Его-меточная очистка, диализ и активация используются для повышения выхода растворимой, активной матриксной металлопротеиназы-3 каталитического домена экспрессии белка у бактерий. Белковые фракции анализируются с помощью гелей SDS-PAGE.
Методическая статья
* These authors contributed equally
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,22 & микро; m стерильный фильтр | Sigma Aldrich | SLGP033RS | Используется для удаления некоторых загрязнений из белкового экстракта перед очисткой и предотвращения засорения колонки Ni-NTA |
| л Колбы Erlenmeyer | Thermo Fisher Scientific | S76106F | н/д |
| 1 л стеклянные бутылки | Thermo Fisher Scientific | 06-414-1D | н/д |
| 1,5 мл микрофуги | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | н/д |
| 15 мл конические пробирки | Thermo Fisher Scientific | 339650 | н/д |
| 18 г, 1-дюймовая скошенная игла | Amazon | B07S7VBHM2 | Используется в сочетании с диализной казеткой |
| 2 мл обессоливающей колонки | Thermo Fisher Scientific | 89890 | Удаляет APMA после активации |
| 2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота (MES) | Thermo Fisher Scientific | AAA1610422 | н/д |
| Конические подушки для бутылок 250 мл | Thermo Fisher Scientific | 05-538-53A | Стабилизируйте конические бутылки при центрифугировании большого объема |
| Конические бутылки 250 мл | Thermo Fisher Scientific | 05-538-53 | н/д |
| 400 мл с мешалкой | Sigma Aldrich | UFSC40001 | Реконцентрирует гораздо больший объем, чем центробежный фильтрующий блок. Клетки Rosetta2(DE3)pLysS продуцируют большие объемы белка, которые могут превышать предел в 15 мл центробежного фильтрующего блока |
| 4-аминофенилртутинового ацетата (APMA) | Sigma Aldrich | A9563-5G | Активирует MMP-3 путем расщепления пропептида |
| Шприц 5 мл | Thermo Fisher Scientific | NC0829167 | Используется в сочетании с диализной казеткой |
| 50 мл конические пробирки | Thermo Fisher Scientific | 339650 | Используется для хранения на многих этапах очистки |
| 50 мл реконцентрационной пробирки | Sigma Aldrich | UFC901024D | Используется для повторной концентрации образцов белка после диализа или удаления загрязнений |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-500 | Буферный ингредиент, который затвердевает автоклавный LB фильтрующий материал при охлаждении |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | Антибиотик, используемый с вектором pET3a; используется в 100 & микро; г/мл в средах LB |
| BamHI | NEB | R3136S | Фермент рестрикции для использования с вектором pET3a |
| Хлорид кальция (CaCl2) | Thermo Fisher Scientific | 600-30-23 | Ион кальция стабилизирует структуру MMP |
| Распространители клеток | Thermo Fisher Scientific | 50-189-7544 | Может использоваться для распределения клеток по чашке Петри после трансформации |
| Хлорамфеникол | Thermo Fisher Scientific | 22-055-125GM | Антибиотик, используемый с вектором pET3a; используется при 34 & микро; г/мл в средах LB |
| Диализный буфер 1 | н/д | н/д | 20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 10 мМ CaCl<суб>2, 1 & микро; M ZnCl2, 4 M мочевины. |
| Диализный буфер 2 | н/д | н/д | 20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 10 мМ CaCl<суб>2, 1 & микро; M ZnCl2, 2 M мочевины. |
| Диализный буфер 3 | н/д | н/д | 20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 10 мМ CaCl<суб>2, 1 &м; M ZnCl2. |
| Диализные зажимы | Thermo Fisher Scientific | 68011 | Используются в сочетании с диализной трубкой из змеиной кожи |
| Диализная трубка | Thermo Fisher Scientific | 88243 | Альтернативный метод диализа, который вмещает гораздо большие объемы пробы, но с более высоким риском потери пробы |
| Буфер для расщепления | NEB | B7204S | Буфер, используемый при переваривании вектора pET3a |
| Одноразовые кюветы | Thermo Fisher Scientific | 21-200-257 | Используется для измерения OD бактериальной культуры во время роста и экспрессии |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | D107125G | Способствует денатурации белков за счет уменьшения любых дисульфидных связей |
| Смесь сборки ДНК | NEB | E2621S | Используется для лигирования продукта ПЦР Hisx6-pro-MMP-3cd и расщепленной векторной ДНКазы pET3a |
| I | NEB | M0303S | Эндонуклеаза для разложения неблагоприятных загрязнителей ДНК, которые впоследствии могут повлиять на очистку белка |
| Этанол | Thermo Fisher Scientific | A995-4 | н/д |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) | Thermo Fisher Scientific | J15694-AE | Используется при денатурации. Предотвращает окисление и последующее образование дисульфидных связей |
| Набор для восстановления геля | Promega | A9281 | Изоляет и очищает ДНК от агарозных гелей |
| Глицерин | Thermo Fisher Scientific | G33-500 | Используется для изготовления запасов глицерина, которые замораживаются при -80 °°; C |
| Колонка с гравитационным потоком | BioRad | 7321010 | Используется для очистки Ni-NTA рекомбинантно меченных His-меченных белков |
| Высокотрансформационные клетки | NEB | C2987 | Высокотрансформационные клетки с повышенными шансами на успех для клонирования N-концевой His-метки в конструкцию pET3a-pro-MMP-3cd |
| HT Elution Buffer | н/д | н/д | 20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 6 М мочевины, 250 мМ имидазола. Отрегулируйте pH до 7,4 |
| HT Уравновешивающий буфер | н/д | 20 | мМ Tris-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 6 М мочевины. Отрегулируйте pH до 7,4 |
| HT Регенерационный буфер | н/д н | /д | 20 мМ MES, 0,1 М NaCl. Отрегулируйте pH до 5,0 |
| HT Wash Buffer | n/a n | /a | 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 6 M мочевины, 25 mM имидазола. Отрегулируйте pH до 7,4 |
| Соляная кислота (HCl) | Thermo Fisher Scientific | A144C-212 | Используется для буферов |
| pH Имидазол | Thermo Fisher Scientific | AAA1022122 | имитирует боковую группу гистидина. Используется для выделения неспецифически связывающихся белков из меченого им целевого белка |
| Inclusion Body Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0,5 M мочевины. Отрегулируйте pH до 8,0 |
| Изопропил-ß-D-тиогалактопиранозид (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | FERR0392 | Реагент, который индуцирует экспрессию целевых генов в pET3a. Внесите 0,5 мл 1 М аликвот, процедите стерилизовать и хранить при температуре -20°С; C |
| LB Amp CamR media | n/a | n/a | Для заливки в стерильную бутылку объемом 1 л или колбу объемом 1 л. На 1 л добавьте 25 г бульона. Стерилизовать автоклавированием. После охлаждения до температуры ниже 50 градусов; В, добавить ампициллин до 100 &; г/мл и левомицетина до 34 &мкм; г/мл |
| LB Amp CamR тарелки | н/д | /д | Для разлива в стерильные чашки Петри. Поливайте до полного закрытия крышки чашки Петри. Из 1 л среды получается 40-60 пластин. На 1 л: 25 г фунта бульона, 16 г агара. Стерилизовать автоклавированием. После охлаждения до температуры ниже 50 градусов; В, добавить ампициллин до 100 &; г/мл и левомицетина до 34 &мкм; г/мл |
| LB Бульон | Thermo Fisher Scientific | BP1426-2 | Предварительно смешан с триптоном, экстрактом дрожжей и |
| буфером для лизиса | н/д н | /д | 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 0,133 г/мл лизоцима, 0,49% v/v Triton X-100. Отрегулируйте pH до 8,0 |
| Лизоцим | MP Biomedicals | 195303 | используется для экстракции белка. Фермент, который лизирует клеточные стенки бактерий |
| Miniprep kit | Promega | A1330 | В случае успеха извлекает конструкцию pET3a-pro-MMP-3cd из трансформантов |
| NdeI | NEB | R0111S | Рестрикционный фермент для использования с векторной смолой pET3a |
| Ni-NTA | Thermo Fisher Scientific | PI88221 | Используется для связывания рекомбинантных меченых им белков. Это сильное взаимодействие может быть компенсировано более высокими концентрациями имидазола |
| неионогенного поверхностно-активного вещества | Thermo Fisher Scientific | PI28316 | Storage для предотвращения агрегации MMP. Минимизирует взаимодействие между гидрофобными остатками на поверхности ММП и молекулами воды, не нарушая каталитическую активность. |
| ПЦР микс | NEB | M0492S | ПЦР реагент для вставки N-концевой his-tag в вектор pET3a-pro-MMP-3cd |
| pET плазмида | Addgene | n/a | Вектор pET3a обеспечивает устойчивость к ампициллину, индуцируемую экспрессию гена-мишени и секвенирование с помощью Т7 праймеров чашки |
| Петри | чашки Петри VWR | 25384-342 | Используется для покрытия трансформантов на LB агаровых средах |
| R2DP клетки | Novagen | 714033 | производные BL21 с усиленной экспрессией эукариотических белков. Содержат тРНК кодонов, которые редко встречаются в питательных средах e. coli |
| SOC | NEB | B9020S | Неселективные питательные среды для быстрого роста во время трансформации |
| Хлорид натрия (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | Используется в буферах и помогает обеспечить стабильность белка |
| Дезоксихолат натрия | Thermo Fisher Scientific | PI89905 | Моющее средство, используемое при экстракции белка. Лизирует клеточные стенки |
| Солюбилизирующий буфер | н/д н | /д | 20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 10 мМ DTT, 6 М мочевины. Отрегулируйте pH до 8,0 |
| Tris base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | Общий буфер, используемый в физиологическом диапазоне pH. Термочувствительный |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | M1122980101 | Моющее средство, используемое для лизиса клеток |
| Мочевина | Thermo Fisher Scientific | AAJ75826A7 | Первый хаотропный агент для разрушения вторичной структуры белка |
| Хлорид цинка (ZnCl2) | Thermo Fisher Scientific | AAA162810E | Стабилизирует структуру MMP. Ион цинка содержится в каталитическом центре ММП-3 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение