Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Контролируемые полуавтоматизированные лазерно-индуцированные повреждения для изучения регенерации спинного мозга у личинок рыбок данио

2.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63259

⸱

22 ноября 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh Medical School: Biomedical Sciences, 2Center for Regenerative Therapies at the TU Dresden

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

Настоящий протокол описывает способ индуцирования тканеспецифических и высоковоспроизводимых повреждений у личинок рыбок данио с использованием лазерной системы поражения в сочетании с автоматизированной микрофлюидной платформой для обработки личинок.

Аннотация

Личинки рыбок данио обладают полностью функциональной центральной нервной системой (ЦНС) с высокой регенеративной способностью всего через несколько дней после оплодотворения. Это делает эту животную модель очень полезной для изучения травм и регенерации спинного мозга. Стандартным протоколом индуцирования таких поражений является трансекция дорсальной части ствола вручную. Однако эта методика требует обширной подготовки и повреждает дополнительные ткани. Был разработан протокол для лазерно-индуцированных поражений, чтобы обойти эти ограничения, что обеспечивает высокую воспроизводимость и полноту трансекции спинного мозга у многих животных и между различными сеансами, даже для неподготовленного оператора. Кроме того, повреждение тканей в основном ограничивается самим спинным мозгом, уменьшая смешанные эффекты от повреждения различных тканей, например, кожи, мышц и ЦНС. Кроме того, возможны геми-поражения спинного мозга. Улучшенное сохранение целостности тканей после лазерного повреждения облегчает дальнейшие вскрытия, необходимые для дополнительных анализов, таких как электрофизиология. Следовательно, этот метод предлагает точный контроль степени травмы, которая недостижима вручную. Это позволяет создавать новые экспериментальные парадигмы в этой мощной модели в будущем.

Введение

В отличие от млекопитающих, рыбки данио (Danio rerio) могут восстанавливать свою центральную нервную систему (ЦНС) после травмы1. Использование личинок рыбок данио в качестве модели регенерации спинного мозга относительно недавно. Оказалось полезным исследовать клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе репарации2. Это связано с простотой манипуляций, коротким экспериментальным циклом (новые личинки каждую неделю), оптической прозрачностью тканей и небольшим размером личинок, идеально подходящим для флуоресцентной микроскопии in vivo.

В случае регенерации спинного мозга двумя дополнительными преимуществами использования личинок являются скорость восстановления, несколько дней по сравнению с несколькими неделями для взрослых, и легкость индуцирования травм с использованием мануальных методов. Это было успешно использовано во многих исследованиях3,4,5, включая недавние исследования6,7. В целом, это приводит к увеличению значимого производства данных, высокой адаптивности экспериментальных протоколов и снижению экспериментальных затрат. Использование личинок моложе 5 дней после оплодотворения также снижает использование животных в соответствии с принципами 3R в исследованиях на животных8.

После травмы спинного мозга у личинок рыбок данио происходят многие биологические процессы, включая воспалительную реакцию, пролиферацию клеток, нейрогенез, миграцию выживших или вновь генерируемых клеток, реформирование функциональных аксонов и глобальное ремоделирование цепей нервных процессов и тканей позвоночника6,7,9,10 . Чтобы быть успешно организованными, эти процессы включают в себя тонко регулируемое взаимодействие между рядом типов клеток, компонентов внеклеточного матрикса и биохимических сигналов11,12. Разгадка деталей этой значительной реорганизации сложной ткани, такой как спинной мозг, требует использования и разработки точных и контролируемых экспериментальных подходов.

Основная экспериментальная парадигма, используемая для изучения регенерации спинного мозга у рыбок данио, заключается в использовании хирургических средств для индуцирования повреждения тканей путем резекции, колющего ранения или криоправмы3,13. Эти подходы имеют тот недостаток, что требуют специальной подготовки по навыкам микрохирургии, что отнимает много времени у любого нового оператора и может препятствовать их использованию в краткосрочных проектах. Кроме того, они обычно вызывают повреждение окружающих тканей, что может повлиять на регенерацию.

Другой подход заключается в том, чтобы вызвать повреждение клеток химическим путем14 или с помощью генетических манипуляций15. Последнее позволяет наносить целенаправленный урон. Однако такой метод требует длительной подготовительной работы по получению новой трансгенной рыбы перед проведением любого эксперимента, обновляемого каждый раз, когда нацеливается уникальный тип клеток.

Таким образом, существует необходимость в методе, позволяющем проводить целенаправленные, но универсальные поражения, подходящие для различных исследований в области регенерации. Решение состоит в том, чтобы использовать лазер для индуцирования локализованного повреждения в интересующей ткани16,17,18,19,20. Действительно, использование лазерно-индуцированного повреждения тканей представляет собой надежный подход к созданию поражений спинного мозга со многими преимуществами. Микроскопы, оснащенные такими модулями лазерной манипуляции, позволяют указать область индивидуальной формы, где будет происходить абляция клеток, с дополнительным преимуществом временного контроля. Таким образом, размер и положение поражения могут быть адаптированы для решения любых вопросов.

Недостающей особенностью большинства лазерных систем поражения является возможность вызывать травмы высоко воспроизводимым способом для серии личинок. Здесь описан оригинальный протокол с использованием УФ-лазера для индуцирования полуавтоматических точных и контролируемых поражений у личинок рыбок данио на основе микрофлюидной платформы, предназначенной для автоматизированной обработки личинок21. Более того, в представленной здесь системе личинки вставляются в стеклянный капилляр, что позволяет свободно вращаться животному вокруг его рострокодальной оси. Пользователь может выбрать, какую сторону личинки представить лазеру, позволяя флуоресцентной визуализации точно нацеливаться на лазерный луч и оценивать повреждение после поражения.

Протокол, описанный здесь, используется с полуавтоматизированной системой визуализации личинок рыбок данио в сочетании со вращающимся диском, оснащенным ультрафиолетовым лазером (далее обозначенным как система VAST). Однако основные пункты протокола и большинство пунктов формулы техники справедливы для любой системы, оснащенной лазером, способным к абляции клеток, включая двухфотонные лазерные сканирующие микроскопы, вращающиеся дисковые микроскопы, снабженные УФ-лазером (модуль FRAP), или видеомикроскопы с лазерным модулем для фотоманипуляции. Одно из основных различий между системой VAST и обычной обработкой проб будет заключаться в том, что для последней потребуется установка личинок в агарозе с низкой температурой плавления на стеклянных крышках / чашках Петри со стеклянным дном вместо их загрузки в 96-луночную пластину.

Преимущества, предлагаемые этим методом, открывают возможности для инновационных исследований клеточных и молекулярных механизмов в процессе регенерации. Кроме того, высокое качество данных позволяет проводить количественные исследования в междисциплинарном контексте.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все исследования на животных проводились с одобрения Министерства внутренних дел Великобритании и в соответствии с его правилами, в соответствии с лицензией на проект PP8160052. Проект был одобрен Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Эдинбургского университета. Для экспериментальных анализов личинки рыбок данио до 5-дневного возраста обоих полов использовали следующие доступные трансгенные линии: Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg(Xla.Tubb:DsRed), Tg(бетаактин:утрофин-mCherry), Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) и Tg(mnx1:gfp) (см. Дополнительный файл 1 относительно генерации трансгенных линий рыбок данио). Схема протокола с использованием автоматизированной платформы обработки личинок рыбок данио показана на рисунке 1. Все пользовательское программное обеспечение, скрипты и подробные экспериментальные протоколы, используемые в этой работе, доступны на https://github.com/jasonjearly/micropointpy/.

1. Пробоподготовка

  1. Через 5 часов после оплодотворения отсортируйте эмбрионы для правильной стадии развития21. Выбросьте мертвые яйцеклетки и слаборазвитые и переразвитые эмбрионы.
  2. Через 3 дня после оплодотворения (dpf) обезболивают личинок, добавляя 2 мл 0,4% аминобензойной кислоты-этилметил-эфира к 50 мл рыбьей воды в чашке Петри 90 мм. Используйте животных, выращенных с фенилтиомочевиной (PTU) (см. Таблицу материалов), чтобы предотвратить пигментацию кожи, если это проблема, чего нет в случае травм спинного мозга на личинках 3 dpf, описанных в этом протоколе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта относительно высокая концентрация анестетика используется для предотвращения движений личинок после лазерного воздействия.
  3. Скрининг эмбрионов на флуоресцентную репортерную экспрессию (Дополнительный файл 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентный репортер для спинного мозга (или другой структуры, представляющей интерес) часто требуется для оценки эффективности травмы. Применение tg(Xla.Tubb:DsRed) помогает идентифицировать спинной мозг.
  4. Перенесите выбранных личинок в 96-луночную пластину для использования в системе VAST (см. Таблицу материалов) с 300 мкл воды рыбного объекта на скважину. Используйте среду, содержащую анестетик из 90 мм чашки Петри напрямую. Убедитесь, что на лунку приходится только одна личинка. Подготовьте одну дополнительную пустую 96-луночную пластину, чтобы собрать пораженных личинок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании другой лазерной системы поражения установите личинки в 1% агарозный гель с низкой температурой плавления (LMP) в соответствующей камере наблюдения.

2. Подготовка микроскопа

  1. Включите все компоненты системы (VAST, микроскоп, лазер, ПК), включая лазер для абляции.
  2. Как только аппаратное обеспечение будет полностью инициализировано, запустите программное обеспечение микроскопа, ImageJ / Fiji, интегрированную среду разработки Python (IDE) и автоматизированное программное обеспечение для визуализации рыбок данио (система VAST) при использовании этой платформы (см. Таблицу материалов).
  3. Настройте программное обеспечение VAST, выполнив следующие действия.
    1. Когда программное обеспечение VAST запустится, выберите Plate в первом окне и нажмите кнопку Done (Done) (рисунок 2A). Появится еще одно маленькое окошко, спрашивающее, пуст ли капилляр и чист. Проверьте, посмотрев на изображение капилляра, есть ли внутри пузырьки воздуха. Если нет, нажмите Кнопка Да. Если есть какие-либо пузырьки, нажмите No и следуйте шагу 2.3.2-2.3.3 (рисунок 2B).
    2. В окне Пробоотборник крупных частиц (LP) нажмите на Prime , чтобы удалить пузырьки воздуха (рисунок 2C).
    3. Перейдите в главное окно программного обеспечения (с капиллярным изображением) и щелкните правой кнопкой мыши на изображении. Выберите Записать пустое капиллярное изображение во всплывающем меню (рисунок 2B).
    4. В окне LP Sampler перейдите в меню Файл и выберите опцию Открыть сценарий . Выберите файл, содержащий сценарий, соответствующий выполняемому эксперименту.
    5. В главном окне программного обеспечения VAST перейдите в файл и выберите Открыть эксперимент. Выберите файл эксперимента, соответствующий запланированному эксперименту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что флажки Автоматическая выгрузка и Массовый вывод в отходы НЕ установлены.
  4. Настройте программное обеспечение микроскопа для визуализации.
    1. Запустите программное обеспечение для визуализации микроскопа (см. Таблицу материалов) для инициализации оборудования. Это может занять несколько минут, в зависимости от системы.
    2. Зайдите в настройки сбора и настройте микроскоп для визуализации флуорофора, экспрессируемого в личинках. Используйте объектив для погружения в воду 10x NA 0,5, чтобы убедиться, что фокусный объем достаточно удлинен вдоль оптической оси, чтобы повредить всю глубину спинного мозга или целевой ткани.
  5. Настройка ImageJ/Fiji для лазерных поражений.
    1. Перейдите в меню Файл , выберите Создать/Сценарий , чтобы открыть окно скрипта.
    2. В окне Создать перейдите в меню Файл и выберите Открыть , чтобы загрузить сценарий лазерного поражения (Manual_MP_Operation.ijm).
  6. Настройте интегрированную среду разработки Python.
    1. Запустите интегрированную среду разработки Python.
    2. Перейдите в меню Файл и выберите Открыть файл , чтобы загрузить сценарий для управления лазером (Watch_for_ROIs_py3.py).
    3. Перейдите в меню «Выполнить» и выберите «Выполнить без отладки», чтобы запустить сценарий. Убедитесь, что последовательность сообщений на панели TERMINAL отображается вместе с некоторым шумом во время инициализации лазерного аттенюатора (рисунок 2D).

3. Выполнение лазерных поражений на системе VAST

  1. Центрируйте капилляр относительно объектива микроскопа, перемещая сцену, нажимая на кнопки со стрелками в главном окне программного обеспечения VAST (рисунок 2B).
  2. Сосредоточьтесь на верхней части капилляра, глядя через окуляры и используя проходящий свет микроскопа.
    ВНИМАНИЕ: Капилляр очень хрупкий и может сломаться при прикосновении к цели. Медленно перемещайте ручку микроскопа при фокусировке внутрь и наружу.
  3. Поместите пластины с 96 лунками на держатель пластин пробоотборника LP системы VAST. Поместите пластину, содержащую личинки, на левый держатель и пластину для сбора справа. Убедитесь, что пластины правильно ориентированы: колодец А1 должен находиться в переднем левом углу держателя.
  4. В программном обеспечении VAST в окне LP Sampler нажмите кнопку Шаблон пластины и выберите все колодцы, содержащие личинки. Нажмите кнопку OK для проверки и закрытия окна (рисунок 2C).
  5. В окне LP Sampler нажмите на кнопку Run Plate , чтобы начать загрузку личинки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Через некоторое время личинка должна быть видна в капилляре в положении (предопределенном в файле определения эксперимента), позволяющем травмировать спинной мозг. Свет лотка VAST погаснет после нескольких вращений, чтобы установить личинку боковой стороной, обращенной к объективу микроскопа.
  6. Перейдите к программному обеспечению микроскопа и нажмите кнопку Live , чтобы сфотографировать личинку.
  7. Поверните ручку фокусировки микроскопа до тех пор, пока не будет виден центральный канал спинного мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть легче сфокусироваться, используя сначала проходящий свет, а затем уточнить с помощью флуоресценции.
  8. Сделайте снимок во флуоресценции и сохраните изображение в выделенной папке.
  9. Откройте изображение в ImageJ и при необходимости отрегулируйте контрастность (с помощью меню Image/Adjust/Brightness/contrast... в ImageJ).
  10. Нажмите на инструмент «Область интереса» (ROI) и нарисуйте короткую линию (20 мкм), центрированную на спинном мозге (рисунок 3A).
  11. Переключите микроскоп в положение 100% отражающего зеркала.
  12. Загрузите скрипт ImageJ и нажмите кнопку Выполнить . Используйте следующие параметры: Повторение - 2; Образец - 1; Ширина - 40-микрон; Затухание - 89 (полная мощность лазера) (рисунок 3С).
  13. Когда последовательность лазерного снимка будет завершена, переключитесь на флуоресцентную визуализацию в программном обеспечении для визуализации и при необходимости отрегулируйте фокус.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смещение фокуса часто наблюдается из-за смещения хвоста во время лазерного воздействия.
  14. Сделайте новый снимок и сохраните его.
  15. Откройте это новое изображение в ImageJ и нарисуйте новую линию, которая должна быть больше, чем сам спинной мозг (~ 80 мкм), начиная с вентральной стороны спинного мозга в верхней части нотохорды и идущей к спинной стороне, чтобы закончиться в пространстве между спинным мозгом и кожей (рисунок 3B).
  16. Переключите микроскоп в положение 100% отражающего зеркала.
  17. Перейдите в окно скрипта ImageJ и нажмите кнопку Выполнить . Используйте следующие параметры: Повторение - 2; Образец - 1; Ширина - 40 мкм; Затухание - 89 (Полная мощность лазера).
  18. После завершения (более длинной) последовательности лазерного снимка проверьте качество трансэкции путем визуализации флуоресценции и фокусировки. Убедитесь, что ни одна клетка или аксоны не остались нетронутыми в месте поражения, которое должно выглядеть как темная или как слабая и однородная флуоресцентная область (рисунок 3D, нижняя панель).
  19. Соберите пораженных личинок в пустую 96-луночную пластину (с теми же координатами скважины, что и у оригинальной скважины), перейдя в главное окно программного обеспечения VAST и нажав на кнопку Собрать .
  20. Снова включите системный индикатор VAST, нажав на флажок Tray Light в левом нижнем углу окна.
  21. Повторите этап 3.3-3.17 для каждой новой личинки, подлежащей травме.

4. Обработка после поражения и дополнительные эксперименты

  1. Выньте личинок из 96-луночной пластины как можно скорее и перенесите их в чистую чашку Петри со свежей рыбной водой, чтобы личинки могли восстановиться после поражения. Поместите чашку Петри в инкубатор при температуре 28 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повреждение часто продолжает распространяться в первый час после поражения. Таким образом, фактическая степень поражения должна быть оценена с помощью флуоресцентной визуализации после задержки примерно в 1 ч.

5. Устранение неполадок

  1. Если пузырьки воздуха присутствуют в трубках и капиллярах системы VAST, нажмите кнопку Prime в окне LP Sampler, чтобы удалить их.
  2. Рассмотрим неудачные поражения (оцениваемые по оставшейся флуоресценции в месте поражения, за исключением ожидаемого остаточного и однородного фона), которые могут быть обусловлены несколькими причинами, упомянутыми ниже.
    1. Низкая мощность лазера: когда это произойдет, попробуйте с более высоким значением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Система VAST оснащена лазером красителя. Это означает, что концентрация раствора красителя, используемого для генерации лазерного света, может меняться со временем, что приводит к снижению мощности лазера. Замена на свежий раствор обычно решает проблему22.
    2. Плохая калибровка: Когда это происходит, проверьте калибровку и мощность лазерной системы в соответствии с шагом 5.2.2.1-5.2.2.4. При неправильной калибровке лазер не будет направлен в нужное место, что приведет к неудачным поражениям или нежелательным повреждениям в соседних тканях.
      1. Поместите зеркальную горку поверх капиллярной камеры. Сосредоточьтесь на покрытой стороне (она должна быть обращена к цели). Используйте предыдущее значение по умолчанию на слайде, чтобы было легче фокусироваться.
      2. Примените схему лазерной абляции с помощью калибровочного скрипта.
      3. Оцените качество шаблона. Пятна или линии должны быть четкими, а не размытыми.
      4. Используйте рампу с увеличивающейся мощностью, чтобы оценить, изменилась ли мощность лазера по сравнению с предыдущими сеансами.
    3. Движение личинок во время поражений: Личинки по-разному реагируют на анестезию; таким образом, лазерное поражение может вызвать движения хвоста во время процесса, тем самым препятствуя успешной трансекции. Когда это произойдет, сделайте дополнительную итерацию шагов лазерного поражения, чтобы завершить его, избегая при этом повреждения окружающих тканей.
    4. Плохая фокусировка: когда это происходит, сосредоточьтесь на середине центрального канала, чтобы получить наилучшие результаты.
    5. Рисование, положение и размер ROI: положение и размер ROI имеют решающее значение для успешного выполнения. ROI должен быть больше, чем спинной мозг, и сосредоточен в центре спинного мозга. Чтобы решить эту проблему, начните рисовать ROI с вентральной стороны спинного мозга и поднимитесь к дорсальной стороне, чтобы получить успешную трансекцию. Вероятно, это связано с движениями хвоста, вызванными последовательностью лазерных выстрелов во время процедуры абляции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Валидация трансекции спинного мозга
Структурные и функциональные исследования были проведены, чтобы оценить, допускает ли протокол полную трансекцию спинного мозга.

Во-первых, чтобы убедиться, что потеря флуоресценции в месте поражения была вызвана повреждением нейрональной ткани, а не флуоресцентным фотоотбеливанием от лазерного освещения, было выполнено иммуноокрашивание с использованием антитела против ацетилированного тубулина (см. Таблицу материалов и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Существует острая необходимость в более глубоком понимании процессов, происходящих во время регенерации у рыбок данио. Эта модель на животных предлагает много преимуществ для биомедицинских исследований, в частности для травм спинного мозга1. Большинство исследований включают ручные поражения, которые требуют хорошо обученного оператора и вызывают повреждение нескольких тканей. Здесь представлен протокол лазерного поражения, позволяющий контролировать характеристики поражения и уменьшать поврежден...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано BBSRC (BB/S0001778/1). CR финансируется Программой стипендий Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Program. Мы благодарим Дэвида Гринальда (CRH, Эдинбургский университет) и Кэти Рид (CDBS, Эдинбургский университет) за добрый подарок трансгенной рыбы (см. Дополнительный файл). Мы благодарим Даниэля Сунга (CRH, Эдинбургский университет) за добрый доступ к конфокальному 3i-вращающемуся диску.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Software
Программное обеспечение для микроскопа Zen Blue 2.0Carl Zeiss
ImageJ/FIJIс открытым исходным кодом
Visual Studio CodeMicrosoft
Microscope and accessories
ApoTome микроскопCarl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) фокусный объективCarl Zeiss
dual AxioCam 506 м ПЗС-камерыCarl Zeiss
Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп LSM880Carl Zeiss
Модуль вращающегося диска CSU-X1Yokogawa
Вертикальный микроскопAxio Examiner D1Carl Zeiss
УФ-лазерMicropoint
VAST BioImagerUnion Biometrica
Labware
90 мм чашка ПетриThermo-Fisher101R20
96-луночная пластинаCorning3841
Chemicals
Набор для визуализации Click-It EdUInvitrogenC10637
аминобензойная кислота-этилметиловый эфир (MS222)Sigma-AldrichA5040
фенилтиомочевина (PTU)Sigma-AldrichP7629
антитела
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488Jackson703-545-155
Мышиный анти-мышиный Cy3Jackson715-165-150
Мышиный анти-GFPAbcamAB13970
мышиной антитубулиновый ацетилированный антителоSigmaT6793
трансгенные линии данио
Tg(бета-актин:утрофин-mCherry)N/AУстановлено Дэвидом Гринхалдом, University of Edinburgh
Tg(mnx1:gfp)N/AВпервые описан в [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed)N/AВпервые описан в [Peri and Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed; mpeg1:GFP)N/AОснован Кэти Рид, Университет Эдинбурга
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)N/AОснован Дэвидом Гринхалдом, Университет Эдинбурга

Ссылки

  1. Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
  2. Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
  3. Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
  4. Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
  5. Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
  6. Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
  7. Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
  8. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. , Available from: https://nc3rs.org.uk (2021).
  9. Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
  10. Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
  11. Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
  12. Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
  13. Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
  14. Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
  15. Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
  16. Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
  17. Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
  18. Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
  19. Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
  20. Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
  21. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  22. AndOr Micropoint Manual. , Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021).
  23. Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260(2017).
  24. Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
  25. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  26. Howell, D. Statistical methods for psychology. , Duxbury. 324-325 (2002).
  27. Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
  28. Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
  29. Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  30. Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 4/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.

The title was updated from:

Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

to:

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Теги

Контролируемые полуавтоматизированные лазерно-индуцированные повреждения для изучения регенерации спинного мозга у личинок рыбок данио
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.