Методическая статья

Анализы ACT1-CUP1 определяют субстрат-специфическую чувствительность сплайсеосомальных мутантов в почковых дрожжах

DOI:

10.3791/63232

⸱

30 июня 2022 г.

1College of Arts and Sciences, Northwest University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ ACT1-CUP1, анализ роста меди, обеспечивает быстрое считывание сплайсинга РНК-предшественника (пре-мРНК) и влияние мутантных факторов сплайсинга на сплайсеосомную функцию. Это исследование предоставляет протокол и подчеркивает возможность настройки для решения интересующего вопроса сплайсинга.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мутации, введенные в сплайсеосому или ее субстрат, значительно способствовали нашему пониманию тонкостей сплайсеосомальной функции. Независимо от того, связаны ли они с заболеванием или функционально выбраны, многие из этих мутаций были изучены с использованием анализов роста в модельном организме Saccharomyces cerevisiae (дрожжи). Специфический для сращивания анализ роста меди, или ACT1-CUP1, обеспечивает всесторонний анализ мутации на фенотипическом уровне. В анализе ACT1-CUP1 используются репортеры, которые обеспечивают допуск меди при правильном сращивании. Таким образом, в присутствии меди изменения жизнеспособности дрожжей коррелируют с изменениями в производстве мРНК посредством сплайсинга. В типичном эксперименте дрожжевой сплайсеосоме бросают вызов с различными неконсенсусными репортерами сплайсинга и мутацией фактора сплайсинга, представляющей интерес, для обнаружения любого синергетического или антитетического воздействия на сплайсинг. Здесь приведено полное описание подготовки медной пластины, обшивки дрожжевых клеток, а также оценка данных. Описана подборка дополнительных экспериментов, подчеркивающих универсальность репортеров ACT1-CUP1. Анализ ACT1-CUP1 является удобным инструментом в наборе инструментов для сращивания благодаря прямому считыванию мутационного эффекта (эффектов) и сравнительным возможностям от продолжающегося использования в полевых условиях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сплайсеосома представляет собой большую биологическую машину, которая катализирует удаление интронов, некодирующих областей в РНК-предшественника-мессенджера (пре-мРНК)1,2. Характеристика эффекта мутанта одной точки в 1 из почти 100 белков и 5 некодирующих РНК часто неоднозначна при изучении белка или РНК в изоляции. Изменение функции мутированного компонента лучше всего может быть оценено in vivo в контексте полной, функционирующей сплайсеосомы.

Анализ роста меди, описанный здесь, является быстрым показателем эффективности сращивания в Saccharomyces cerevisiae или почковых дрожжах. Разработанный К.Ф. Лессером и К. Гатри и опубликованный в 1993 году, этот анализ сочетает в себе простоту работы с простым модельным организмом и простое считывание жизнеспособности клеток3. Жизнеспособность коррелирует с тем, насколько хорошо сплайсеосомы в этих клетках могут распознавать и сращивать репортерную расшифровку.

Этот анализ роста меди чаще называют анализом ACT1-CUP1. Название ACT1-CUP1 происходит от двух генов, слитых для создания репортера эффективности сплайсинга. ACT1 - это ген актина дрожжей, который высоко экспрессируется и имеет эффективно сращенный интрон 4,5. Cup1p - это медный хелатор, который изолирует медь в клетке для предотвращения помех регулярным клеточным функциям 6,7,8. Репортер ACT1-CUP1 содержит эти гены в такой последовательности, что CUP1 находится в правильном кадре считывания только в том случае, если происходит сращивание интрона ACT1 до мРНК (рисунок 1). Полученный в результате синтез белка содержит первые 21 аминокислоту актина и полноразмерный белок Cup1p, который повышает жизнеспособность дрожжей в богатой медью среде3. Таким образом, увеличение количества сращивания репортера приводит к более высокой концентрации Cup1p и более высокому сопротивлению меди (рисунок 1). По сравнению с другими генами-репортерами, CUP1 влияет на жизнеспособность клеток даже на низких уровнях, имеет широкий диапазон чувствительности и может быть использован для непосредственного выбора для сплайсинга мутаций 3,6,7. Кроме того, CUP1 не является необходимым для роста стандартных дрожжей, и, таким образом, клеточный гомеостаз не влияет во время установки для этого анализа. В дополнение к анализам делеции или температурного роста, ACT1-CUP1 предоставляет информацию о влиянии на сращивание в оптимальных условиях роста дрожжей.

Сплайсеосома распознает свой субстрат через три интронные последовательности, а именно 5' сращивание (5' SS), ответвление (BS) и 3' место сращивания (3' SS). На этих сайтах были созданы многочисленные репортеры ACT1-CUP1, содержащие неконсенсусные последовательности. Выбор наиболее распространенных репортеров ACT1-CUP1 показан на рисунке 1 и в таблице 1. Поскольку сплайсеосома взаимодействует с каждым местом сращивания уникально в разных точках цикла сплайсинга, надежность сплайсеосомы может быть проверена на разных этапах, на основе которых используется неконсенсусный репортер. Неконсенсусные репортеры названы в честь мутировавшей позиции внутри интрона и базы, на которую она была мутирована. Например, A3c является репортером с мутацией в 5' SS, в частности позицией 3 от консенсусного аденозина к цитозину. Этот репортер будет сильно взаимодействовать со сплайсеосомными мутациями, которые влияют на выбор и использование 5' SS. В своем первоначальном исследовании Лессер и Гатри определили, какие мутации 5' SS ингибируют сплайсинг3. Позже в том же году неконсенсусные репортеры на всех трех сайтах сращивания были опубликованы Берджессом и Гатри в супрессорном скрининге мутаций в ATPase Prp16p9. Сравнивая консенсус с неконсенсусными репортерами, анализ ACT1-CUP1 был важным ключом к пониманию надежности и селективности дрожжевой сплайсеосомы и к выводу о функции сплайсеос других эукариот.

Поскольку неконсенсусные репортеры ACT1-CUP1 сенсибилизируют сплайсеосому к дальнейшему возмущению, влияние мутации одного фактора сплайсинга может быть охарактеризовано через репортеров, на которых она положительно или отрицательно влияет. Это было применено к сращиванию исследовательских вопросов различными способами. Во-первых, анализ ACT1-CUP1 может и использовался в качестве генетического скрининга мутаций в факторах сплайсинга. Например, Prp8p, самый большой сплайсинговый белок, служит платформой, на которой ядро РНК сплайсеосомы катализирует реакцию сплайсинга. Это было выведено, в частности, из того, как мутанты Prp8p улучшили или уменьшили сплайсинг различных репортеров ACT1-CUP1 10,11,12,13,14,15,16,17. Другие белковые компоненты сплайсеосомы также были исследованы с использованием ACT1-CUP1, включая Hsh155p, Cwc2p, Cef1p и Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. Энергетические пороги для Prp16p и четырех других АТФаз, участвующих в сплайсеосомальном переходе, также были изучены с помощью этого анализа 9,26,27,28,29,30. Малые ядерные РНК (snRNAs) также были широко изучены с использованием ACT1-CUP1 для идентификации последовательностей пре-мРНК, которые они координируют, и изменений во вторичной структуре, которые snRNAs претерпевают во время сплайсинга 3,31,32,33,34,35,36,37.

Анализ ACT1-CUP1 требует штамма дрожжей, где все копии гена CUP1 были выбиты. Поскольку CUP1 может иметь высокий номер копии 6,38, подготовка полного нокаутирующего штамма может потребовать нескольких раундов или обширного скрининга. В результате штаммы дрожжей cup1Δ часто распределялись между лабораториями, как и репортеры.

Если мутации в факторе сплайсинга оцениваются из плазмидной копии, ген дикого типа для этого фактора должен быть выбит. Кроме того, дрожжевой фон должен позволять выбирать по меньшей мере две плазмиды, одна из которых содержит репортер ACT1-CUP1, исторически на плазмиде для отбора лейкодина питательных веществ, а другая содержит мутацию или возмущение в сплайсинговом механизме, который будет изучен (рисунок 2). Обычно в одном анализе несколько штаммов дрожжей, каждый из которых несет возмущение сплайсинга запроса (QSP) и другого репортера, проверяют влияние запроса на сплайсинг.

Независимые переменные в анализе ACT1-CUP1 позволяют исследователю оценить тяжесть QSP. Этими независимыми переменными являются концентрация меди и выбор нескольких неконсенсусных сращивающих репортеров. Во-первых, поскольку штаммы дрожжей выращиваются на пластинах, содержащих диапазон концентраций меди (рисунок 2), настройка анализа включает выбор градиента используемых концентраций. Исследования могут использовать градиент концентрации меди курса, чтобы получить начальное считывание жизнеспособности, а затем повторить анализ с более тонким градиентом, чтобы определить тонкие различия в жизнеспособности. Второй переменной является широкий диапазон репортеров ACT1-CUP1, которые можно протестировать (рисунок 1 и таблица 1). Если QSP влияет на жизнеспособность дрожжей по-разному в присутствии неконсенсусного репортера по сравнению с диким типом, можно сделать вывод, что QSP влияет на шаг в сплайсинге или область сплайсеосомы, важную во время распознавания или обработки этой области интрона.

Набор инструментов для дрожжей обширен, и анализ ACT1-CUP1 является неотъемлемой частью исследований сращивания. Анализ ACT1-CUP1 часто выполняется вместе с более глубоким генетическим, структурным и / или биохимическим анализом воздействия QSP. Поскольку эти более подробные исследования, как правило, имеют более длительную процедуру и / или более высокую цену, частым подходом является скрининг интересных мутантов с ACT1-CUP1 в первую очередь.

Здесь представлен протокол анализа ACT1-CUP1, включая подготовку медной пластины. Этот анализ дает исследователям первоначальный ответ на влияние QSP на сплайсинг и на какие интронные области больше всего влияет возмущение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Конструкция штамма дрожжей

  1. Генерировать или получать штамм S. cerevisiae , фон которого включает leu2 и cup1Δ. Чтобы создать этот фон, используйте хорошо зарекомендовавший себя дрожжевой метод, в котором используется ацетат лития и одноцепочечная ДНК39.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы гаплоидных дрожжей могут содержать одну, две или более копий CUP1 6,38. Обратитесь к геномной информации для выбранного штамма дрожжей при разработке нокаутирующих праймеров для фланкирования местоположения (местоположений) гена CUP1.
  2. Выполните трансформацию дрожжей для включения QSP либо через геномное включение, либо на плазмиду. Используйте хорошо зарекомендовавший себя протокол, подобный описанным в предыдущих исследованиях 40,41,42.
  3. Выполните трансформацию дрожжей с полученным штаммом (штаммами) из шага 1.2. , чтобы добавить желаемую репортерную плазмиду ACT1-CUP1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны поддерживаться на пластинах и средах с выпадением лейцина (-Leu) для обеспечения удержания репортерных плазмид ACT1-CUP1 после этой трансформации.
  4. Выполните шаги 1.2. и 1.3. для каждой тестируемой QSP и каждой репортерной плазмиды ACT1-CUP1, включая контрольные штаммы.

2. Подготовка медной пластины

  1. Выберите диапазон концентрации меди, который подходит репортерам для тестирования (см. Таблицу 1 для часто используемой летальности репортеров).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примером всеобъемлющего диапазона концентраций меди является 30 различных концентраций меди 0 мМ, 0,025 мМ, 0,05 мМ, 0,075 мМ, 0,1 мМ, 0,15 мМ, 0,2 мМ, 0,25 мМ, 0,3 мМ, 0,35 мМ, 0,4 мМ, 0,45 мМ, 0,5 мМ, 0,6 мМ, 0,7 мМ, 0,8 мМ, 0,9 мМ, 1,0 мМ, 1,1 мМ, 1,2 мМ, 1,3 мМ, 1,4 мМ, 1,5 мМ, 1,6 мМ, 1,7 мМ, 1,8 мМ, 1,9 мМ, 2,0 мМ, 2,25 мМ и 2,5 мМ Cu2+.
  2. Сделайте стандартный раствор из 1 M CuSO4 и стерильного фильтра через стерильный фильтр PES (полиэфирсульфон) 0,22 мкм.
  3. На желаемую медную пластину приготовьте разбавление 2 мл запаса CuSO4 в стерильной воде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку пластина с 0 мМ Cu2+ всегда будет анализироваться и отображаться в качестве эталона, рекомендуется сделать две пластины 0 мМ Cu2+ , одну в начале и одну в конце стадии покрытия (шаг 3.4.).
    1. Рассчитайте количество запасов для конечной желаемой концентрации меди в 40 мл объема пластины (Дополнительная таблица 1).
    2. Добавьте расчетное количество стерильной воды и 1 M CuSO4 бульона в стерильную пробирку объемом 2 мл.
  4. Заливные пластины для анализа ACT1-CUP1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой приведенному ниже протоколу является первоначальное объединение среды и агара в большом контейнере и аликвоты после автоклавирования в меньшие контейнеры для достижения различных концентраций меди для каждой пластины. Какой бы метод ни был принят, важно убедиться, что концентрация среды согласована между всеми пластинами, несмотря на то, что каждая из них имеет разную концентрацию меди.
    1. Пометьте каждую пустую пластину, которую нужно налить, конечной концентрацией меди, которую она будет содержать. Подготовьте по меньшей мере одну квадратную пластину на каждую концентрацию меди для испытания.
    2. Нанесите этикетку на бутылку объемом 100 мл на каждую концентрацию меди, подлежащую испытанию.
    3. В каждый флакон добавьте 790 мг агара (2% мас./об.агара) и перемешивание.
    4. В большом стакане объедините среду роста -Leu для всех медных пластин, которые будут разливаться. На каждую пластину растворяют 265 мг дрожжевого азотистого основания (YNB) и 64 мг выпадающей смеси без лейцина (и любых других питательных веществ, которые могут потребоваться для поддержания плазмиды QSP в клетках) в 34 мл деионизированной воды.
    5. Добавьте 34 мл раствора среды для роста -Leu в каждый подготовленный флакон объемом 100 мл и крышку с алюминиевой фольгой. Нанесите маркировку на фольгу с предполагаемой концентрацией меди.
    6. Автоклав для стерилизации и растворения агара с использованием рекомендуемого жидкого цикла для автоклава.
    7. Как можно быстрее добавьте в каждый флакон 4 мл 20% мас./об. глюкозы (стерильно отфильтрованной).
    8. Сопоставьте этикетки и добавьте 2 мл разбавления CuSO4 в предполагаемую бутылку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку десятки медных пластин могут быть изготовлены одновременно, каждая с разной концентрацией, маркировка всех бутылок, трубок и пластин четко с предполагаемой концентрацией меди предотвратит путаницу во время заливки пластин.
    9. Используйте перемешиваемую пластину для смешивания в течение ~ 30 с и налейте или пипеткой 35 мл в маркированную тарелку, избегая пузырьков. Дайте остыть перед хранением или использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Часто пластины изготавливают за 1 день или 2 дня до анализа и хранят при 4 °C до нескольких часов перед использованием. Пластины должны быть при комнатной температуре (RT) до начала покрытия (шаг 3.4.).

3. Анализ ACT1-CUP1

  1. Уберите желаемые нагрузки на пластины -Leu.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с криоматериалами следует позаботиться о том, чтобы клетки были достаточно восстановлены после хранения перед нанесением покрытия. Рекомендуемая процедура для этого заключается в том, чтобы удалить криогенный запас и дать ему расти в течение 3-5 дней при 30 ° C. Затем отложите небольшой образец и дайте ему расти еще 2-3 дня при 30 °C.
  2. Выращивайте ночные культуры в 10 мл среды.
    1. Подготовьте среду для роста -Leu, используя те же соотношения, которые описаны в шаге 2.4.2. На 10 мл среды добавляют 66 мг дрожжевого азотистого основания (YNB) и 16 мг выпадающей смеси минус лейцин к 9 мл деионизированной воды. Пропустите через стерильный фильтр PES 0,22 мкм.
    2. На штамм дрожжей добавляют 9 мл ростовой среды лея и 1 мл 20% мас./об. глюкозы (стерильно фильтрованной) в стерильную коническую трубку объемом 50 мл.
    3. Используя стерильную палочку или наконечник пипетки, соберите небольшой (~ 1 мм круглый) образец дрожжей и привите среду.
    4. Встряхните все культуры на ночь при 180 об/мин при 30 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии ротаторы можно использовать вместо шейкера.
  3. Разводят штаммы до ОД600 0,5 ± 0,05 в 10% глицерине.
    1. На штамм добавляют 100 мкл культуры в кювету, содержащую 900 мкл воды.
    2. Измерьте OD600 с помощью спектрофотометра.
    3. Рассчитать необходимое разбавление при ОД600 0,5 в конечном объеме 2 мл.
    4. Развести каждый штамм доОД 600 0,5 в 10% глицерине (стерильном).
    5. Повторное измерение OD600 для подтверждения плотности клеток находится в пределах желаемого диапазона 0,5 ± 0,05.
  4. Нанесите деформации на медные пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для покрытия деформаций могут быть использованы различные методы, включая ручную пипетку объемов 5-10 мкл, использование повторного или многоканального пипетки или штамповку с помощью контактного репликатора. Этот последний метод описан ниже, хотя большинство шагов будут одинаковыми независимо от метода.
    1. Установите стерильное рабочее место и зажженную горелку Бунзена.
    2. Для 48-контактного репликатора пипетку 200 мкл каждой разбавленной деформации в отдельную скважину из 96-луночной пластины. Заполните пустые места в сетке 6 x 8 200 мкл 10% глицерина (стерильного).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пример схемы покрытия для девяти штаммов дрожжей приведен в дополнительной таблице 2.
    3. Окуните репликатор в неглубокую посуду с 95% (v/v) этанолом и зажгите для стерилизации. Дайте ему остыть в течение не менее 2 минут после того, как пламя погаснет, чтобы избежать теплового удара по клеткам.
    4. Поместите четыре пластины рядом с горелкой и снимите крышки.
    5. Опустите репликатор в пластину с 96 лунками и поднимите ее одним быстрым движением.
    6. Аккуратно положите на тарелку и слегка покачивайтесь взад и вперед, чтобы облегчить хорошую передачу.
    7. Поднимите вверх одним быстрым движением и поместите в точно такую же ориентацию в 96-луночную плиту.
    8. Повторите для трех других пластин. Повторите процесс погружения репликатора в этанол, пылая для стерилизации и ожидая, чтобы остыть каждые четыре пластины.
    9. После того, как пластина была покрыта, плавно двигайтесь в сторону, но все еще внутри стерилизующего зонтика пламени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется делать разбавления дрожжами и обшивку возле пламени. Пластины могут легко загрязняться во время сушки.
    10. Дайте пластинам полностью высохнуть, прежде чем надеть крышки, обычно через 3-5 минут.
    11. Инкубировать пластины в течение 3 дней при 30 °C.

4. Сбор и анализ данных

  1. Выньте пластины из инкубатора и визуально осмотрите их.
  2. Записывайте изображения пластин с помощью доступной камеры или другой цифровой системы визуализации.
  3. Регистрируется (или балл) для каждого штамма наблюдается последний наблюдаемый рост концентрации меди.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки способны сращиваться и оставаться жизнеспособными до этой концентрации. Для консистенции всегда используйте один и тот же метод, либо на глаз, либо из изображений пластин, чтобы оценить последнюю жизнеспособную концентрацию меди. Очень маленькие колонии иногда видны глазом, но не на изображении. Разница между непосредственным визуальным осмотром или записью с изображений невелика, обычно это шаг в градиенте. Поскольку изображения колоний часто используются в публикациях, рекомендуется озвучивать изображения.
  4. Объедините данные из нескольких анализов ACT1-CUP1 для одного и того же штамма, чтобы сделать выводы о том, как QSP влияет на сплайсинг.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные публикации обычно показывают изображения колоний дрожжей при концентрации 0 мМ Cu2+ , последнюю жизнеспособную концентрацию меди и последующую концентрацию, в которой колония умерла. Данные также могут отображаться в виде гистограммы с полосами ошибок для стандартного отклонения между репликациями. Данные не нуждаются в нормализации, но могут быть установлены путем установки жизнеспособности контроля коэффициента сплайсинга WT равным 1 и сравнения эффекта введенной мутации (мутаций).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализы роста, такие как ACT1-CUP1, требуют визуальной, сравнительной оценки нескольких колоний. Здесь каждый штамм выращивали до насыщения в течение ночи, разбавляли до OD600 0,5 и покрывали на 20 пластинах, содержащих диапазон концентраций меди от 0 мМ до 1,1 мМ CuSO4 (рисунок 3). Этот диапазон меньше, чем тот, который указан в протоколе, поскольку он позволяет полностью оценить влияние QSP и репортеров ACT1-CUP1, используемых и описанных ниже. Пластины были сфотограф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ACT1-CUP1 является анализом роста, и необходимо позаботиться о том, чтобы наблюдаемые различия в росте можно было отнести только к дефектам сращивания. Все штаммы должны обрабатываться аналогичным образом перед нанесением покрытия, в том числе иметь одинаковую длину и тип роста и условий хранения. При использовании чувствительных к температуре штаммов анализы ACT1-CUP1 следует проводить только в условиях, когда эти штаммы растут сопоставимо с диким типом. Соответственно, для компонента QSP рекомендуется иметь идентичные ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автору нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Спасибо Аарону Хоскинсу и членам лаборатории Хоскинса в Университете Висконсин-Мэдисон за использование штаммов дрожжей и оборудования в генерации фигур 3-5. Спасибо Харприту Кауру и Синъян Фу за их проницательные комментарии к рукописи. Спасибо поддерживающим студентам, сотрудникам и преподавателям Северо-Западного университета во время написания, редактирования и съемок этой статьи. Спасибо Изабель Марасиган за помощь в съемках этого метода.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл стерильные микроцентрифужные пробиркиFisher Scientific05-408-129или аналогичное изделие от другого производителя.
2 мл стерильные микроцентрифужные пробиркиFisher Scientific05-408-138Или аналогичное изделие от другого производителя.
50 мл стерильные центрифужные пробиркиFisher Scientific07-201-332Или аналогичное изделие от другого производителя.
96-луночный микропланшет с круглым дномFisher Scientific07-200-760Или аналогичное изделие от другого производителя.
190 проба этанолаFisher Scientific22-032-600Или аналогичное изделие от другого производителя.
Система фильтрации 500 мл (0,22 &; m)Научные продукты CellTreat229707Или аналогичный товар от другого производителя.
AgarFisher ScientificBP1423-500Подойдет любой молекулярный агар.
АвтоклавTuttnauer3870EAИли аналогичное изделие от другого производителя.
Горелка БунзенаHumboldtPN6200.1или аналогичное изделие от другого производителя.
Плотномер ячейкиVWR490005-906или другой спектральный прибор, который может измерять поглощение на длине волны 595 нм.
Пентагидрат медного купоросаFisher ScientificLC134051Или аналогичное изделие от другого производителя.
Цифровая система визуализацииCytiva29399481ImageQuant 4000 (используется для рис. 3),  Amersham ImageQuant 800, или аналогичный товар от другого производителя.
Drop out mix (-Leu)USBiological Life SciencesD9525Используйте подходящую смесь для вашего эксперимента. Вполне возможно, что вы также будете использовать дрожжевой маркер питательных веществ для возмущения вашего запроса. В этом случае смесь должна быть для этого маркера и Leu
D-глюкозыFisher ScientificAAA1682836или аналогичного товара от другого производителя.
Программное обеспечение для количественного определения гелевой лентыCytiva29-0006-05ImageQuant TL v8.1 (используется для рисунка 5A) или аналогичное изделие от другого производителя.
Ручная фотоаппаратNikonD3500или аналогичная деталь от другого производителя.
Ближний инфракрасный гелевый аппарат визуализацииCytiva29238583Amersham Typhoon NIR (используется для рисунка 5а) или аналогичное изделие от другого производителя.
Хомут лабораторного классаFisher Scientific05-769-7QИли аналогичное изделие от другого производителя.
Лабораторный стенд и зажимFisher Scientific12-000-101или аналогичное изделие от другого производителя.
Магнитные мешалкиFisher Scientific14-513-51Или аналогичное изделие от другого производителя.
Пин-репликаторVP ScientificVP 407AH
Полумикро одноразовые кюветыVWR97000-590Или аналогичное изделие от другого производителя.
ШейкерJEIO TechIST-3075или аналогичный товар от другого производителя.
СпектрофотометрБиовейв80-3000-45Или любой спектрофотометр, который может измерять поглощение на длине волны 600 нм.
Квадратные пластиныVWR102091-156Круглые пластины также могут использоваться, хотя это сложнее при использовании репликатора выводов.
МешалкаFisher Scientific11-520-16SИли аналогичное изделие от другого производителя.
Дрожжевая азотная основаUSBiological Life SciencesY2025Или аналогичный товар от другого производителя.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wahl, M. C., Will, C. L., Luhrmann, R. The spliceosome: Design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
  2. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  3. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutational analysis of pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae using a sensitive new reporter gene, CUP1. Genetics. 133 (4), 851-863 (1993).
  4. Ng, R., Abelson, J. Isolation and sequence of the gene for actin in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (7), 3912-3916 (1980).
  5. Gallwitz, D., Sures, I. Structure of a split yeast gene: Complete nucleotide sequence of the actin gene in I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2546-2550 (1980).
  6. Fogel, S., Welch, J. W., Cathala, G., Karin, M. Gene amplification in yeast: CUP1 copy number regulates copper resistance. Current Genetics. 7 (5), 347-355 (1983).
  7. Hamer, D. H., Thiele, D. J., Lemontt, J. E. Function and autoregulation of yeast copperthionein. Science. 228 (4700), 685-690 (1985).
  8. Winge, D. R., Nielson, K. B., Gray, W. R., Hamer, D. H. Yeast metallothionein. Sequence and metal-binding properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14464-14470 (1985).
  9. Burgess, S. M., Guthrie, C. A mechanism to enhance mRNA splicing fidelity: The RNA-dependent ATPase Prp16 governs usage of a discard pathway for aberrant lariat intermediates. Cell. 73 (7), 1377-1391 (1993).
  10. Collins, C. A., Guthrie, C. Allele-specific genetic interactions between Prp8 and RNA active site residues suggest a function for Prp8 at the catalytic core of the spliceosome. Genes & Development. 13 (15), 1970-1982 (1999).
  11. Siatecka, M., Reyes, J. L., Konarska, M. M. Functional interactions of Prp8 with both splice sites at the spliceosomal catalytic center. Genes & Development. 13 (15), 1983-1993 (1999).
  12. Umen, J. G., Guthrie, C. Mutagenesis of the yeast gene PRP8 reveals domains governing the specificity and fidelity of 3' splice site selection. Genetics. 143 (2), 723-739 (1996).
  13. Grainger, R. J., Beggs, J. D. Prp8 protein: At the heart of the spliceosome. RNA. 11 (5), 533-557 (2005).
  14. Query, C. C., Konarska, M. M. Suppression of multiple substrate mutations by spliceosomal prp8 alleles suggests functional correlations with ribosomal ambiguity mutants. Molecular Cell. 14 (3), 343-354 (2004).
  15. Konarska, M. M., Vilardell, J., Query, C. C. Repositioning of the reaction intermediate within the catalytic center of the spliceosome. Molecular Cell. 21 (4), 543-553 (2006).
  16. Liu, L., Query, C. C., Konarska, M. M. Opposing classes of prp8 alleles modulate the transition between the catalytic steps of pre-mRNA splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (6), 519-526 (2007).
  17. MacRae, A. J., et al. Prp8 positioning of U5 snRNA is linked to 5' splice site recognition. RNA. 24 (6), 769-777 (2018).
  18. Query, C. C., Konarska, M. M. CEF1/CDC5 alleles modulate transitions between catalytic conformations of the spliceosome. RNA. 18 (5), 1001-1013 (2012).
  19. Tang, Q., et al. SF3B1/Hsh155 HEAT motif mutations affect interaction with the spliceosomal ATPase Prp5, resulting in altered branch site selectivity in pre-mRNA splicing. Genes & Development. 30 (24), 2710-2723 (2016).
  20. Carrocci, T. J., Zoerner, D. M., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. SF3b1 mutations associated with myelodysplastic syndromes alter the fidelity of branchsite selection in yeast. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4837-4852 (2017).
  21. Kaur, H., Groubert, B., Paulson, J. C., McMillan, S., Hoskins, A. A. Impact of cancer-associated mutations in Hsh155/SF3b1 HEAT repeats 9-12 on pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 15 (4), 0229315(2020).
  22. vander Feltz, C., et al. Saccharomyces cerevisiae Ecm2 modulates the catalytic steps of pre-mRNA splicing. RNA. 27 (5), 591-603 (2021).
  23. Carrocci, T. J., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. Functional analysis of Hsh155/SF3b1 interactions with the U2 snRNA/branch site duplex. RNA. 24 (8), 1028-1040 (2018).
  24. Hogg, R., de Almeida, R. A., Ruckshanthi, J. P., O'Keefe, R. T. Remodeling of U2-U6 snRNA helix I during pre-mRNA splicing by Prp16 and the NineTeen Complex protein Cwc2. Nucleic Acids Research. 42 (12), 8008-8023 (2014).
  25. Hansen, S. R., Nikolai, B. J., Spreacker, P. J., Carrocci, T. J., Hoskins, A. A. Chemical inhibition of pre-mRNA splicing in living Saccharomyces cerevisiae. Cell Chemical Biology. 26 (3), 443-448 (2019).
  26. Xu, Y. Z., Query, C. C. Competition between the ATPase Prp5 and branch region-U2 snRNA pairing modulates the fidelity of spliceosome assembly. Molecular Cell. 28 (5), 838-849 (2007).
  27. Staley, J. P., Guthrie, C. An RNA switch at the 5' splice site requires ATP and the DEAD box protein Prp28p. Molecular Cell. 3 (1), 55-64 (1999).
  28. Bousquet-Antonelli, C., Presutti, C., Tollervey, D. Identification of a regulated pathway for nuclear pre-mRNA turnover. Cell. 102 (6), 765-775 (2000).
  29. Villa, T., Guthrie, C. The Isy1p component of the NineTeen complex interacts with the ATPase Prp16p to regulate the fidelity of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 19 (16), 1894-1904 (2005).
  30. Mayas, R. M., Maita, H., Staley, J. P. Exon ligation is proofread by the DExD/H-box ATPase Prp22p. Nature Structure and Molecular Biology. 13 (6), 482-490 (2006).
  31. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutations in U6 snRNA that alter splice site specificity: Implications for the active site. Science. 262 (5142), 1982-1988 (1993).
  32. McPheeters, D. S. Interactions of the yeast U6 RNA with the pre-mRNA branch site. RNA. 2 (11), 1110-1123 (1996).
  33. Perriman, R. J., Ares, M. Rearrangement of competing U2 RNA helices within the spliceosome promotes multiple steps in splicing. Genes & Development. 21 (7), 811-820 (2007).
  34. Mefford, M. A., Staley, J. P. Evidence that U2/U6 helix I promotes both catalytic steps of pre-mRNA splicing and rearranges in between these steps. RNA. 15 (7), 1386-1397 (2009).
  35. Hilliker, A. K., Mefford, M. A., Staley, J. P. U2 toggles iteratively between the stem IIa and stem IIc conformations to promote pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (7), 821-834 (2007).
  36. Wu, G., et al. Pseudouridines in U2 snRNA stimulate the ATPase activity of Prp5 during spliceosome assembly. EMBO Journal. 35 (6), 654-667 (2016).
  37. Crotti, L. B., Bacikova, D., Horowitz, D. S. The Prp18 protein stabilizes the interaction of both exons with the U5 snRNA during the second step of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (10), 1204-1216 (2007).
  38. Fogel, S., Welch, J. W. Tandem gene amplification mediates copper resistance in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5342-5346 (1982).
  39. Gardner, J. M., Jaspersen, S. L. Manipulating the yeast genome: Deletion, mutation, and tagging by PCR. Methods Molecular Biology. 1205, 45-78 (2014).
  40. JoVE. Yeast Transformation and Cloning. In Biology I: yeast, Drosophila and C. Elegant. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  41. Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Molecular Biology. 313, 107-120 (2006).
  42. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. Biotechniques. 30 (4), 816(2001).
  43. Mayerle, M., et al. Structural toggle in the RNaseH domain of Prp8 helps balance splicing fidelity and catalytic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4739-4744 (2017).
  44. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  45. Beier, D. H., et al. Dynamics of the DEAD-box ATPase Prp5 RecA-like domains provide a conformational switch during spliceosome assembly. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10842-10851 (2019).
  46. vander Feltz, C., DeHaven, A. C., Hoskins, A. A. Stress-induced pseudouridylation alters the structural equilibrium of yeast U2 snRNA Stem II. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 524-536 (2018).
  47. Rodgers, M. L., Didychuk, A. L., Butcher, S. E., Brow, D. A., Hoskins, A. A. A multi-step model for facilitated unwinding of the yeast U4/U6 RNA duplex. Nucleic Acids Research. 44 (22), 10912-10928 (2016).
  48. Stutz, F., Rosbash, M. A functional interaction between Rev and yeast pre-mRNA is related to splicing complex formation. EMBO Journal. 13 (17), 4096-4104 (1994).
  49. Libri, D., Lescure, A., Rosbash, M. Splicing enhancement in the yeast rp51b intron. RNA. 6 (3), 352-368 (2000).
  50. Libri, D., Stutz, F., McCarthy, T., Rosbash, M. RNA structural patterns and splicing: Molecular basis for an RNA-based enhancer. RNA. 1 (4), 425-436 (1995).
  51. Howe, K. J., Kane, C. M., Ares, M. Perturbation of transcription elongation influences the fidelity of internal exon inclusion in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 9 (8), 993-1006 (2003).
  52. Cuenca-Bono, B., et al. SUS1 introns are required for efficient mRNA nuclear export in yeast. Nucleic Acids Research. 39 (19), 8599-8611 (2011).
  53. Scherrer, F. W., Spingola, M. A subset of Mer1p-dependent introns requires Bud13p for splicing activation and nuclear retention. RNA. 12 (7), 1361-1372 (2006).
  54. Hálová, M., et al. Nineteen complex-related factor Prp45 is required for the early stages of cotranscriptional spliceosome assembly. RNA. 23 (10), 1512-1524 (2017).
  55. Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
  56. Crotti, L. B., Horowitz, D. S. Exon sequences at the splice junctions affect splicing fidelity and alternative splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 18954-18959 (2009).
  57. Perriman, R., Ares, M. Invariant U2 snRNA nucleotides form a stem loop to recognize the intron early in splicing. Molecular Cell. 38 (3), 416-427 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ACT1 CUP1Saccharomyces cerevisiae

Похожие статьи