Эффективный и экономичный метод электропорации для изучения первичных реснично-зависимых сигнальных путей в предшественнике гранулярной клетки

Summary

Здесь мы представляем воспроизводимый протокол электропорации in vitro для генетических манипуляций с первичными предшественниками клеток гранул мозжечка (GCP), который является экономически эффективным, эффективным и жизнеспособным. Кроме того, этот протокол также демонстрирует простой метод молекулярного исследования первичных реснечно-зависимых сигнальных путей Hedgehog в первичных клетках GCP.

Abstract

Первичная ресничка является критической сигнальной органеллой, обнаруженной почти на каждой клетке, которая преобразует сигнальные стимулы Hedgehog (Hh) с поверхности клетки. В предшественнике гранулярной клетки (GCP) первичная ресничка действует как ключевой сигнальный центр, который организует пролиферацию клеток-предшественников, модулируя сигнальный путь Hh. Исследование первичного ресничково-зависимого сигнального механизма Hh облегчается генетическими манипуляциями in vitro с компонентами пути для визуализации их динамической локализации в первичной ресничке. Однако трансфекция трансгенов в первичных культурах ГКП с использованием известных в настоящее время методов электропорации, как правило, является дорогостоящей и часто приводит к низкой жизнеспособности клеток и нежелательной эффективности трансфекции. В этой статье представлен эффективный, экономичный и простой протокол электропорации, который демонстрирует высокую эффективность трансфекции ~ 80-90% и оптимальную жизнеспособность ячейки. Это простой, воспроизводимый и эффективный метод генетической модификации, который применим к изучению первичного ресничковозависимого сигнального пути ежа в первичных культурах GCP.

Introduction

Мозжечковые GCP широко используются для изучения механизма сигнального пути Hh в нейронных типах клеток-предшественников из-за их высокой распространенности и высокой чувствительности к сигнальному пути Hh in vivo1,2,3,4. В GCP первичная ресничка действует как ключевой сигнальный узел трансдукции ^Hh5, который управляет пролиферацией клеток-предшественников6,7,8. Визуализация in vitro сигнальных компонентов H....

Protocol

Все процедуры, связанные с животными, были выполнены в соответствии с руководящими принципами обращения с животными и протоколом, утвержденным Департаментом здравоохранения Гонконга. Лицензии на эксперименты на животных в соответствии с Постановлением о контроле за экспериментами на животных (глава 340) были получены от Министерства здравоохранения правительства Гонконга. Работа с животными проводилась в соответствии с этикой безопасности животных, утвержденной Исследовательским офисом HKBU и Комитетом по безопасности лабораторий. Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации обо всех материалах, используемых в этом протоколе.

....

Results

Используя Opti-MEM (см. Таблицу материалов) в качестве универсального реагента, эта предлагаемая методология электропорации может достичь стабильно высокой эффективности электропорации при ~80-90% (рисунок 1). Эффективность электропорации вектора Smo-EGFP определяли при DIV 2 после электропорации путем количественной оценки процента зеленых флуоресцентно-положительных клеток во всех парных бокс-белках-6 (Pax6)-экспрессирующих GCP-клетках. Эффективность электропорации групп, .......

Discussion

Трансфекция трансгенов в первичной культуре GCP методом электропорации обычно связана с низкой жизнеспособностью клеток и плохой эффективностью трансфекции9,10. В настоящем документе представлен экономически эффективный и воспроизводимый протокол электропорации, который продемонстрировал высокую эффективность и жизнеспособность. Кроме того, мы также демонстрируем простой метод изучения первичного ресничковозависимого сигнального пути Hh в первичных клетках GCP.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GCP Culture
B27 добавка	Life Technologies LTD	17504044
Клеточный фильтр, 70 &; m	Corning	352350
DNase I из поджелудочной железы крупного рогатого скота	Roche	11284932001
Earle' s Сбалансированный солевой раствор	Gibco, Life Technologies	14155063
FBS, сертифицированный	Thermo Scientific	SH30028.02
GlutamMAXTM-I, 100x	Gibco, Life Technologies	35050061	заменитель L-глутамина
L-цистеин	Sigma Aldrich	C7352
Matrigel	BD Biosciences	354277	Матрица базальной мембраны
Neurobasal	Gibco, Life Technologies	21103049
Papain, суспензия	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
поли-D-лизина гидробромид	Sigma Aldrich	P6407
SAG	Cayman Chemical	11914-1	Разглаженный агонист
<сильно>IF окрашивание
Бычий сывороточный альбумин	Sigma Aldrich	A7906
Параформальдегид	Sigma Aldrich	P6148
Triton X-100 Sigma	Aldrich	X100
Первичная смесь антител
Anti-GFP-goat ab	Rockland	600-101-215	Фактор разведения: 1 : 1000
Anti-Arl13b мышиный моноклональный ab	NeuroMab	75-287	Фактор разведения: 1 : 1000
Anti-Pax6 кролик поликлональный ab	Covance	PRB-278P	Коэффициент разведения: 1 : 1000
<сильный>Смесь вторичных антител
Alexa Fluor 488 ослик антикозий IgG	Invitrogen	A-11055	Фактор разведения: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 осёл против мышей IgG	Invitrogen	A-31570	Коэффициент разведения: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 осёл против кролика IgG	Invitrogen	A-31573	Коэффициент разведения: 1 : 1000
DAPI	Thermo Scientific	62247	Коэффициент разбавления: 1 : 1000
<сильный>Электропорация
CU 500 кюветная камера	Nepagene	CU500
EPA Электропорационная кювета (зазор 2 мм)	Nepagene	EC-002
Opti-MEM	Life Technologies LTD	31985070	среда с пониженным содержанием сыворотки для трансфекции
pEGFP-mSmo	Addgene	25395
Супер Электропоратор NEPA21 ТИП II In vitro и in vivo Электропорация	Nepagene	NEPA21