Далее нуклеоплазминовый домен анализировали на термическую и химическую стабильность совместно с аналитическим SEC. Образец нуклеоплазмина, подвергшийся термической обработке до 90 °C, не показал видимого сдвига в объеме элюирования и пиковой высоте по сравнению с образцами, поддерживаемыми при 20 °C, что позволяет предположить, что домен является высоко термостабильным (рисунок 1C). Аналогичным образом, нуклеоплазминовый домен отображал стабильность соли до 2 М NaCl (рисунок 1D) и стабильность мочевины до 4 М (рисунок 1E). Однако пентамер нуклеоплазмина начал диссоциировать в более высоких концентрациях мочевины.

Выполнен вытягивающий анализ для определения типа взаимодействий, способствующих образованию комплекса между гистоновым шапероном (нуклеоплазминовый домен AtFKBP53) и гистоновыми олигомерами H2A/H2B димера и тетрамера H3/H4 с использованием градиентной солевой промывки. Взаимодействие нуклеоплазминового домена с димером H2A/H2B было стабильным до концентрации соли 0,4 M NaCl (рисунок 2A). Для сравнения, связь с H3/H4 была достаточно стабильной до 0,7 M NaCl (рисунок 2B). Способность шаперон-гистоновых комплексов выдерживать высокую концентрацию соли предполагает роль гидрофобных взаимодействий в стабилизации комплексов. Шаперонный комплекс с H3/H4 стабилен даже в высоких концентрациях соли, что предполагает преобладающую роль гидрофобных взаимодействий в образовании комплекса. Более низкая стабильность комплекса H2A/H2B-шаперонов в высоких концентрациях соли выявляет значительную роль электростатических взаимодействий в образовании комплекса. В другом эксперименте вытягивающий анализ использовался для изучения того, предпочитает ли шаперон димер H2A/H2B или тетрамер H3/H4. Результаты показали, что шаперон связывается с димером H2A/H2B и тетрамером H3/H4 одновременно и независимо от порядка, в котором они добавляются к шаперону (рисунок 2C,D). Это указывало на то, что шаперон обладает отдельными участками для своего взаимодействия с гистоновыми олигомерами.

Эксперименты AUC-SV (рисунок 3) проводились для изучения стехиометрии взаимодействия между гистоновыми олигомерами и шаперонами. Анализ данных AUC-SV обеспечил значение коэффициента (коэффициентов) осаждения 5,40 S для нуклеоплазминового домена AtFKBP53 в комплексе с H2A/H2B, что соответствовало молекулярной массе 104 кДа. Комплекс нуклеоплазминового домена с H3/H4 дал значение коэффициента осаждения 7,35 S, соответствующее 129 кДа. Расчетная молекулярная масса комплексов показывает, что пентамерный нуклеоплазмин образует комплекс как с димером H2A/H2B, так и с тетрамером H3/H4 в стехиометрии 1:1.

Важно показать, что белок может откладывать гистоновые олигомеры на ДНК, чтобы подтвердить, что это гистоновый шаперон. С этой целью был принят плазмидный суперспиральный анализ (рисунок 4). Расслабленную круглую плазмиду инкубировали с гистоновыми олигомерами H2A/H2B и H3/H4 с рекомбинантными растительными гистоновыми шаперонами семейства NAP - AtNRP1 и AtNRP228. Присутствие шаперона увеличило количество суперспирализованной плазмиды, предполагая, что он может откладывать гистоны на ДНК с образованием нуклеосом, вызывая суперспирали ДНК.

Рисунок 1: Олигомерное состояние и стабильность нуклеоплазминового домена AtFBP53. (A) Аналитический размерно-эксклюзионный хроматографический профиль нуклеоплазминового домена AtFKBP53. (B) Калибровочная кривая, полученная с использованием шаровидных белков известной молекулярной массы. Синие точки представляют молекулярную массу известных белков, тогда как красная точка представляет нуклеоплазминовый домен AtFKBP53. (440 кДа - ферритин, 158 кДа-альдолаза, 75 кДа-кон альбумин, 44 кДа-овальбумин, 6,5 кДа-апротинин). (C) Аналитическая размерно-исключающая хроматограмма 500 мкл 0,5 мг/мл AtFKBP53 нуклеоплазминового домена, подвергнутого термической обработке при различных температурах: 20 °C (зеленый), 40 °C (оранжевый), 60 °C (черный), 90 °C (светло-синий). (D) Аналитическая размерно-исключающая хроматограмма 500 мкл 0,5 мг/мл Нуклеоплазминового домена AtFKBP53 в буферах, содержащих различные концентрации NaCl: 0,3 М (фиолетовый), 0,6 М (красный), 1,0 М (голубой), 1,5 М (зеленый), 2,0 М (черный). (E) Аналитическая размерно-исключающая хроматограмма нуклеоплазминового домена AtFKBP53 в буферах с различными концентрациями мочевины: 0 М (контроль; голубой), 1,0 М (розовый), 2,0 М (черный), 3,0 М (темно-синий), 4,0 М (зеленый), 5,0 М (коричневый). Пентамер нуклеоплазмина демонстрирует высокую устойчивость к термическим и химическим стрессовым условиям. Рисунок взят из ссылки21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Вытягивающие анализы взаимодействия нуклеоплазминового домена AtFKBP53 с гистоновыми олигомерами. Здесь представлено 18% изображений SDS-PAGE фракций элюирования из анализов. В качестве отрицательного контроля здесь использовался вытягивающий анализ на димер (A) 20 мкМ H2A/H2B и (B) 20 мкМ H3/H4 с 5 мкМ нуклеоплазминовым доменом AtFKBP53 в возрастающих концентрациях NaCl в диапазоне 0,3 М, 0,5 М, 0,6 М, 0,7 М, 0,8 М, 0,9 М и 1,0 М. 5 мкМ AtFKBP53 FKBD. Для эксперимента по конкурентному связыванию была использована смесь 5 мкМ нуклеоплазминового домена AtFKBP53 и тетрамера 20 мкМ H3/H4, инкубированного с диапазоном 20-60 мкМ димера H2A/H2B, и (D) смесь 5 мкМ нуклеоплазминового домена AtFKBP53 и димера H2A/H2B 20 мкМ, инкубированного с диапазоном 20-60 мкМ H3/H4 тетрамера. Метка AtFKBP53 соответствует нуклеоплазминовому домену AtFKBP53. Элюционные фракции показывают одновременное связывание обоих гистоновых олигомеров с нуклеоплазмином. Рисунок взят из ссылки21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Аналитическое ультрацентрифугирование - эксперимент со скоростью осаждения (AUC-SV) гистоновых олигомеров, нуклеоплазминового домена AtFKBP53 и их комплексов. Распределение расстояний AUC против график коэффициента осаждения (S). Также приведены полученные значения коэффициента (коэффициентов) осаждения и молекулярные массы. Метка AtFKBP53 соответствует нуклеоплазминовому домену AtFKBP53. Расчетные молекулярные массы показывают стехиометрию 1:1 для нуклеоплазминового домена AtFKBP53 с димером гистоновых олигомеров H2A/H2B и тетрамером H3/H4. 450 мкл всех белковых образцов, имеющих OD280 0,3-0,5, были использованы для экспериментов AUC-SV. Рисунок взят из ссылки21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Плазмидный суперспиральный анализ. Плазмидный суперспиральный анализ для гистоновых шаперонов AtNRP1 и AtNRP2. 500 нг плазмидной ДНК pUC19 предварительно обрабатывали 1 мкг топоизомеразы I для эксперимента. 4 мкМ AtNRP1, 4 мкМ AtNRP2 и смесь димера H2A/H2B 4 мкМ и тетрамера H3/H4 2 мкМ были в качестве контроля, которые не проявляют сверхспиральной активности при инкубации с предварительно обработанной ДНК pUC19. Полосы со смесью 4 мкМ H2A/H2B димера и 2 мкМ H3/H4 тетрамера и по 4 мкМ AtNRP1 и AtNRP2 показывают образование сверхспирированной ДНК при инкубации с предварительно обработанной ДНК pUC19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

О конфликте интересов заявлено не было.