Методическая статья

Бактериальная экспрессия и очистка металлопротеиназы-3 матрицы человека с помощью аффинной хроматографии

DOI:

10.3791/63263

⸱

30 марта 2022 г.

 ,  , 
1Department of Chemical & Materials Engineering, University of Nevada, Reno

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Его-меточная очистка, диализ и активация используются для повышения выхода растворимой, активной матриксной металлопротеиназы-3 каталитического домена экспрессии белка у бактерий. Белковые фракции анализируются с помощью гелей SDS-PAGE.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Матриксные металлопротеиназы (MMP) принадлежат к семейству протеаз метцинцина с центральной ролью в деградации и ремоделировании внеклеточного матрикса (ECM), а также взаимодействиях с несколькими факторами роста и цитокинами. Сверхэкспрессия специфических MMP ответственна за несколько заболеваний, таких как рак, нейродегенеративные заболевания и сердечно-сосудистые заболевания. В последнее время MMP находятся в центре внимания в качестве мишеней для разработки терапевтических средств, которые могут лечить заболевания, коррелирующие с гиперэкспрессией MMP.

Для изучения механизма MMP в растворе необходимы более легкие и надежные методы экспрессии и очистки рекомбинантного белка для производства активных, растворимых MMP. Однако каталитический домен большинства MMP не может быть выражен в Escherichia coli (E. coli) в растворимой форме из-за отсутствия посттрансляционного механизма, тогда как системы экспрессии млекопитающих обычно являются дорогостоящими и имеют более низкие выходы. Органы включения MMP должны пройти утомительный и трудоемкий процесс обширной очистки и переворачивания, значительно снижая выход MMP в нативной конформации. В данной работе представлен протокол с использованием клеток Rosetta2(DE3)pLysS (далее именуемых R2DP) для получения матричного металлопротеиназы-3 каталитического домена (MMP-3cd), который содержит N-концевую His-метку, за которой следует про-домен (Hisx6-pro-MMP-3cd) для использования в аффинной очистке. Клетки R2DP усиливают экспрессию эукариотических белков через резистентную к хлорамфениколу плазмиду, содержащую кодоны, обычно редкие в системах экспрессии бактерий. По сравнению с традиционной клеточной линией выбора для экспрессии рекомбинантного белка, BL21(DE3), очистка с использованием этого нового штамма улучшила выход очищенного Hisx6-pro-MMP-3cd. После активации и обессоливания домен pro расщепляется вместе с N-терминалом His-tag, обеспечивая активный MMP-3cd для немедленного использования в бесчисленных приложениях in vitro . Этот метод не требует дорогостоящего оборудования или сложного слияния белков и описывает быстрое производство рекомбинантных человеческих MMP в бактериях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Большинство сложных эукариотических белков подвергаются сложным посттрансляционным модификациям после экспрессии, требуя высокоэффективного сворачивания белка и кофакторов, чтобы быть функциональными1. Производство большого количества растворимого человеческого белка в бактериальном хозяине остается серьезной проблемой из-за высоких затрат и отсутствия надежных методов экспрессии и очистки, даже для небольших лабораторных экспериментов2,3. MMP, эндопептидазы человека с большой молекулярной массой, обычно экспрессируются в виде нерастворимых тел включения при экспрессии в E. coli.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Выражение MMP

  1. Клонирование и преобразование pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd в ячейки R2DP
    1. Переваривайте плазмиду pET-3a (см. Таблицу материалов) ферментами рестрикции NdeI и BamHI в пищеварительном буфере (см. Таблицу материалов). В общем реакционном объеме 40 мкл добавьте 4 мкл пищеварительного буфера, 33 мкл плазмиды 100 нг/мкл и 1,5 мкл каждого фермента рестрикции и дайте реакции продолжаться в течение ~2 ч до завершения при 37 °C.
    2. Выполните реакцию ПЦР на последовательности MMP-3cd, чтобы вставить N-концевую His-метку. Используйте 25 мкл ПЦР-смеси (см. Таблицу материалов),....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При запуске образцов на SDS-PAGE, поскольку белок экспрессируется в виде нерастворимых тел включения, лизированные и обработанные ультразвуком фракции должны практически не содержать экстракта Hisx6-pro-MMP-3cd, так как белок еще не был повторно растворен в мочевине. На рисунке 3 сравниваются фракции элюирования очистки His-tag Hisx6-pro-MMP-3cd из клеток BL21(DE3) и R2DP-клеток. Фракции элюирования были объединены отдельно для клеток BL21 (DE3) и R2DP перед диализом. Фракции с каждой стадии.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Крупномасштабное производство растворимых, человеческих, рекомбинантных MMP остается сложной задачей. Клетки млекопитающих могут экспрессировать функциональные MMP при высоких затратах и длительном времени ожидания, тогда как E. coli быстро производит большое количество тел включения MMP, которые должны быть очищены и повторно свернуты11,16. Ячейки R2DP значительно увеличивают выход тел включения MMP, обеспечивая более экономичный и продуктивный процесс .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Эветт Радиски и Александру Хокла из клиники Майо в Джексонвилле, штат Флорида, за предоставление плазмиды pET-3a-pro-MMP-3cd в качестве шаблона для клонирования гена Hisx6pro-MMP-3cd, и их комментарии вместе с доктором Полом Хартли из Центра геномики Невады в Университете Невады, Рино, для секвенирования ДНК. Авторы также хотели бы поблагодарить Кассандру Хергенрайдер за помощь с частью экспрессии белка. М.Р.-С. хотели бы поблагодарить грант NIH-P20 GM103650-COBRE Integrative Neuroscience и грант UNR R&D mICRO SEED Grant Award.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,22 & микро; m стерильный фильтрSigma AldrichSLGP033RSИспользуется для удаления некоторых загрязнений из белкового экстракта перед очисткой и предотвращения засорения колонки Ni-NTA
л Колбы ErlenmeyerThermo Fisher ScientificS76106Fн/д
1 л стеклянные бутылкиThermo Fisher Scientific06-414-1Dн/д
1,5 мл микрофугиThermo Fisher Scientific02-682-002н/д
15 мл конические пробиркиThermo Fisher Scientific339650н/д
18 г, 1-дюймовая скошенная иглаAmazonB07S7VBHM2Используется в сочетании с диализной казеткой
2 мл обессоливающей колонкиThermo Fisher Scientific89890Удаляет APMA после активации
2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота (MES)Thermo Fisher ScientificAAA1610422н/д
Конические подушки для бутылок 250 млThermo Fisher Scientific05-538-53AСтабилизируйте конические бутылки при центрифугировании большого объема
Конические бутылки 250 млThermo Fisher Scientific05-538-53н/д
400 мл с мешалкойSigma AldrichUFSC40001Реконцентрирует гораздо больший объем, чем центробежный фильтрующий блок. Клетки Rosetta2(DE3)pLysS продуцируют большие объемы белка, которые могут превышать предел в 15 мл центробежного фильтрующего блока
4-аминофенилртутинового ацетата (APMA)Sigma AldrichA9563-5GАктивирует MMP-3 путем расщепления пропептида
Шприц 5 млThermo Fisher ScientificNC0829167Используется в сочетании с диализной казеткой
50 мл конические пробиркиThermo Fisher Scientific339650Используется для хранения на многих этапах очистки
50 мл реконцентрационной пробиркиSigma AldrichUFC901024DИспользуется для повторной концентрации образцов белка после диализа или удаления загрязнений
AgarThermo Fisher ScientificBP1423-500Буферный ингредиент, который затвердевает автоклавный LB фильтрующий материал при охлаждении
AmpicillinThermo Fisher ScientificBP1760-25Антибиотик, используемый с вектором pET3a; используется в 100 & микро; г/мл в средах LB
BamHINEBR3136SФермент рестрикции для использования с вектором pET3a
Хлорид кальция (CaCl2)Thermo Fisher Scientific600-30-23Ион кальция стабилизирует структуру MMP
Распространители клетокThermo Fisher Scientific50-189-7544Может использоваться для распределения клеток по чашке Петри после трансформации
ХлорамфениколThermo Fisher Scientific22-055-125GMАнтибиотик, используемый с вектором pET3a; используется при 34 & микро; г/мл в средах LB
Диализный буфер 1н/дн/д20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 10 мМ CaCl<суб>2, 1 & микро; M ZnCl2, 4 M мочевины.
Диализный буфер 2н/дн/д20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 10 мМ CaCl<суб>2, 1 & микро; M ZnCl2, 2 M мочевины.
Диализный буфер 3н/дн/д20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 10 мМ CaCl<суб>2, 1 &м; M ZnCl2.
Диализные зажимыThermo Fisher Scientific68011Используются в сочетании с диализной трубкой из змеиной кожи
Диализная трубкаThermo Fisher Scientific88243Альтернативный метод диализа, который вмещает гораздо большие объемы пробы, но с более высоким риском потери пробы
Буфер для расщепленияNEBB7204SБуфер, используемый при переваривании вектора pET3a
Одноразовые кюветыThermo Fisher Scientific21-200-257Используется для измерения OD бактериальной культуры во время роста и экспрессии
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificD107125GСпособствует денатурации белков за счет уменьшения любых дисульфидных связей
Смесь сборки ДНКNEBE2621SИспользуется для лигирования продукта ПЦР Hisx6-pro-MMP-3cd и расщепленной векторной ДНКазы pET3a
INEBM0303SЭндонуклеаза для разложения неблагоприятных загрязнителей ДНК, которые впоследствии могут повлиять на очистку белка
ЭтанолThermo Fisher ScientificA995-4н/д
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Thermo Fisher ScientificJ15694-AEИспользуется при денатурации. Предотвращает окисление и последующее образование дисульфидных связей
Набор для восстановления геляPromegaA9281Изоляет и очищает ДНК от агарозных гелей
ГлицеринThermo Fisher ScientificG33-500Используется для изготовления запасов глицерина, которые замораживаются при -80 °°; C
Колонка с гравитационным потокомBioRad7321010Используется для очистки Ni-NTA рекомбинантно меченных His-меченных белков
Высокотрансформационные клеткиNEBC2987Высокотрансформационные клетки с повышенными шансами на успех для клонирования N-концевой His-метки в конструкцию pET3a-pro-MMP-3cd
HT Elution Bufferн/дн/д20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 6 М мочевины, 250 мМ имидазола. Отрегулируйте pH до 7,4
HT Уравновешивающий буферн/д20мМ Tris-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 6 М мочевины. Отрегулируйте pH до 7,4
HT Регенерационный буферн/д н/д20 мМ MES, 0,1 М NaCl. Отрегулируйте pH до 5,0
HT Wash Buffern/a n/a20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 6 M мочевины, 25 mM имидазола. Отрегулируйте pH до 7,4
Соляная кислота (HCl)Thermo Fisher ScientificA144C-212Используется для буферов
pH ИмидазолThermo Fisher ScientificAAA1022122имитирует боковую группу гистидина. Используется для выделения неспецифически связывающихся белков из меченого им целевого белка
Inclusion Body Buffern/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0,5 M мочевины. Отрегулируйте pH до 8,0
Изопропил-ß-D-тиогалактопиранозид (IPTG)Thermo Fisher ScientificFERR0392Реагент, который индуцирует экспрессию целевых генов в pET3a. Внесите 0,5 мл 1 М аликвот, процедите стерилизовать и хранить при температуре -20°С; C
LB Amp CamR median/an/aДля заливки в стерильную бутылку объемом 1 л или колбу объемом 1 л. На 1 л добавьте 25 г бульона. Стерилизовать автоклавированием. После охлаждения до температуры ниже 50 градусов; В, добавить ампициллин до 100 &; г/мл и левомицетина до 34 &мкм; г/мл
LB Amp CamR тарелкин/д/дДля разлива в стерильные чашки Петри. Поливайте до полного закрытия крышки чашки Петри. Из 1 л среды получается 40-60 пластин. На 1 л: 25 г фунта бульона, 16 г агара. Стерилизовать автоклавированием. После охлаждения до температуры ниже 50 градусов; В, добавить ампициллин до 100 &; г/мл и левомицетина до 34 &мкм; г/мл
LB БульонThermo Fisher ScientificBP1426-2Предварительно смешан с триптоном, экстрактом дрожжей и
буфером для лизисан/д н/д50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 0,133 г/мл лизоцима, 0,49% v/v Triton X-100. Отрегулируйте pH до 8,0
ЛизоцимMP Biomedicals195303используется для экстракции белка. Фермент, который лизирует клеточные стенки бактерий
Miniprep kitPromegaA1330В случае успеха извлекает конструкцию pET3a-pro-MMP-3cd из трансформантов
NdeINEBR0111SРестрикционный фермент для использования с векторной смолой pET3a
Ni-NTAThermo Fisher ScientificPI88221Используется для связывания рекомбинантных меченых им белков. Это сильное взаимодействие может быть компенсировано более высокими концентрациями имидазола
неионогенного поверхностно-активного веществаThermo Fisher ScientificPI28316Storage для предотвращения агрегации MMP. Минимизирует взаимодействие между гидрофобными остатками на поверхности ММП и молекулами воды, не нарушая каталитическую активность.
ПЦР миксNEBM0492SПЦР реагент для вставки N-концевой his-tag в вектор pET3a-pro-MMP-3cd
pET плазмидаAddgenen/aВектор pET3a обеспечивает устойчивость к ампициллину, индуцируемую экспрессию гена-мишени и секвенирование с помощью Т7 праймеров чашки
Петричашки Петри VWR25384-342Используется для покрытия трансформантов на LB агаровых средах
R2DP клеткиNovagen714033производные BL21 с усиленной экспрессией эукариотических белков. Содержат тРНК кодонов, которые редко встречаются в питательных средах e. coli
SOCNEBB9020SНеселективные питательные среды для быстрого роста во время трансформации
Хлорид натрия (NaCl)Thermo Fisher ScientificBP358-1Используется в буферах и помогает обеспечить стабильность белка
Дезоксихолат натрияThermo Fisher ScientificPI89905Моющее средство, используемое при экстракции белка. Лизирует клеточные стенки
Солюбилизирующий буферн/д н/д20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 10 мМ DTT, 6 М мочевины. Отрегулируйте pH до 8,0
Tris baseThermo Fisher ScientificBP152-1Общий буфер, используемый в физиологическом диапазоне pH. Термочувствительный
Triton X-100Thermo Fisher ScientificM1122980101Моющее средство, используемое для лизиса клеток
МочевинаThermo Fisher ScientificAAJ75826A7Первый хаотропный агент для разрушения вторичной структуры белка
Хлорид цинка (ZnCl2)Thermo Fisher ScientificAAA162810EСтабилизирует структуру MMP. Ион цинка содержится в каталитическом центре ММП-3
1 н хлорида натрия

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Portolano, N., et al. Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897(2014).
  2. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

E coliHisSDS PAGER2DP

Похожие статьи